γδT细胞的NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用

摘要

本发明提供了γδT细胞NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用，属于疾病的诊断和预后评估技术领域。本发明通过对分析AML患者外周血γδT细胞功能亚群中免疫效应分子NKG2D和抑制性分子VSTM3的表达情况，探讨治疗后AML临床疗效及状态的实验室指标，本发明是基于目前存在的问题而提出的新的解决方案，具有较好的创新性和科学研究意义。

说明书

技术领域

本发明属于疾病的诊断和预后评估技术领域，具体涉及γδT细胞NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用。

背景技术

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，具有高度异质性，是成人中最为常见的白血病类型。目前AML的治疗主要包括诱导缓解治疗和缓解后巩固治疗。诱导缓解治疗主要使用(1)阿糖胞苷联合蒽环类药物；(2)含中大剂量Ara-C的诱导治疗方案；(3)三尖杉酯碱联合标准剂量Ara-C+蒽环类药物方案对AML患者进行治疗，使其获得完全缓解(complete remission，CR)；缓解后巩固治疗的目的是清除体内的微小残留病灶)以及预防疾病的复发，主要包括化学药物治疗和造血干细胞移植。在过去几十年里，随着治疗手段不断改进，AML患者的长期无病生存率和完全缓解率有了很大提高，但对于老年AML患者和部分无移植条件的年轻患者，特别是其伴有不良染色体或基因异常改变，常面临着无法耐受化疗药物及化疗诱导缓解后复发率较高等问题。对于这类患者，新的治疗方案如T细胞过继性免疫治疗有望延长患者的生存时间，具有良好的应用前景。

gamma delta T细胞(γδT)亚群的异质性决定了其功能的多样性。表明激活的γδT细胞可以通过多种效应机制针对肿瘤细胞发挥杀伤作用，可通过NKG2D(natural killergroup 2 member D，NKG2D)信号通路发挥细胞毒作用，介导肿瘤细胞溶解。NKG2D属于NKG2家族的II型跨膜蛋白，以链间二硫键的同源二聚体形式表达，是在所有NK细胞、γδT细胞和CD8

肿瘤发生发展过程中，由于肿瘤抗原的持续刺激，T细胞常表现为耗竭表型，主要表现为细胞表面抑制性受体表达增加，细胞因子及免疫调节细胞数量改变，从而引起肿瘤免疫逃逸。此外，耗竭性T细胞常同时伴有T细胞趋化、粘附、迁移的相关基因表达改变，转录因子表达谱的改变及代谢功能缺陷等特征。耗竭性T细胞功能丢失是一个逐渐发展的过程，随着耗竭严重程度的增加，T细胞表面抑制性受体的数量和种类增多。VSTM3是近年来新发现的一个免疫抑制分子，其在T细胞表面的高表达可抑制T细胞发挥免疫功能。VSTM3基因位于人类第16号染色体，VSTM3蛋白结构由3部分组成，即位于细胞外的胞外IgV结构域、I型跨膜蛋白构成的胞膜跨膜区，以及细胞内由ITIM和免疫球蛋白酪氨酸尾(immunoglobulintyrosine tail,ITT)样基序构成的胞内信号区。VSTM3是主要表达于大部分T细胞和NK细胞的I型跨膜蛋白，可通过下调T细胞受体α链的表达，降低T细胞内部信号转导幅度，间接抑制T细胞的活化。

白血病患者体内存在着一定程度的T细胞免疫功能缺陷，如何充分发挥γδT细胞的抗肿瘤免疫效应，是获得有效的抗AML的γδT细胞过继性免疫治疗策略的关键。目前，尚无关于AML患者外周血γδT细胞功能亚群中免疫效应分子NKG2D和抑制性分子VSTM3的表达情况与AML发病和治疗后AML临床疗效及状态有直接关联的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供γδT细胞NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用，对AML发病的诊断以及治疗后AML临床疗效及状态的判断和临床治疗方案的调整具有重要意义。

