经修饰的丝状真菌宿主细胞

摘要

本发明涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT，以及在所述细胞中产生分泌的目的多肽的方法，连同产生所述细胞的方法。

说明书

序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及经修饰的丝状真菌细胞，以及用于产生此类细胞的方法，连同产生其中分泌的目的多肽的方法。

背景技术

丝状真菌宿主细胞被广泛用于多种目的多肽的工业生产。大量的研究工作旨在改善丝状真菌宿主细胞中目的多肽的产生，特别是改善生产率和/或产率。

发明内容

本发明人发现，在产酶宿主细胞中修饰编码预测的推定的类固醇脱氢酶的基因可改善酶的生产率和/或产率。

因此，在第一方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。

可以通过本领域已知的任何合适的方法来修饰、截短、灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶，例如，通过用异源启动子(优选地，受调控的启动子)替代所述基因的天然启动子来减少编码基因的表达。降低推定的类固醇脱氢酶水平的另一种策略可以是向蛋白质中添加去稳定化结构域，例如泛素结构域，从而降低蛋白质的半衰期。灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或完全消除该天然推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式是共表达或添加一种或多种类固醇脱氢酶抑制剂。完全消除表达的便利方式的实例是基因缺失、基因替代或基因中断，例如通过在编码序列中引入无义突变。修饰编码序列的另一种方式可以是通过缺失一些编码序列或通过突变编码序列来干扰内含子加工而引入内部缺失。灭活推定的类固醇脱氢酶的又另一种方式可以是使用RNA干扰或siRNA或者通过插入含有启动子并且可能缺乏终止子的构建体来沉默其表达，该构建体的转录方向朝向编码推定的类固醇脱氢酶的基因的末端，导致编码推定的类固醇脱氢酶的基因的转录受到空间位阻(由于RNA聚合酶发生碰撞)或可能的mRNA去稳定化(由于形成具有互补序列的mRNA分子)。

因此，在第二方面，本发明涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺序的以下步骤：

a)用编码分泌的目的多肽的多核苷酸构建体转化丝状真菌宿主细胞；以及

b)突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该天然推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。

本发明的最后一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在有利于产生该分泌的多肽的条件下培养如任一项前述权利要求所述的突变的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地

b)回收该分泌的目的多肽。

附图说明

图1示出了pNJOC577的质粒图。

图2示出了pNJOC383的质粒图。

图3示出了在SEQ ID NO:3、6、9和12中鉴别的四种推定的类固醇脱氢酶的多重比对。相同的残基以黑色框表示。在四种蛋白质的三种中保守的残基以灰色框表示。使用MUSCLE算法版本3.8.31和默认参数来比对蛋白质(Edgar,R.C.(2004).Nucleic AcidsResearch[核酸研究],32(5),1792-1797)。

图4示出了pNJOC569的质粒图。

图5示出了菌株NJOC587(对照)和NJOC618-81D(类固醇脱氢酶突变体)的相对溶菌酶生产率/产率(LSU(F)/ml)。将发酵结束时对照的LSU(F)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。

图6示出了pTmmD-Tl_脂肪酶的质粒图。

图7示出了菌株NJOC600-2A(对照)和NJOC609-1A(类固醇脱氢酶突变体)的相对脂肪酶生产率/产率(LU(LXP)/ml)。将发酵结束时对照的LU(LXP)/ml数据用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。

图8示出了pSMai326的质粒图。

图9示出了菌株NJOC608-1B(对照)和NJOC617-77C(类固醇脱氢酶突变体)的相对黄原胶酶生产率/产率。将发酵结束时对照的黄原胶酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。

图10示出了pTmmD-Mf_溶菌酶的质粒图。

图11示出了菌株NJOC601-5A(对照)和NJOC610-2B(类固醇脱氢酶突变体)的相对M.f.溶菌酶生产率/产率(LSU(A)/ml)。将发酵结束时对照的溶菌酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。

图12示出了pIHAR473的质粒图。

图13示出了pAT3631的质粒图。

图14示出了菌株AT3091(对照)和AT3944(类固醇脱氢酶突变体)的相对植酸酶生产率/产率。将发酵结束时对照的植酸酶产率用于归一化数据。在图中，逗号被用作小数点分隔符，而非传统的小数点。

定义

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

具体实施方式

宿主细胞

本发明涉及重组宿主细胞，该宿主细胞包含与一种或多种控制序列可操作地连接的本发明的多核苷酸，该控制序列指导异源目的多肽的产生和分泌。

将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。

本发明的真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。

在一个方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的突变的丝状真菌宿主细胞，其中天然推定的类固醇脱氢酶被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除，并且其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。

在本发明各方面的优选实施例中，该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

优选地，该分泌的目的多肽是天然的或异源的；优选地，该分泌的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

在本发明的优选实施例中，该天然推定的类固醇脱氢酶包含与SEQ ID NO:3、SEQID NO:6、SEQ ID NO:9、和/或SEQ ID NO:12所示的成熟氨基酸序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、和/或SEQ ID NO:12所示的成熟氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成。

优选地，该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、和/或SEQ ID NO:10所示的基因组DNA序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、和/或SEQ ID NO:10所示的基因组DNA序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。

可替代地，该天然推定的类固醇脱氢酶由如下基因编码，该基因包含与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、和/或SEQ ID NO:11所示的cDNA序列具有至少60％同一性；优选地，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％同一性，或最优选地，与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、和/或SEQ ID NO:11所示的cDNA序列具有至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。

在优选实施例中，该天然推定的类固醇脱氢酶通过编码基因的无义或移码突变，通过编码基因的部分或完全缺失，或通过编码基因的沉默被修饰、截短、部分或完全灭活、与非突变的亲本细胞相比以降低的水平存在或被消除。

在第二方面，本发明涉及产生突变的丝状真菌宿主细胞的方法，与非突变的亲本宿主细胞相比，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的目的多肽的改善的产率，所述方法包括无特定顺序的以下步骤：

a)用编码分泌的目的多肽的多核苷酸构建体转化丝状真菌宿主细胞；以及

b)突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活天然推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该天然推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)、米曲霉中性α-淀粉酶(例如，amyB)、米曲霉酸稳定性α-淀粉酶(asaA)、米曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶(alpA)、米曲霉磷酸丙糖异构酶(tpiA)、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自米曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加基因的表达。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉中性淀粉酶、米曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用米曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

确保位点特异性基因组整合的另一种有效方式是使用FRT位点，例如FRT-F和FRT-F3，将这些FRT位点插入每个基因组基因座处，以使用酿酒酵母翻转酶(FLP)和FRT翻转酶识别序列对表达盒进行位点特异性靶向整合，如描述于WO 2012/160093和US 2018/0037897中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

去除或减少活性

本发明还涉及包含如下步骤的方法：突变宿主细胞以修饰、截短、部分或完全灭活推定的类固醇脱氢酶、降低其水平或消除该推定的类固醇脱氢酶，其中所述天然推定的类固醇脱氢酶包含选自以下的至少一个保守氨基酸基序：YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT；优选地，至少两个保守基序；更优选地，至少三个或四个保守基序；最优选地，所述天然推定的类固醇脱氢酶包含所有五个保守基序。

可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸或其同源物的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替代、或缺失。在优选方面，多核苷酸的表达被改变、减少或消除。例如，待改变、减少或消除的多核苷酸可以在活性必需的编码区或其一部分中或者在编码区的表达所需的调节元件中被突变或修饰。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活因子。

该多核苷酸的修饰或灭活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过对DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，诱变一般是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。

该多核苷酸或其同源物的修饰或灭活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或可读框的变化或内含子加工。此类修饰或灭活可以根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选的是如下所示例地在体外进行修饰。

以下描述了用于缺失或破坏靶向基因的方法，例如：Miller等人(1985.Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:1714-1721)；WO 90/00192；May,G.(1992.Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi.[丝状真菌的应用分子遗传学]J.R.Kinghorn和G.Turner,编著,Blackie Academic and Professional[布莱基学术和专业],第1-25页)；以及Turner,G.(1994.Vectors for Genetic Manipulation.[用于基因操作的载体]S.D.Martinelli和J.R.Kinghorn,编著,Elsevier[爱思唯尔],第641-665页)。

消除或减少多核苷酸的表达的便利方式的实例是基于基因替代、基因缺失、基因编辑或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将与内源多核苷酸对应的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列替代内源多核苷酸。可能希望的是，缺陷多核苷酸还编码可用于选择其中的多核苷酸已被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用选择性标记如本文所述的那些来破坏多核苷酸。

本发明还涉及抑制具有活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含多核苷酸或其同源物的子序列。在优选方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

该dsRNA优选地是小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在优选方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。

本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入细胞并且导致相似的或一致的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被称为RNA干扰(RNAi)的过程所降解；参见例如美国专利号5,190,931。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能丧失性突变。用于制备并使用dsRNA分子来选择性地降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824和6,515,109。

这些蛋白酶缺陷型突变体细胞作为用于异源分泌的多肽的表达的宿主细胞尤其有用。

用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

产生方法

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

本发明的一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在有利于产生该分泌的多肽的条件下培养如任一项前述权利要求所述的突变的丝状真菌宿主细胞；以及，任选地

b)回收该分泌的目的多肽。

在优选实施例中，该丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地，棘孢曲霉、aculetinus曲霉、泡盛曲霉、巴西曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、琉球曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉。