本发明提供了γδT细胞的NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用。

优选的，所述检测急性髓性白血病标志物包括急性髓性白血病发病标志物和/或急性髓性白血病预后评估标志物。

优选的，所述急性髓性白血病发病标志物为γδT细胞中NKG2D

优选的，所述急性髓性白血病预后评估标志物为γδT细胞中NKG2D

本发明提供了检测NKG2D

优选的，所述急性髓性白血病患者预后效果评估的方法为当所述NKG2D

本发明提供了检测NKG2D

优选的，所述急性髓性白血病诊断的方法为当所述NKG2D

优选的，所述检测的方法包括流式细胞术。

优选的，所述试剂包括BV510-NKG2D流式抗体和BV421-VSTM3流式抗体。

本发明提供了γδT细胞的NKG2D/VSTM3表达作为检测急性髓性白血病标志物中的应用。本发明首次实验证明AML患者外周血中新型的γδT细胞亚群中细胞表面因子表达情况与AML患者的发病与预后效果有关相关。当患者接受治疗后NKG2D

附图说明

图1为不同临床状态AML患者外周血γδT细胞功能亚群分布情况分析图；

图2为免疫效应分子NKG2D及NKG2D/VSTM3在AML患者外周血γδT细胞亚群中的表达情况分析图；

图3为AML患者治疗获得缓解后外周血γδT细胞动态变化结果图。

具体实施方式

本发明提供了γδT细胞NKG2D/VSTM3作为检测急性髓性白血病标志物中的应用。

在本发明中，所述检测急性髓性白血病标志物优选包括急性髓性白血病发病标志物和或急性髓性白血病预后评估标志物。所述急性髓性白血病发病标志物优选为γδT细胞中NKG2D

在本发明中，还分析了治疗前后外周血中γδT细胞NKG2D/VSTM3比例的变化情况，结果表明初发未治AML组外周血NKG2D

本发明提供了检测NKG2D

在本发明中，所述急性髓性白血病患者预后效果评估的方法优选为当所述NKG2D

本发明提供了检测NKG2D

在本发明中，所述急性髓性白血病诊断的方法优选为当所述NKG2D

在本发明中，所述检测的方法优选包括流式细胞术。所述流失细胞术分离目标分子阳性的γδT细胞亚群的方法优选采用目标分子相应抗体实现检测。所述试剂优选包括BV510-NKG2D流式抗体和BV421-VSTM3流式抗体。在本发明实施例中，BV510-NKG2D流式抗体和BV421-VSTM3流式抗体均购自Biolegend公司。

下面结合实施例对本发明提供的γδT细胞的NKG2D/VSTM3表达作为检测急性髓性白血病标志物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中涉及的抗体的来源见表1。

表1免疫荧光染色抗体

实施例1

γδT细胞中分子标志物的筛选方法

一、实验方法

1.在与患者签署知情同意书的前提下采血，所有标本取自于清晨空腹静脉血肝素抗凝。收集AML初发(de novo)27例，复发患者7例，及缓解患者12例外周血样本。同时收集健康成人样本21例。该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集AML患者临床疗效等临床资料(如表2所示)。

其中，AML临床诊断标准参考如下：

AML初发的诊断标准：参照WHO 2016造血和淋巴组织肿瘤分类标准，外周血或骨髓原始细胞≥20％是诊断AML的必要条件。但当患者被证实有克隆性重现性细胞遗传学异常t(8；21)(q22；q22)、inv(16)(p13q22)或t(16；16)(p13；q22)以及t(15；17)(q22；q12)时，即使原始细胞<20％，也应诊断为AML。

AML完全缓解(CR)：①骨髓象：原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单或原淋+幼淋)小于或等于5％，红细胞及巨核细胞正常。②血象：男性血红蛋白大于或等于100g/L，女性及儿童血红蛋白大于或等于90g/L，中性粒细胞绝对值大于或等于1.5×10

AML未缓解(NR)：骨髓象、血象及临床3项均未达上述标准者。

复发的诊断标准：CR后外周血再次出现白血病细胞或骨髓中原始细胞>0.050(除外巩固化疗后骨髓再生等其他原因)或髓外出现白血病细胞浸润。

2.流式细胞术检测γδT细胞功能亚群的表达情况

(1)将EDTA抗凝管内全血混匀后，取出100μL到干燥流式管中，每例样本需准备2个流式管，1个设为实验管，1管设为同型对照管。

(2)实验管中加入全染抗体预混液(每1×10

(3)孵育后每个样本流式管中加入2mL配制好的红细胞裂解工作液(1×)，充分混匀，于室温下避光裂解10min，取出后用胶头吸管轻轻吹打混匀，使底部的红细胞充分裂解，1400rpm转速下离心5min后弃去上清液，并用纱布抽吸底部剩余红细胞裂解液；

(4)向流式管中加入4mL 1×PBS重悬细胞，混匀后于1400rpm转速下再次离心5min；去上清后加入300μL 1×PBS制成单细胞悬液，使用流式分析仪(BD Verse,USA)进行流式检测。所得数据用FlowJo Software进行分析。

实验结果

1.初发及复发AML患者γδT细胞功能亚群分布情况

首先采用流式细胞术对22例初发未治AML，7例难治复发AML和21例健康成人样本外周血γδT细胞表达比例进行了检测，结果如图1所示。对比健康成人组，初发未治AML及难治复发AML组外周血总γδT细胞表达比例明显降低(初发未治AMLvs.健康成人，P＝0.002；难治复发AMLvs健康成人，P＝0.001)。

根据delta链的不同，传统上把人类外周血γδT细胞主要分为两个亚群：Vdelta1亚和Vdelta2亚群。进一步分析各组Vdelta1、Vdelta2及Vdelta1

2.免疫效应分子NKG2D及NKG2D/VSTM3联合在AML外周血γδT细胞亚群中的表达情况

进一步检测发现初发未治AML组免疫活化分子NKG2D在外周血γδT细胞的表达比例较健康成人组明显降低，结果如图2所示(NKG2D：初发未治AMLvs.健康成人，P＝0.000)，同时难治复发AML组NKG2D

进一步联合NKG2D和VSTM3重新划分γδT细胞亚群，分为NKG2D

3.初发未治AML组和健康成人γδT细胞各亚群相关性分析

采用Pearson分析初发未治AML组和健康成人组γδT细胞各亚群表达比例的相关性。结果显示，初发未治AML组的NKG2D

实施例2

γδT细胞亚群表达情况与AML临床疗效的相关性

为了进一步探讨γδT细胞中NKG2D/VSTM3表达情况与AML初发患者临床转归情况是否相关，收集了AML初发患者的临床相关资料，采用cox比例风险分析进行分析(表2和表3)。根据患者外周血中γδT细胞各亚群表达比例中位数比例将其分为高比例组和低比例组(中位数：11.05)。

结果见表2。高比例NKG2D

表2AML患者临床治疗预后影响的多因素Cox比例风险回归分析

表3AML患者临床资料

注：M0表示急性髓性白血病微分化型，M1表示急性粒细胞白血病未分化型，M2表示急性粒细胞白血病部分分化型，M3表示急性早幼粒细胞白血病，M4表示急性粒-单核细胞白细胞，M5表示急性单核细胞白血病。

实施例3

γδT细胞亚群在AML患者外周血随治疗前后出现动态变化

基于实施例1和2实验结果，为进一步明确AML患者治疗获得缓解后外周血γδT细胞及其亚群动态变化，收集了5例AML初发患者样本以及其经治疗后获得完全缓解后的5例外周血样本。按照实施例1记载的方法统计各组γδT细胞中NKG2D

5例AML患者治疗获得缓解后外周血γδT细胞动态变化，结果如图3所示，AML患者经治疗达CR后总γδT细胞及NKG2D

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。