优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

实例

丝状真菌菌株

里氏木霉BTR213描述于WO 2013/086633中。

里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1是一种ku70被破坏且副胞菌素合成酶(parS)缺失的里氏木霉BTR213菌株。该菌株中缺失了纤维二糖水解酶I(cbh1)、纤维二糖水解酶II(cbh2)、内切葡聚糖酶I(eg1)和木聚糖酶II(xyn2)基因，并且具有FRT位点(FRT-F和FRT-F3)，将这些FRT位点插入这四个基因座的每个处，以使用酿酒酵母翻转酶(FLP)和FRT翻转酶识别序列FRT-F和FRT-F3对表达盒进行位点特异性靶向整合，如描述于WO 2012/160093和US 2018/0037897中。该菌株中还缺失了内切葡聚糖酶II(eg2)和内切葡聚糖酶III基因(eg3)。在四个基因座的每个处的FRT-F和FRT-F3位点之间插入黑曲霉胞嘧啶脱氨酶(fcyA)基因，以用作5-氟胞嘧啶(5-FC)的反选择。

培养基和溶液

COVE板由以下构成：342.30g蔗糖、25g Difco

COVE2板由以下构成：30g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、25g Difco

含有5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.))的COVE2葡萄糖板由以下构成：20ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、25g Difco

COVE盐溶液由以下构成：26g KCl、26g MgSO

COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g Na

发酵分批培养基(Fermentation batch medium)由以下构成：24g右旋糖、40g大豆粉、8g(NH

PDA板由39g Difco

PDA +1M蔗糖板由以下构成：39g Difco

PEG缓冲液由去离子水中的50％聚乙二醇(PEG)4000、10mM Tris-HCl(pH 7.5)和10mM CaCl

样品缓冲液(pH 7.5)由0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl和0.01％Triton X-100构成。将溶液过滤灭菌。摇瓶培养基由以下构成：20g甘油、10g大豆粉、1.5g(NH

1.2M山梨醇由218.4g山梨醇和补足至1升的去离子水构成。通过高压灭菌来为溶液灭菌。

STC由去离子水中的1M山梨醇、10mM Tris-HCl(pH 7.5)和50mM CaCl

TBE缓冲液由以下构成：10.8g Tris碱、5g硼酸、4ml 0.5M EDTA(pH8)、以及补足至1升的去离子水。

TE缓冲液由1M Tris-HCl(pH 8.0)和0.5M EDTA(pH 8.0)构成。

痕量金属溶液由以下构成：26.1g FeSO

含有1.5μM 5-氟-2’-脱氧尿苷(FdU)的木霉属基本培养基(TrMM)板由以下构成：20ml COVE盐溶液、0.6g CaCl

2xYT+Amp板由以下构成：16g Bacto

YP培养基由去离子水中的1％Bacto

YPD培养基由1％Bacto

发酵补料培养基由1190g葡萄糖、14.2ml 85％H3PO4和486g H

实例1：从里氏木霉提取的基因组DNA

使里氏木霉在250ml带挡板的摇瓶中的50ml YPD培养基中在28℃下伴随200rpm搅拌生长2天。使用衬有

实例2：里氏木霉原生质体的产生与转化

使用与Penttila等人,1987,Gene[基因]61:155-164类似的方案进行里氏木霉的原生质体制备与转化。简而言之，将里氏木霉在各自含有25ml YPD培养基的两个摇瓶中在27℃下伴随90rpm的轻轻搅拌培养17小时。将菌丝体通过使用真空驱动一次性过滤系统(密理博公司(Millipore))过滤来收集，并且用去离子水洗涤两次并用1.2M山梨醇洗涤两次。通过在34℃下伴随75-90rpm的轻轻振荡使洗涤的菌丝体悬浮于30ml含有5mg/ml的Yatalase

将大约1-10μg的DNA添加至100μl的原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。对于含有潮霉素B抗性标记(hph)的DNA，将内容物铺板在PDA+1M蔗糖板上，并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由PDA+潮霉素B组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素B，并且将板在30℃下孵育5-7天。

实例3：用于修饰编码推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因(SEQ ID NO:1)的质粒(pNJOC577；SEQ ID NO:13)的构建

通过使用

oNJ587(SEQ ID NO:19)+oNJ605(SEQ ID NO:20)、

oNJ610(SEQ ID NO:25)+oNJ611(SEQ ID NO:26)、

oNJ606(SEQ ID NO:21)+oNJ607(SEQ ID NO:22)、以及

oNJ608(SEQ ID NO:23)+oNJ609(SEQ ID NO:24)。

使用

实例4：由TrA1331W编码的蛋白质修饰的里氏木霉菌株(NJOC586)的构建

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将来自pNJOC577的大约2-4μg线性化TrA1331W修饰盒(8871bp PmeI片段)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在PDA+1M蔗糖板上并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由PDA+潮霉素B组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素B，并且将板在30℃下孵育5-7天。接下来，将潮霉素抗性转化体转移至PDA板上并在30℃下孵育5-7天。通过孢子PCR筛选转化体以正确整合TrA1331修饰盒。对于每个转化体，用1μl无菌接种环收集孢子，并且将其悬浮于薄壁PCR管中的20μl稀释缓冲液(PHIRE

实例5：用pNJOC383转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的pNJOC383(质粒，其含有嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)CBS114.92溶菌酶表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:14和图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例6：用pNJOC383转化里氏木霉TrA1331W改良菌株(NJOC586)

如实例2所述产生里氏木霉NJOC586原生质体。将大约1-10μg的pNJOC383(SEQ IDNO:14；图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例7：溶菌酶活性测定(LSU(F)/ml)

将来自发酵的全培养液在30℃下在旋转混合器(rotisserie mixer)中混合约2小时。在全培养液混合后，将所有样品在预稀释缓冲液中稀释100倍，然后使用旋转混合器再次混合约2小时。接下来，将100倍预稀释样品在0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.01％TritonX-100缓冲液pH 7.5(样品缓冲液)中通过10倍系列稀释而稀释10000倍，随后是3倍系列稀释直至稀释样品的1/9。该方法与贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的Biomek FX和来自分子仪器公司(Molecular Devices)的SpectraMax板读数仪联合使用。在样品缓冲液中，以0.05LSU(F)/ml浓度稀释溶菌酶标准品，并以0.002LSU(F)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共50μl转移至96孔平底板中。向各孔中添加50μl的25ug/ml荧光素缀合的细胞壁底物溶液，然后在环境温度下孵育45分钟。孵育期间，以15分钟的间隔监测96孔板在485nm(激发)/528nm(发射)处的反应速率。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。

实例8：实验室规模发酵表明，由TrA1331W编码的蛋白质的修饰导致溶菌酶生产率/产率的增加

在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株NJOC587和NJOC588。使各菌株在30℃在两个PDA板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。

使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司(Applikon Biotechnology))。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon 1030控制系统将pH控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至14g/L/小时的速率给予大约7天的时间段。在第5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性测定。

如实例7中所述测定溶菌酶表达水平。与NJOC587相比，在NJOC588菌株中观察到溶菌酶表达增加，表明所述编码天然推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的修饰有利于溶菌酶表达。

实例9：TrA1331W编码蛋白质(SEQ ID NO:3)的同源物的鉴别

使用由TrA1331W编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)进行由黑曲霉、米曲霉和镶片镰孢基因组中的基因编码的蛋白质的同源物的BLAST搜索(E值：1.00e-5，字号：5)。获得了每种生物体的单个BLAST命中，并在表1中呈现：

表1.在黑曲霉、米曲霉和镶片镰孢中鉴别的由TrA1331W编码的蛋白质的同源物。

使用如上所述的尼德曼-翁施算法计算不同蛋白质之间的同一性百分比。两种蛋白质之间的同一性总结于表2中。

表2.氨基酸％-同一性矩阵。将同一性表示为使用如本文别处描述的尼德曼-翁施算法计算的同一性百分比。

根据表2，这些蛋白质具有显著的序列同一性，范围从大约39％至70％同一性(在更密切相关的黑曲霉和米曲霉蛋白质之间并未意外观察到最高同一性百分比)。

为了进一步研究蛋白质之间的相关性，使用MUSCLE算法版本3.8.31和默认参数来比对蛋白质(Edgar,R.C.(2004).Nucleic Acids Research[核酸研究],32(5),1792-1797)。这一多重序列比对的结果示于图3中。如图3所示，这些蛋白质具有显著的氨基酸序列同一性，其中示出了高度保守氨基酸基序的几个延伸/区块，例如YGAR和/或VPHS[W/Y]F和/或QC[A/V/S]RRL和/或LKKYTLP和/或CPHYT基序。总之，结果表明推定的酶可能在不同真菌宿主中发挥相似的功能。

实例10：用于缺失编码推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因(SEQ ID NO:1)的质粒(pNJOC569；SEQ ID NO:27)的构建

通过使用

oNJ587(SEQ ID NO:19)+oNJ588(SEQ ID NO:28)、

oNJ595(SEQ ID NO:29)+oNJ596(SEQ ID NO:30)、

oNJ592(SEQ ID NO:31)+oNJ593(SEQ ID NO:32)、以及

oNJ589(SEQ ID NO:33)+oNJ590(SEQ ID NO:34)。

使用

实例11：缺失编码推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的里氏木霉菌株(NJOC584-5D8A)的构建

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将来自pNJOC569的大约2-4μg线性化TrA1331W缺失盒(7716bp PmeI片段)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在PDA+1M蔗糖板上并在30℃下孵育过夜。第二天，添加由PDA+潮霉素B组成的覆盖物至终浓度为10μg/ml潮霉素B，并且将板在30℃下孵育5-7天。接下来，将潮霉素抗性转化体转移至PDA板上并在30℃下孵育5-7天。通过孢子PCR筛选转化体以正确整合TrA1331缺失盒。对于每个转化体，用1μl无菌接种环收集孢子，并且将其悬浮于薄壁PCR管中的20μl稀释缓冲液(PHIRE

实例12：用pNJOC383转化里氏木霉菌株NJOC584-5D8A

如实例2所述产生里氏木霉NJOC584-5D8A原生质体。将大约1-10μg的pNJOC383(SEQ ID NO:14和图2)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例13：实验室规模发酵表明，由TrA1331W编码的蛋白质的缺失也导致溶菌酶生产率/产率的增加

在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株NJOC587(对照)和NJOC618-81D。使各菌株在30℃在两个PDA板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。

使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon 1030控制系统将pH控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至14g/L/小时的速率给予大约7天的时间段。在第5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性测定。

如实例7中所述测定溶菌酶表达水平。在所有测定时间点，与NJOC587(图5)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株NJOC618-81D中观察到溶菌酶表达增加。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的灭活有利于溶菌酶表达。

实例14：用pTmmD-Tl_脂肪酶转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的pTmmD-Tl_脂肪酶(疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)HL703脂肪酶变体表达盒，其侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:39和图6)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例15：用pTmmD-Tl_脂肪酶转化里氏木霉菌株NJOC586

如实例2所述产生里氏木霉NJOC586原生质体。将大约1-10μg的pTmmD-Tl_脂肪酶(疏棉状嗜热丝孢菌HL703脂肪酶变体表达盒，其侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:39和图6)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例16：脂肪酶LU(LXP)/ml活性测定

该方法与贝克曼库尔特公司的Biomek FX和来自分子仪器公司的SpectraMax板读数仪联合使用。

在0.05M MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、10mM CaCl2、0.01％Triton X-100缓冲液pH 7.5(样品缓冲液)中适当稀释培养物上清液，随后将稀释样品从0倍系列稀释至1/3倍至1/9倍。在样品缓冲液中，以4.0LU(LXP)/ml浓度稀释Lipex标准品，并以0.197LU(LXP)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共20μl转移至96孔平底板中。将200μl的pNP-棕榈酸酯底物溶液(pNPP储备液为9.99％EtOH中的7.8mM pNP-棕榈酸酯-工作溶液为：每升-500ml0.1M MOPS pH 7.5，20ml pNPP储备液，100ml 10％Triton X-100，14.7ml 680mM CaCl2，以及用H

实例17：实验室规模发酵表明，由TrA1331W编码的蛋白质的缺失也导致脂肪酶生产率/产率的增加

在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株NJOC600-2A(对照)和NJOC609-1A。使各菌株在30℃在两个PDA板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。

使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon 1030控制系统将pH控制在4.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/L/小时的速率给予大约五天的时间段。在第2、3、4和5天收集样品(上清液)，并在5℃下储存，直至对其进行处理用于脂肪酶活性测定。

如实例16中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与NJOC600-2A对照(图7)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株NJOC609-1A中观察到脂肪酶表达增加(改善范围为45％-132％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的灭活有利于脂肪酶表达。

实例18：用pSMai326转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的pSMai326(质粒，其含有类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)黄原胶酶变体表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:40和图8)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例19：用pSMai326转化里氏木霉菌株NJOC586

如实例2所述产生里氏木霉NJOC586原生质体。将大约1-10μg的pSMai326(质粒，其含有类芽孢杆菌属物种黄原胶酶变体表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:40和图8)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例20：黄原胶酶XGU(A)活性测定

在Thermo Arena 30分析仪上运行该方法。用0.1M ACES(N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸)、0.056M NaOH、4mM CaCl2 2H

实例21：实验室规模发酵表明，由TrA1331W编码的蛋白质的缺失也导致黄原胶酶生产率/产率的增加

在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株NJOC608-1B(对照)和NJOC617-77C。使各菌株在30℃在两个PDA板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。

使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon 1030控制系统将pH控制在4.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/L/小时的速率给予大约七天的时间段。在第2-7天收集样品(上清液)，并在5℃下储存，直至对其进行处理用于黄原胶酶活性测定。

如实例20中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与NJOC608-1B对照(图9)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株NJOC617-77C中观察到黄原胶酶表达增加(改善7％-28％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的灭活有利于黄原胶酶表达。

实例22：用pTmmD-Mf_溶菌酶转化里氏木霉菌株frt4new-1940-1996-2012-12-1

如实例2所述产生里氏木霉frt4new-1940-1996-2012-12-1原生质体。将大约1-10μg的pTmmD-Mf_溶菌酶(质粒，其含有弗格斯毁丝霉(Myceliophthora fergusii)溶菌酶表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:41和图10)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例23：用pTmmD-Mf_溶菌酶转化里氏木霉菌株NJOC586

如实例2所述产生里氏木霉NJOC586原生质体。将大约1-10μg的pTmmD-Mf_溶菌酶(质粒，其含有弗格斯毁丝霉溶菌酶表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点，用于在宿主菌株中含有FRT-F和FRT-F3位点的四个基因座处进行FLP介导的整合；SEQ ID NO:41和图10)添加至100μl原生质体溶液中，并且轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)，并且将反应混合并在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(1ml)，并且将内容物铺板在COVE板上进行amdS选择。将板在30℃下孵育7-9天。将来自每个COVE板的转化体的孢子转移至含有75μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)(西格玛化工有限公司)的COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。将来自含有5-FC的COVE2葡萄糖板上的转化体的孢子转移至含有5-FC的新COVE2葡萄糖板上，并在30℃下孵育5-7天。然后将几个转化体在PDA+1M蔗糖板上进行单孢子分离。将板在30℃下孵育3-5天。将来自单个菌落的孢子转移至COVE2板上，并且将板在30℃下孵育5-7天。为了确认来自pNJOC383的溶菌酶表达盒在cbh1、cbh2、eg1和xyn2基因座处的整合，如实例2所述制备几个单孢子分离株的基因组DNA，并将其用于创建配对末端测序文库，并在NEXTSEQ

实例24：溶菌酶LSU(A)活性测定

该方法与贝克曼库尔特公司的Biomek FX和来自分子仪器公司的SpectraMax板读数仪联合使用。在0.1M乙酸盐、50mM NaCl、0.01％Triton X-100缓冲液pH 4.5(样品缓冲液)中适当稀释全培养液样品，随后将稀释样品从0倍系列稀释至1/3倍至1/9倍。在样品缓冲液中，以50LSU(A)/ml浓度稀释溶菌酶标准品，并以2.469LSU(A)/ml浓度结束。将包括标准品的每个稀释的共20μl转移至96孔平底板中。向各孔中添加200μl 0.26g/L溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)底物溶液，然后在环境温度下孵育75分钟。孵育完成后，获得96孔板在450nm处的光密度。通过从生成的标准曲线外推来确定样品浓度。

实例25：实验室规模发酵表明，由TrA1331W编码的蛋白质的缺失也导致M.f.溶菌酶生产率/产率的增加

在2升发酵中评价了表达四拷贝溶菌酶的菌株NJOC601-5A(对照)和NJOC610-2B。使各菌株在30℃在两个PDA板上生长5-7天。将各自含有100ml摇瓶培养基的三个500ml摇瓶用来自PDA板的两个塞子/摇瓶接种。将摇瓶在28℃在定轨摇床上以200rpm孵育48小时。将这些培养物用作种子进行发酵。

使用共150ml的各种子培养物接种含有1.5升发酵分批培养基的3升玻璃夹套发酵罐(欧谱生物技术公司)。将发酵罐维持在28℃的温度下，并且使用Applikon 1030控制系统将pH控制在3.5+/-0.1的设定值。将空气以2.5L/min的速率添加至容器中，并且通过以300-1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。将由高压灭菌的葡萄糖和磷酸构成的发酵补料培养基以0至15g/L/小时的速率给予大约七天的时间段。在第4、5、6和7天取等份全培养液，并在5℃至10℃下储存，直至对其进行处理用于溶菌酶活性(LSU(A))测定。

如实例24中所述测定脂肪酶表达水平。在所有测定时间点，与NJOC601-5A对照(图11)相比，在类固醇脱氢酶缺失菌株NJOC610-2B中观察到M.f.溶菌酶表达增加(改善6％-47％)。结果表明，编码天然推定的类固醇脱氢酶的TrA1331W基因的灭活有利于M.f.溶菌酶表达。

实例(黑曲霉)

除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操作和转化：Sambrook等人(1989)Molecular cloning:A laboratory manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor lab.[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约州；Ausubel,F.M.等人(编辑)"Current protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]",John Wiley and Sons(约翰威立父子公司),1995；Harwood,C.R.,和Cutting,S.M.(编辑)"Molecular Biological Methods for Bacillus[用于芽孢杆菌的分子生物学方法]".John Wiley and Sons(约翰威立父子公司),1990。

使用大肠杆菌DH5α(东洋公司(Toyobo))用于质粒构建和扩增。使用QiagenPlasmid试剂盒(凯杰公司)来回收扩增的质粒。使用DNA连接试剂盒(宝生物公司(Takara))或T4 DNA连接酶(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim))来进行连接。使用扩展(Expand)TMPCR系统(宝灵曼公司)来进行聚合酶链式反应(PCR)。QIAquickTM凝胶提取试剂盒(凯杰公司)被用于纯化PCR片段并从琼脂糖凝胶中提取DNA片段。

用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可获得自新英格兰生物实验室公司)，并且根据制造商的说明书使用。

pBluescript II SK-(斯特拉塔吉恩(Stratagene)#212206)。

由构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Pgpd)和构巢曲霉色氨酸合酶终止子(TtrpC)驱使的包含构巢曲霉pyrG基因和单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的pHUda801(WO 2012/160093)的衍生物pHUda963描述于WO 2012/160093的实例4中。

包含嗜碱枝顶孢溶菌酶(Aa溶菌酶)基因的pJaL1470描述于WO2015144936A1中。

在WO 2012/160093的实例14中描述，表达宿主菌株黑曲霉C5553和M1816(C5553的pyrG-表型/尿苷营养缺陷型)由诺维信公司(Novozymes)分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。对C5553和M1816进行了基因修饰，以破坏淀粉糖苷酶活性的表达。

COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g NaB4O7·10H2O、0.4g CuSO4·5H2O、1.2gFeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H20、10g ZnSO4·7H2O、以及补足至1升的去离子水。

50X COVE盐溶液由以下构成：26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4、50ml COVE痕量金属溶液、以及补足至1升的去离子水。

COVE培养基由以下构成：342.3g蔗糖、20ml 50X COVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、10ml1.5M CsCl2、25g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。

COVE-N-Gly板由以下构成：218g山梨醇、10g甘油、2.02g KNO3、50ml COVE盐溶液、25g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。

COVE-N(tf)由以下构成：342.3g蔗糖、3g NaNO3、20ml COVE盐溶液、30g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。

COVE-N顶层琼脂糖由以下构成：342.3g蔗糖、3g NaNO3、20ml COVE盐溶液、10g低熔点琼脂糖、以及补足至1升的去离子水。

COVE-N由以下构成：30g蔗糖、3g NaNO3、20ml COVE盐溶液、30g纯净琼脂、以及补足至1升的去离子水。

STC缓冲液由以下构成：0.8M山梨醇、25mM Tris pH 8、以及25mM CaCl2。

STPC缓冲液由以下构成：在STC缓冲液中的40％PEG 4000。

LB培养基由以下构成：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、以及补足至1升的去离子水。

LB加氨比西林板由以下构成：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g细菌培养用琼脂、以100μg/ml的氨比西林、以及补足至1升的去离子水。

YPG培养基由以下构成：10g酵母提取物、20g细菌培养用蛋白胨、20g葡萄糖、以及补足至1升的去离子水。

SOC培养基由以下构成：20g胰蛋白胨、5g酵母提取物、0.5g NaCl、10ml 250mMKCl、以及补足至1升的去离子水。

TAE缓冲液由以下构成：4.84g Tris碱、1.14ml冰乙酸、2ml 0.5M EDTA pH 8.0、以及补足至1升的去离子水。

曲霉属物种的转化可以使用用于酵母转化的一般方法实现。以下描述了用于本发明的优选程序。

将黑曲霉宿主菌株接种至100ml的补充有10mM尿苷的YPG培养基上，并且在32℃以80rpm孵育16小时。将球粒进行收集并且用0.6M KCl洗涤，并且将其重新悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX

将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x10

3步循环：

1.预变性：94℃，2min。

2.变性：94℃，15sec。

3.退火：Tm-[5-10]℃*，30sec。

4.扩展：68℃，1min./kb

5.重复步骤#2-4，共进行35个循环。

按补料分批发酵进行发酵(H.Pedersen 2000,Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学与生物技术],53:272-277)。将所选择菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移到罐中用于酶产生的进一步培养。在pH 4.75下在34℃下培养8天，用葡萄糖和铵进行给料而不过度给予(其阻止酶产生)。使用培养液进行酶测定。

SEQ ID NO:4：黑曲霉类固醇脱氢酶基因组DNA序列

SEQ ID NO:5：黑曲霉类固醇脱氢酶编码序列(或cDNA)

SEQ ID NO:6：黑曲霉类固醇脱氢酶氨基酸序列

实例26：在黑曲霉中的类固醇脱氢酶基因的破坏

构建质粒pIhar473以包含黑曲霉类固醇脱氢酶基因的5’和3’侧翼区，这两个侧翼区通过与其终止子重复序列一起的作为选择性标记的构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)，和人单纯疱疹病毒1(HSV-1)胸苷激酶基因分离。该HSV-1胸苷激酶基因位于类固醇脱氢酶基因的3’侧翼区的3’端，允许没有正确地靶向类固醇脱氢酶基因座的黑曲霉转化体的反向选择。以如下所述的几个步骤构建质粒。

使用以下引物产生包含黑曲霉类固醇脱氢酶的3’侧翼区的PCR产物：

SEQ ID NO:42：引物IH1232-3'steD-F：

5'-aactctctcctctagaTTATGTAGCATGAGACCAGCGGGGA-3'

SEQ ID NO:43：引物IH1233-3'steD-R：

5'-acaggagaattcttaattaaAGTCCGGGGTGGGGAGTTTTCAGGC-3'

如材料与方法中所述，在由大约100ng的黑曲霉NN049184的基因组DNA构成的反应中通过PCR扩增所需片段。将反应在编程如下的

将质粒pHUda963用XbaI和PacI(新英格兰生物实验室公司)消化，并且通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中将8,153bp片段从该凝胶切离，并且使用

使用以下引物产生包含黑曲霉类固醇脱氢酶的5’侧翼区的PCR产物：

SEQ ID NO:44：引物IH1230-5'steD-F：

5'-gtggcggccgcgtttaaacATCCCTATTTTAAATACCGAGTATG-3'

SEQ ID NO:45：引物IH1231-5'steD-R：

5'-tcagtcacccggatccctaATGGTGGCAGTCGTGTTGGATGCCT-3'

如材料与方法中所述，在由大约100ng的黑曲霉NN049184的基因组DNA构成的反应中通过PCR扩增所需片段。将反应在编程如下的

将质粒pIhar473-3’steD用PmeI和BamHI(新英格兰生物实验室公司)消化，并且通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，其中将9,653bp片段从该凝胶切离，并且使用

通过在32℃下持续16小时，伴随80rpm的轻轻搅拌，在补充有10mM尿苷的100ml的YPG培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株M1816的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6MKCl洗涤，并且将其重新悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX

将大约4μg的pIhar473添加至1ml原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml的SPTC，并且将原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml的50℃COVE-N顶层琼脂糖之后，将混合物倾倒于COVE-N板上，并且将板于30℃孵育7天。用无菌牙签将这些生长转化体转移到补充有1.5uM 5-氟-2-脱氧尿苷(FdU)(杀死表达在pIhar473上存在的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的细胞的试剂)的Cove-N板上。将单孢子分离株转移至COVE-N-gly板上。

通过DNA印迹(Southern blot)分析来筛选包含用来破坏类固醇脱氢酶基因的pIhar473的黑曲霉菌株M1816的可能的转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的YPG培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有

进行DNA印迹分析，以确认类固醇脱氢酶基因座的破坏。用SpeI来消化来自每个转化体的5μg的基因组DNA。基因组DNA消化反应由以下构成：5μg基因组DNA、1μl SpeI、2μl10X NEB CutSmart缓冲液、以及补足至20μl的水。在37℃，将基因组DNA消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用TAE缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用

SEQ ID NO:47：引物IH1252-ste-proF：

5'-ATACTCTCCGTCAGCATCCTGCCAG-3'

SEQ ID NO:48：引物IH1253-ste-500R：

5'-CTGCTCCTTCGATCCATAAGGCAAC-3'

扩增反应(50μl)由以下构成：200μM PCR DIG标记混合物(罗氏应用科学部(RocheApplied Science)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州(CA)，美国)、0.5μM引物，通过KOD-Plus(东洋公司)，使用pIhar473作为模板，终体积为50μl。将扩增反应在编程如下的

实例27：474P2-1和474P2-5中Aa溶菌酶的表达

如WO 2012/160093中所述进行染色体插入至具有amdS选择性标记的Aa溶菌酶基因(WO 2015144936A1中描述的pJaL1470)的黑曲霉474P2-1和474P2-5中。通过flp重组酶将Aa溶菌酶表达质粒靶向至四个预先指定的基因座，它们是甘露糖基转移酶(alg2)、葡萄糖激酶(gukA)、酸稳定性淀粉酶(asaA)和多铜氧化酶(mcoH)。

还进行了染色体插入至Aa溶菌酶基因的参考类固醇脱氢酶-野生型黑曲霉C5553中。将生长良好的菌株进行纯化，并且对其进行DNA印迹分析以确认是否将Aa溶菌酶基因正确引入mcoH、gukA、asaA和alg2基因座处。以下用以制备非放射性探针的引物组被用来分析所选择的转化体。

对于启动子区：

SEQ ID NO:49：HTJP-324AAGGGATGCAAGACCAAACC

SEQ ID NO:50：HTJP-325TGAAGAATTTGTGTTGTCTGAG

将从所选择的转化体提取的基因组DNA通过SpeI消化，然后用启动子区进行探测。通过正确基因引入事件，如上所述探测观察通过SpeI和MluI消化的6.7kb(alg2)、2.9kb(mcoH)、6.7kb(gukA)和2.7kb(asaA)大小的杂交信号。

在mcoH、gukA、asaA和alg2基因座处给出4个拷贝基因的正确整合事件的菌株中，选择了一个具有来自各宿主(1470-474P2-1、1470-474P2-5、1470-C5553-13)的溶菌酶的菌株。

实例28：类固醇脱氢酶基因破坏对酶产生的影响。

来自474P2-1、474P2-5和C5553的一个菌株在实验室规模罐中发酵，并按照实例7中描述的材料与方法测定其酶活性(LSU(F)/ml活性)；结果示于下表中。类固醇脱氢酶被破坏的菌株显示出溶菌酶(LSU(F)/ml)活性比参考类固醇脱氢酶-玻璃发酵罐中的野生型菌株高约1.1倍(表3)。

表3.从每个宿主菌株中选择的三个菌株的平均LSU(F)活性，其中将来自1470-C5553-13的平均LSU(F)产率归一化为1.00。

实例(米曲霉)

菌株AT3091表达WO 2006037328 SEQ ID NO.:4中描述的布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)植酸酶。该菌株含有8个布氏柠檬酸杆菌植酸酶基因拷贝，已经使用WO 2012160093中描述的FLP整合系统将其作为串联反向重复序列插入到四个单独染色体上的四个特定基因座上。用于制备菌株AT3091的宿主源于WO 2018167153实例4中描述的JaL1903。

按补料分批发酵进行发酵(H.Pedersen 2000,Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学与生物技术],53:272-277)，其中将选择的菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移至罐中，用于进一步培养和酶产生。在34℃下进行培养持续8天。氨用于控制pH。在分批期阶段将pH保持在6，并且在补料浴(fed bath)中将pH保持在5.4。以麦芽糖浆进行补料。使用培养液进行酶测定。

如WO 2006037328实例4中所述进行植酸酶活性测量。

实例29-具有截短型类固醇脱氢酶基因的植酸酶表达菌株的构建和测试

为了制备由SEQ ID NO:7(基因组)和SEQ ID NO:8(cDNA)编码的米曲霉类固醇脱氢酶的截短型类固醇脱氢酶(SEQ ID NO:9)，以模拟里氏木霉类固醇脱氢酶突变体(NJOC586)，通过将密码子TAT突变为TAG，在氨基酸位置Y234处引入终止密码子。

为了引入终止密码子，如

用于突变的寡oAT3303处于反义方向，并具有以下序列(SEQ ID NO:51)：

TGCTGCGGAACAAGGGGTGGGAGGGAAGGGTGTACTTCTTGAGAGAG

将两个带下划线的核苷酸在PAM位点引入了突变，以防止被Mad7复合物进一步切割，而粗体的核苷酸将对应于Y234的密码子改变为终止密码子。

通过以下方式修饰pAT1153(WO19046703，实例25)来构建CRISPR-Mad7质粒pAT3631(图13，SEQ ID:52)：1)将cas9基因与mad7基因交换，2)将pyrG标记基因替换为bar基因(赋予对双丙氨磷的抗性)(Thompson等人1987,EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志],6:2519-2523)，以及3)将wA原型间隔子替换为靶向相应染色体序列的原型间隔子TCTCTCAAGAAGTACACCCTT(SEQ ID NO:53)，其在紧邻靶序列的上游具有PAM位点TTTC。

根据Christensen等人,1988,Biotechnology[生物技术]6:1419-1422进行AT3091的曲霉属转化。简言之，使米曲霉菌丝体在富营养培养液中生长。通过过滤从培养液中分离出菌丝体。将酶制剂

为了转化AT3091，将1μg的质粒pAT3631和100pmol的修复寡oAT3303添加至100μl原生质体悬浮液中，然后添加200μl PEG缓冲液。将混合物在室温下孵育20分钟。收获原生质体，用1.2M山梨醇洗涤两次，并重新悬浮于200μl 1.2M山梨醇中。当在含有1.0M蔗糖作为碳源和10mM尿素作为氮源以及100mg/l双丙氨膦的基本培养基琼脂板上选择转化体时，选择含有bar基因的转化体，因为其能够赋予对双丙氨膦的抗性(Cove,1966,Biochem.Biophys.Acta.[生物化学与生物物理学报]113:51-56)。在37℃下生长5-7天后，稳定的转化体看起来强力地生长并且使菌落形成孢子。通过非选择板上的分生孢子(即，不含双丙氨膦)纯化转化体一次，由此丢失CRISPR-mad7质粒。

为了验证预期的突变，在选择的转化体上用以下引物进行PCR：

oAT3163：CTAGCAGTCTCAATCGC(SEQ ID NO:54)

oAT3164：TTGACCGTGACAAAGAC(SEQ ID NO:55)

并且使用如用于PCR的引物对所得404bp PCR产物进行测序。选择一个具有引入的终止密码子的转化体AT3944进行实验室罐发酵。

如方法下所述进行AT3091和AT3944及植酸酶活性的发酵。从117.4小时直到发酵结束，AT3944的植酸酶活性提高了1.4％-6.9％(在182.7小时结束时提高了约3％，图14)。结果表明，天然推定的类固醇脱氢酶的灭活对米曲霉中植酸酶的表达具有积极影响。

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 经修饰的丝状真菌宿主细胞

<130> NZ 14838-WO-PCT

<160> 55

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(574)

<220>

<221> 内含子

<222> (575)..(651)

<220>

<221> 外显子

<222> (652)..(1037)

<400> 1

atg gat ggc ata tcg aat ctg ctg gcc atg ctc aac gtg agc gac ctg 48

Met Asp Gly Ile Ser Asn Leu Leu Ala Met Leu Asn Val Ser Asp Leu

1 5 10 15

acg ccg gca gaa tgg tgc caa atc ttc ttc gtc gcc aac gct ggc ttc 96

Thr Pro Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Phe Val Ala Asn Ala Gly Phe

20 25 30

atc ctg atg ctg caa gct ctc ccg gac gac atg cgt cgg gcg ttg atg 144

Ile Leu Met Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Met Arg Arg Ala Leu Met

35 40 45

gac tac ggc gcc aga aga gcc acg tcc cgc cag gct tcc gca aaa aag 192

Asp Tyr Gly Ala Arg Arg Ala Thr Ser Arg Gln Ala Ser Ala Lys Lys

50 55 60

ggt cag gcc gag gta ccc aag gaa ggc ttc ttc gac gtc ttg acg agc 240

Gly Gln Ala Glu Val Pro Lys Glu Gly Phe Phe Asp Val Leu Thr Ser

65 70 75 80

tat ggc cag gtg ccg cac tcg tgg ttc ata cac ttc tac atc acg tcc 288

Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Ile His Phe Tyr Ile Thr Ser

85 90 95

gtg tcg tgg tcc atc ttc tgg ggc tgg cag ttc gtg tcc aag gga tcg 336

Val Ser Trp Ser Ile Phe Trp Gly Trp Gln Phe Val Ser Lys Gly Ser

100 105 110

gtg atg cgg gcc ctg gcc gag agg cag cac aga gct gcg ggg aat gag 384

Val Met Arg Ala Leu Ala Glu Arg Gln His Arg Ala Ala Gly Asn Glu

115 120 125

cca tcg tcg gag gtc gag ctc aca gca acg ctg gtc gcg tgg ctc ttg 432

Pro Ser Ser Glu Val Glu Leu Thr Ala Thr Leu Val Ala Trp Leu Leu

130 135 140

atg agc tcg cag gga gcg aga aga ctg ttt gag tgt ctc ttt gtc acc 480

Met Ser Ser Gln Gly Ala Arg Arg Leu Phe Glu Cys Leu Phe Val Thr

145 150 155 160

aag cct ggg tca tcg ccc atg tgg ttt gtc cat tgg gtt ctc gga ttg 528

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Val His Trp Val Leu Gly Leu

165 170 175

gcc tat tac aca acc ctg ggg atc tct gtc tgg att caa ggc tca g 574

Ala Tyr Tyr Thr Thr Leu Gly Ile Ser Val Trp Ile Gln Gly Ser

180 185 190

gttcgtctca cacggctatt aacaaaagag tctagtttcg tggctgtctt ggtcgtgacg 634

ctgacgtgag ttcacag ga gca att ctt cgg tcg tgg gag tcc ccg cag 683

Gly Ala Ile Leu Arg Ser Trp Glu Ser Pro Gln

195 200

ccc atc cac ttc acg cca caa atc att atc ggg gcg gca gtc ttt gga 731

Pro Ile His Phe Thr Pro Gln Ile Ile Ile Gly Ala Ala Val Phe Gly

205 210 215

ttc gca ggc gcc cag caa aat gaa tgc cac agg tat ctg gca ggg ctc 779

Phe Ala Gly Ala Gln Gln Asn Glu Cys His Arg Tyr Leu Ala Gly Leu

220 225 230

aag aag tac acg ctc ccg agc gag ggc tgg ttc aag tac ttc gtc tgc 827

Lys Lys Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Phe Val Cys

235 240 245 250

ccc cac tac aca ttc gaa tgc ctc ctc tac ttg agc ctt gcc gtt gtt 875

Pro His Tyr Thr Phe Glu Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Leu Ala Val Val

255 260 265

gcg gcg ccg aca gga tgc tgg gtg aac gga tcc atc ctg tgc tca ttg 923

Ala Ala Pro Thr Gly Cys Trp Val Asn Gly Ser Ile Leu Cys Ser Leu

270 275 280

acg ttt gtc ctg gcc aat gtc ggc tca acg gca tac ggc acc aag att 971

Thr Phe Val Leu Ala Asn Val Gly Ser Thr Ala Tyr Gly Thr Lys Ile

285 290 295

tgg tat gcc gaa aag ttc ggg gcg gac aag gtg gag ggg aaa tgg atc 1019

Trp Tyr Ala Glu Lys Phe Gly Ala Asp Lys Val Glu Gly Lys Trp Ile

300 305 310

atg att ccc ttt gta ttc taa 1040

Met Ile Pro Phe Val Phe

315 320

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(960)

<400> 2

atg gat ggc ata tcg aat ctg ctg gcc atg ctc aac gtg agc gac ctg 48

Met Asp Gly Ile Ser Asn Leu Leu Ala Met Leu Asn Val Ser Asp Leu

1 5 10 15

acg ccg gca gaa tgg tgc caa atc ttc ttc gtc gcc aac gct ggc ttc 96

Thr Pro Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Phe Val Ala Asn Ala Gly Phe

20 25 30

atc ctg atg ctg caa gct ctc ccg gac gac atg cgt cgg gcg ttg atg 144

Ile Leu Met Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Met Arg Arg Ala Leu Met

35 40 45

gac tac ggc gcc aga aga gcc acg tcc cgc cag gct tcc gca aaa aag 192

Asp Tyr Gly Ala Arg Arg Ala Thr Ser Arg Gln Ala Ser Ala Lys Lys

50 55 60

ggt cag gcc gag gta ccc aag gaa ggc ttc ttc gac gtc ttg acg agc 240

Gly Gln Ala Glu Val Pro Lys Glu Gly Phe Phe Asp Val Leu Thr Ser

65 70 75 80

tat ggc cag gtg ccg cac tcg tgg ttc ata cac ttc tac atc acg tcc 288

Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Ile His Phe Tyr Ile Thr Ser

85 90 95

gtg tcg tgg tcc atc ttc tgg ggc tgg cag ttc gtg tcc aag gga tcg 336

Val Ser Trp Ser Ile Phe Trp Gly Trp Gln Phe Val Ser Lys Gly Ser

100 105 110

gtg atg cgg gcc ctg gcc gag agg cag cac aga gct gcg ggg aat gag 384

Val Met Arg Ala Leu Ala Glu Arg Gln His Arg Ala Ala Gly Asn Glu

115 120 125

cca tcg tcg gag gtc gag ctc aca gca acg ctg gtc gcg tgg ctc ttg 432

Pro Ser Ser Glu Val Glu Leu Thr Ala Thr Leu Val Ala Trp Leu Leu

130 135 140

atg agc tcg cag gga gcg aga aga ctg ttt gag tgt ctc ttt gtc acc 480

Met Ser Ser Gln Gly Ala Arg Arg Leu Phe Glu Cys Leu Phe Val Thr

145 150 155 160

aag cct ggg tca tcg ccc atg tgg ttt gtc cat tgg gtt ctc gga ttg 528

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Val His Trp Val Leu Gly Leu

165 170 175

gcc tat tac aca acc ctg ggg atc tct gtc tgg att caa ggc tca gga 576

Ala Tyr Tyr Thr Thr Leu Gly Ile Ser Val Trp Ile Gln Gly Ser Gly

180 185 190

gca att ctt cgg tcg tgg gag tcc ccg cag ccc atc cac ttc acg cca 624

Ala Ile Leu Arg Ser Trp Glu Ser Pro Gln Pro Ile His Phe Thr Pro

195 200 205

caa atc att atc ggg gcg gca gtc ttt gga ttc gca ggc gcc cag caa 672

Gln Ile Ile Ile Gly Ala Ala Val Phe Gly Phe Ala Gly Ala Gln Gln

210 215 220

aat gaa tgc cac agg tat ctg gca ggg ctc aag aag tac acg ctc ccg 720

Asn Glu Cys His Arg Tyr Leu Ala Gly Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro

225 230 235 240

agc gag ggc tgg ttc aag tac ttc gtc tgc ccc cac tac aca ttc gaa 768

Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Phe Val Cys Pro His Tyr Thr Phe Glu

245 250 255

tgc ctc ctc tac ttg agc ctt gcc gtt gtt gcg gcg ccg aca gga tgc 816

Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Thr Gly Cys

260 265 270

tgg gtg aac gga tcc atc ctg tgc tca ttg acg ttt gtc ctg gcc aat 864

Trp Val Asn Gly Ser Ile Leu Cys Ser Leu Thr Phe Val Leu Ala Asn

275 280 285

gtc ggc tca acg gca tac ggc acc aag att tgg tat gcc gaa aag ttc 912

Val Gly Ser Thr Ala Tyr Gly Thr Lys Ile Trp Tyr Ala Glu Lys Phe

290 295 300

ggg gcg gac aag gtg gag ggg aaa tgg atc atg att ccc ttt gta ttc 960

Gly Ala Asp Lys Val Glu Gly Lys Trp Ile Met Ile Pro Phe Val Phe

305 310 315 320

taa 963

<210> 3

<211> 320

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<400> 3

Met Asp Gly Ile Ser Asn Leu Leu Ala Met Leu Asn Val Ser Asp Leu

1 5 10 15

Thr Pro Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Phe Val Ala Asn Ala Gly Phe

20 25 30

Ile Leu Met Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Met Arg Arg Ala Leu Met

35 40 45

Asp Tyr Gly Ala Arg Arg Ala Thr Ser Arg Gln Ala Ser Ala Lys Lys

50 55 60

Gly Gln Ala Glu Val Pro Lys Glu Gly Phe Phe Asp Val Leu Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Ile His Phe Tyr Ile Thr Ser

85 90 95

Val Ser Trp Ser Ile Phe Trp Gly Trp Gln Phe Val Ser Lys Gly Ser

100 105 110

Val Met Arg Ala Leu Ala Glu Arg Gln His Arg Ala Ala Gly Asn Glu

115 120 125

Pro Ser Ser Glu Val Glu Leu Thr Ala Thr Leu Val Ala Trp Leu Leu

130 135 140

Met Ser Ser Gln Gly Ala Arg Arg Leu Phe Glu Cys Leu Phe Val Thr

145 150 155 160

Lys Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Val His Trp Val Leu Gly Leu

165 170 175

Ala Tyr Tyr Thr Thr Leu Gly Ile Ser Val Trp Ile Gln Gly Ser Gly

180 185 190

Ala Ile Leu Arg Ser Trp Glu Ser Pro Gln Pro Ile His Phe Thr Pro

195 200 205

Gln Ile Ile Ile Gly Ala Ala Val Phe Gly Phe Ala Gly Ala Gln Gln

210 215 220

Asn Glu Cys His Arg Tyr Leu Ala Gly Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro

225 230 235 240

Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Phe Val Cys Pro His Tyr Thr Phe Glu

245 250 255

Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Leu Ala Val Val Ala Ala Pro Thr Gly Cys

260 265 270

Trp Val Asn Gly Ser Ile Leu Cys Ser Leu Thr Phe Val Leu Ala Asn

275 280 285

Val Gly Ser Thr Ala Tyr Gly Thr Lys Ile Trp Tyr Ala Glu Lys Phe

290 295 300

Gly Ala Asp Lys Val Glu Gly Lys Trp Ile Met Ile Pro Phe Val Phe

305 310 315 320

<210> 4

<211> 1123

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(99)

<220>

<221> 内含子

<222> (100)..(189)

<220>

<221> 外显子

<222> (190)..(670)

<220>

<221> 内含子

<222> (671)..(722)

<220>

<221> 外显子

<222> (723)..(1120)

<400> 4

atg gag ctc ccc ttc agc ctg gtg gat aca gct ctt tcc tcc acg cac 48

Met Glu Leu Pro Phe Ser Leu Val Asp Thr Ala Leu Ser Ser Thr His

1 5 10 15

att gac gcc atc gac gcc ctt cga gcc ttt ttc ctt ttg gca tcc tgc 96

Ile Asp Ala Ile Asp Ala Leu Arg Ala Phe Phe Leu Leu Ala Ser Cys

20 25 30

acg gtatgcaccg atatgttgcc atcccaaatt cgaggcggac gacgttgcaa 149

Thr

agtgaccctg catcaactaa acccagaata tcccaactag ata ctc tcc gtc agc 204

Ile Leu Ser Val Ser

35

atc ctg cca gat tcg ctt cat tca cgc ttc att cct tat ggc gct cgt 252

Ile Leu Pro Asp Ser Leu His Ser Arg Phe Ile Pro Tyr Gly Ala Arg

40 45 50

aca act tcg acg gcc gac tcg cag tcc tcg cag tcc tcg ccc ccg gcg 300

Thr Thr Ser Thr Ala Asp Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Pro Pro Ala

55 60 65 70

tcc tcg gac tcc tcc cca gcc gcc cgc gct ctt gac tac gct gcc gcc 348

Ser Ser Asp Ser Ser Pro Ala Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Ala Ala Ala

75 80 85

ttg aca gtc cct cac agc tac ttc acg caa ttc tac att gcc tcc gtt 396

Leu Thr Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln Phe Tyr Ile Ala Ser Val

90 95 100

ttg gcc tcg gtc ttc tgg gct gcg cag ctt ctg tgt caa gga gcc gtg 444

Leu Ala Ser Val Phe Trp Ala Ala Gln Leu Leu Cys Gln Gly Ala Val

105 110 115

ttc cag gcc ttt gca acg aga atc agt ccg gaa cat atg caa cag tcc 492

Phe Gln Ala Phe Ala Thr Arg Ile Ser Pro Glu His Met Gln Gln Ser

120 125 130

atg tcc ata cac caa gtc ttc ttg tgc tgg gcg ctc atg ctc att cag 540

Met Ser Ile His Gln Val Phe Leu Cys Trp Ala Leu Met Leu Ile Gln

135 140 145 150

ggt gca agg cgg cta tat gag tgc aag gcc ttc gcc aag cct tca gcc 588

Gly Ala Arg Arg Leu Tyr Glu Cys Lys Ala Phe Ala Lys Pro Ser Ala

155 160 165

tca aga atg tgg ttt gtt cac tgg ctc gta ggc ctt gca ttt tac cta 636

Ser Arg Met Trp Phe Val His Trp Leu Val Gly Leu Ala Phe Tyr Leu

170 175 180

gca gta tcc gtt gcc tta tgg atc gaa gga gca g gtaccactct 680

Ala Val Ser Val Ala Leu Trp Ile Glu Gly Ala

185 190

gactgacagg ctaaaatacc gaaccccact gattgcatct ag ga gcc ctg ctg 733

Gly Ala Leu Leu

195

tct cat aaa gtg att ctc gac gac ctc aag gtt aca ata gca ccc tct 781

Ser His Lys Val Ile Leu Asp Asp Leu Lys Val Thr Ile Ala Pro Ser

200 205 210

ctc cgc acc ttt gtc tgc att cct ctt ttc ttg att gca tca ggc atc 829

Leu Arg Thr Phe Val Cys Ile Pro Leu Phe Leu Ile Ala Ser Gly Ile

215 220 225

caa cac gac tgc cac cat tac ctc ttc tct ttg aag aaa tat acc ctg 877

Gln His Asp Cys His His Tyr Leu Phe Ser Leu Lys Lys Tyr Thr Leu

230 235 240 245

ccc act cac ccc atc ttt cgc agg atc gta tgt cca cat tat acg gca 925

Pro Thr His Pro Ile Phe Arg Arg Ile Val Cys Pro His Tyr Thr Ala

250 255 260

gag tgt gtg ata tat ctt tcg ttg gct ctg ctg ggc gcg ccc aag ggc 973

Glu Cys Val Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Leu Gly Ala Pro Lys Gly

265 270 275

gag gtc gta aac aag tcg ttg ttg tcc gct ctc gta ttt gtt gtt atc 1021

Glu Val Val Asn Lys Ser Leu Leu Ser Ala Leu Val Phe Val Val Ile

280 285 290

aac ttg ggc gtc acc gct gcg aac act agg cat tgg tat atg cga aaa 1069

Asn Leu Gly Val Thr Ala Ala Asn Thr Arg His Trp Tyr Met Arg Lys

295 300 305

ttc ggc gag gag tct gtg cgg gaa aga tcg aac atg atc cct tgg gtt 1117

Phe Gly Glu Glu Ser Val Arg Glu Arg Ser Asn Met Ile Pro Trp Val

310 315 320 325

tac taa 1123

Tyr

<210> 5

<211> 981

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(978)

<400> 5

atg gag ctc ccc ttc agc ctg gtg gat aca gct ctt tcc tcc acg cac 48

Met Glu Leu Pro Phe Ser Leu Val Asp Thr Ala Leu Ser Ser Thr His

1 5 10 15

att gac gcc atc gac gcc ctt cga gcc ttt ttc ctt ttg gca tcc tgc 96

Ile Asp Ala Ile Asp Ala Leu Arg Ala Phe Phe Leu Leu Ala Ser Cys

20 25 30

acg ata ctc tcc gtc agc atc ctg cca gat tcg ctt cat tca cgc ttc 144

Thr Ile Leu Ser Val Ser Ile Leu Pro Asp Ser Leu His Ser Arg Phe

35 40 45

att cct tat ggc gct cgt aca act tcg acg gcc gac tcg cag tcc tcg 192

Ile Pro Tyr Gly Ala Arg Thr Thr Ser Thr Ala Asp Ser Gln Ser Ser

50 55 60

cag tcc tcg ccc ccg gcg tcc tcg gac tcc tcc cca gcc gcc cgc gct 240

Gln Ser Ser Pro Pro Ala Ser Ser Asp Ser Ser Pro Ala Ala Arg Ala

65 70 75 80

ctt gac tac gct gcc gcc ttg aca gtc cct cac agc tac ttc acg caa 288

Leu Asp Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln

85 90 95

ttc tac att gcc tcc gtt ttg gcc tcg gtc ttc tgg gct gcg cag ctt 336

Phe Tyr Ile Ala Ser Val Leu Ala Ser Val Phe Trp Ala Ala Gln Leu

100 105 110

ctg tgt caa gga gcc gtg ttc cag gcc ttt gca acg aga atc agt ccg 384

Leu Cys Gln Gly Ala Val Phe Gln Ala Phe Ala Thr Arg Ile Ser Pro

115 120 125

gaa cat atg caa cag tcc atg tcc ata cac caa gtc ttc ttg tgc tgg 432

Glu His Met Gln Gln Ser Met Ser Ile His Gln Val Phe Leu Cys Trp

130 135 140

gcg ctc atg ctc att cag ggt gca agg cgg cta tat gag tgc aag gcc 480

Ala Leu Met Leu Ile Gln Gly Ala Arg Arg Leu Tyr Glu Cys Lys Ala

145 150 155 160

ttc gcc aag cct tca gcc tca aga atg tgg ttt gtt cac tgg ctc gta 528

Phe Ala Lys Pro Ser Ala Ser Arg Met Trp Phe Val His Trp Leu Val

165 170 175

ggc ctt gca ttt tac cta gca gta tcc gtt gcc tta tgg atc gaa gga 576

Gly Leu Ala Phe Tyr Leu Ala Val Ser Val Ala Leu Trp Ile Glu Gly

180 185 190

gca gga gcc ctg ctg tct cat aaa gtg att ctc gac gac ctc aag gtt 624

Ala Gly Ala Leu Leu Ser His Lys Val Ile Leu Asp Asp Leu Lys Val

195 200 205

aca ata gca ccc tct ctc cgc acc ttt gtc tgc att cct ctt ttc ttg 672

Thr Ile Ala Pro Ser Leu Arg Thr Phe Val Cys Ile Pro Leu Phe Leu

210 215 220

att gca tca ggc atc caa cac gac tgc cac cat tac ctc ttc tct ttg 720

Ile Ala Ser Gly Ile Gln His Asp Cys His His Tyr Leu Phe Ser Leu

225 230 235 240

aag aaa tat acc ctg ccc act cac ccc atc ttt cgc agg atc gta tgt 768

Lys Lys Tyr Thr Leu Pro Thr His Pro Ile Phe Arg Arg Ile Val Cys

245 250 255

cca cat tat acg gca gag tgt gtg ata tat ctt tcg ttg gct ctg ctg 816

Pro His Tyr Thr Ala Glu Cys Val Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Leu

260 265 270

ggc gcg ccc aag ggc gag gtc gta aac aag tcg ttg ttg tcc gct ctc 864

Gly Ala Pro Lys Gly Glu Val Val Asn Lys Ser Leu Leu Ser Ala Leu

275 280 285

gta ttt gtt gtt atc aac ttg ggc gtc acc gct gcg aac act agg cat 912

Val Phe Val Val Ile Asn Leu Gly Val Thr Ala Ala Asn Thr Arg His

290 295 300

tgg tat atg cga aaa ttc ggc gag gag tct gtg cgg gaa aga tcg aac 960

Trp Tyr Met Arg Lys Phe Gly Glu Glu Ser Val Arg Glu Arg Ser Asn

305 310 315 320

atg atc cct tgg gtt tac taa 981

Met Ile Pro Trp Val Tyr

325

<210> 6

<211> 326

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 6

Met Glu Leu Pro Phe Ser Leu Val Asp Thr Ala Leu Ser Ser Thr His

1 5 10 15

Ile Asp Ala Ile Asp Ala Leu Arg Ala Phe Phe Leu Leu Ala Ser Cys

20 25 30

Thr Ile Leu Ser Val Ser Ile Leu Pro Asp Ser Leu His Ser Arg Phe

35 40 45

Ile Pro Tyr Gly Ala Arg Thr Thr Ser Thr Ala Asp Ser Gln Ser Ser

50 55 60

Gln Ser Ser Pro Pro Ala Ser Ser Asp Ser Ser Pro Ala Ala Arg Ala

65 70 75 80

Leu Asp Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln

85 90 95

Phe Tyr Ile Ala Ser Val Leu Ala Ser Val Phe Trp Ala Ala Gln Leu

100 105 110

Leu Cys Gln Gly Ala Val Phe Gln Ala Phe Ala Thr Arg Ile Ser Pro

115 120 125

Glu His Met Gln Gln Ser Met Ser Ile His Gln Val Phe Leu Cys Trp

130 135 140

Ala Leu Met Leu Ile Gln Gly Ala Arg Arg Leu Tyr Glu Cys Lys Ala

145 150 155 160

Phe Ala Lys Pro Ser Ala Ser Arg Met Trp Phe Val His Trp Leu Val

165 170 175

Gly Leu Ala Phe Tyr Leu Ala Val Ser Val Ala Leu Trp Ile Glu Gly

180 185 190

Ala Gly Ala Leu Leu Ser His Lys Val Ile Leu Asp Asp Leu Lys Val

195 200 205

Thr Ile Ala Pro Ser Leu Arg Thr Phe Val Cys Ile Pro Leu Phe Leu

210 215 220

Ile Ala Ser Gly Ile Gln His Asp Cys His His Tyr Leu Phe Ser Leu

225 230 235 240

Lys Lys Tyr Thr Leu Pro Thr His Pro Ile Phe Arg Arg Ile Val Cys

245 250 255

Pro His Tyr Thr Ala Glu Cys Val Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Leu

260 265 270

Gly Ala Pro Lys Gly Glu Val Val Asn Lys Ser Leu Leu Ser Ala Leu

275 280 285

Val Phe Val Val Ile Asn Leu Gly Val Thr Ala Ala Asn Thr Arg His

290 295 300

Trp Tyr Met Arg Lys Phe Gly Glu Glu Ser Val Arg Glu Arg Ser Asn

305 310 315 320

Met Ile Pro Trp Val Tyr

325

<210> 7

<211> 1152

<212> DNA

<213> 米曲霉

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(105)

<220>

<221> 内含子

<222> (106)..(216)

<220>

<221> 外显子

<222> (217)..(685)

<220>

<221> 内含子

<222> (686)..(751)

<220>

<221> 外显子

<222> (752)..(1149)

<400> 7

atg acc atg gac ttt ctt ccc agt ctc gtc gac tgg gca ctg gcg act 48

Met Thr Met Asp Phe Leu Pro Ser Leu Val Asp Trp Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

gcc cac atg gac gcg gtg gat gtc ctt cga gct ttc ttt ctc ttt gca 96

Ala His Met Asp Ala Val Asp Val Leu Arg Ala Phe Phe Leu Phe Ala

20 25 30

tcg tgt acg gtatgaaaac atgttgacaa tgacgtagtg gcagaacgcc 145

Ser Cys Thr

35

gagcatcata cggcatcagt ctaccaaata tttttttcta tctaaaatgg cttcaaaact 205

aaactcccca g atc ctg tcg gtc agc ctg ttg gat tcc ctt cgt tcg cgc 255

Ile Leu Ser Val Ser Leu Leu Asp Ser Leu Arg Ser Arg

40 45

ttc gtc cct tat ggc gct cgt gca acc gtg acg gcc gag tcg gat act 303

Phe Val Pro Tyr Gly Ala Arg Ala Thr Val Thr Ala Glu Ser Asp Thr

50 55 60

acc ccg tct gag cct tcg agc agc tcc ccc tta act cac att ctc gac 351

Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Ser Ser Pro Leu Thr His Ile Leu Asp

65 70 75 80

tat ctt gcc tct ttg aaa gtt cca cac agc tat ttc aca cag ttc tac 399

Tyr Leu Ala Ser Leu Lys Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln Phe Tyr

85 90 95

gtc gtc tcc ctg cta tcc tcg gtt ttc tgg gcc ctt cag ctt atg tgc 447

Val Val Ser Leu Leu Ser Ser Val Phe Trp Ala Leu Gln Leu Met Cys

100 105 110

cat gga caa gcg ttc caa gcc atc gcg acg agg gtt cac tcg gaa cac 495

His Gly Gln Ala Phe Gln Ala Ile Ala Thr Arg Val His Ser Glu His

115 120 125

cta cag agg acg atg tcg atc aac cag att atg ttg tgc tgg gta ctg 543

Leu Gln Arg Thr Met Ser Ile Asn Gln Ile Met Leu Cys Trp Val Leu

130 135 140

atg ctc gcg caa ggt gta aga cgg tta cat gag tgc ttc acc ttt tcc 591

Met Leu Ala Gln Gly Val Arg Arg Leu His Glu Cys Phe Thr Phe Ser

145 150 155 160

aag cct tct tct tcc cag atg tgg ttt gtc cac tgg cta gca ggc att 639

Lys Pro Ser Ser Ser Gln Met Trp Phe Val His Trp Leu Ala Gly Ile

165 170 175

gct ttc tat cta gca gtc tca atc gcc ctg tgg att gag ggg aca g 685

Ala Phe Tyr Leu Ala Val Ser Ile Ala Leu Trp Ile Glu Gly Thr

180 185 190

gtatgcagtt cccgtggcca agcacgattg ctgtcccgct aatttcgatc ggttcgaaat 745

tcacag aa acg ctg ttg tcc cat aaa ttg agc ctc gac gat gta acc 792

Glu Thr Leu Leu Ser His Lys Leu Ser Leu Asp Asp Val Thr

195 200 205

gtg aac aac gcc cca agc ctt cgt aca ttt ctc tgc ttg cca atc ttt 840

Val Asn Asn Ala Pro Ser Leu Arg Thr Phe Leu Cys Leu Pro Ile Phe

210 215 220

ctg ttt gca tct ggc cta caa cat gac gcc cac cac tat ctt ttc tct 888

Leu Phe Ala Ser Gly Leu Gln His Asp Ala His His Tyr Leu Phe Ser

225 230 235

ctc aag aag tac acc ctt ccc tcc cac ccc ttg ttc cgc agc atc gta 936

Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro Ser His Pro Leu Phe Arg Ser Ile Val

240 245 250

tgt ccg cac tac acg gct gaa tgt gcg atc tac cta tca ttg gcc ctg 984

Cys Pro His Tyr Thr Ala Glu Cys Ala Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu

255 260 265

ctt gcc gct ccc cgg gga gag atg atc aat aag aca gtt ttg tcc gct 1032

Leu Ala Ala Pro Arg Gly Glu Met Ile Asn Lys Thr Val Leu Ser Ala

270 275 280 285

gcc gtc ttt gtc acg gtc aat tta ggc gtc act gcg tcc gag acc aaa 1080

Ala Val Phe Val Thr Val Asn Leu Gly Val Thr Ala Ser Glu Thr Lys

290 295 300

cgc tgg tac atg cag aaa ttc ggc gag agc tcg gtg cgg gag agg tgg 1128

Arg Trp Tyr Met Gln Lys Phe Gly Glu Ser Ser Val Arg Glu Arg Trp

305 310 315

aat atg atc cct tgg gta tac taa 1152

Asn Met Ile Pro Trp Val Tyr

320

<210> 8

<211> 975

<212> DNA

<213> 米曲霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(972)

<400> 8

atg acc atg gac ttt ctt ccc agt ctc gtc gac tgg gca ctg gcg act 48

Met Thr Met Asp Phe Leu Pro Ser Leu Val Asp Trp Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

gcc cac atg gac gcg gtg gat gtc ctt cga gct ttc ttt ctc ttt gca 96

Ala His Met Asp Ala Val Asp Val Leu Arg Ala Phe Phe Leu Phe Ala

20 25 30

tcg tgt acg atc ctg tcg gtc agc ctg ttg gat tcc ctt cgt tcg cgc 144

Ser Cys Thr Ile Leu Ser Val Ser Leu Leu Asp Ser Leu Arg Ser Arg

35 40 45

ttc gtc cct tat ggc gct cgt gca acc gtg acg gcc gag tcg gat act 192

Phe Val Pro Tyr Gly Ala Arg Ala Thr Val Thr Ala Glu Ser Asp Thr

50 55 60

acc ccg tct gag cct tcg agc agc tcc ccc tta act cac att ctc gac 240

Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Ser Ser Pro Leu Thr His Ile Leu Asp

65 70 75 80

tat ctt gcc tct ttg aaa gtt cca cac agc tat ttc aca cag ttc tac 288

Tyr Leu Ala Ser Leu Lys Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln Phe Tyr

85 90 95

gtc gtc tcc ctg cta tcc tcg gtt ttc tgg gcc ctt cag ctt atg tgc 336

Val Val Ser Leu Leu Ser Ser Val Phe Trp Ala Leu Gln Leu Met Cys

100 105 110

cat gga caa gcg ttc caa gcc atc gcg acg agg gtt cac tcg gaa cac 384

His Gly Gln Ala Phe Gln Ala Ile Ala Thr Arg Val His Ser Glu His

115 120 125

cta cag agg acg atg tcg atc aac cag att atg ttg tgc tgg gta ctg 432

Leu Gln Arg Thr Met Ser Ile Asn Gln Ile Met Leu Cys Trp Val Leu

130 135 140

atg ctc gcg caa ggt gta aga cgg tta cat gag tgc ttc acc ttt tcc 480

Met Leu Ala Gln Gly Val Arg Arg Leu His Glu Cys Phe Thr Phe Ser

145 150 155 160

aag cct tct tct tcc cag atg tgg ttt gtc cac tgg cta gca ggc att 528

Lys Pro Ser Ser Ser Gln Met Trp Phe Val His Trp Leu Ala Gly Ile

165 170 175

gct ttc tat cta gca gtc tca atc gcc ctg tgg att gag ggg aca gaa 576

Ala Phe Tyr Leu Ala Val Ser Ile Ala Leu Trp Ile Glu Gly Thr Glu

180 185 190

acg ctg ttg tcc cat aaa ttg agc ctc gac gat gta acc gtg aac aac 624

Thr Leu Leu Ser His Lys Leu Ser Leu Asp Asp Val Thr Val Asn Asn

195 200 205

gcc cca agc ctt cgt aca ttt ctc tgc ttg cca atc ttt ctg ttt gca 672

Ala Pro Ser Leu Arg Thr Phe Leu Cys Leu Pro Ile Phe Leu Phe Ala

210 215 220

tct ggc cta caa cat gac gcc cac cac tat ctt ttc tct ctc aag aag 720

Ser Gly Leu Gln His Asp Ala His His Tyr Leu Phe Ser Leu Lys Lys

225 230 235 240

tac acc ctt ccc tcc cac ccc ttg ttc cgc agc atc gta tgt ccg cac 768

Tyr Thr Leu Pro Ser His Pro Leu Phe Arg Ser Ile Val Cys Pro His

245 250 255

tac acg gct gaa tgt gcg atc tac cta tca ttg gcc ctg ctt gcc gct 816

Tyr Thr Ala Glu Cys Ala Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ala

260 265 270

ccc cgg gga gag atg atc aat aag aca gtt ttg tcc gct gcc gtc ttt 864

Pro Arg Gly Glu Met Ile Asn Lys Thr Val Leu Ser Ala Ala Val Phe

275 280 285

gtc acg gtc aat tta ggc gtc act gcg tcc gag acc aaa cgc tgg tac 912

Val Thr Val Asn Leu Gly Val Thr Ala Ser Glu Thr Lys Arg Trp Tyr

290 295 300

atg cag aaa ttc ggc gag agc tcg gtg cgg gag agg tgg aat atg atc 960

Met Gln Lys Phe Gly Glu Ser Ser Val Arg Glu Arg Trp Asn Met Ile

305 310 315 320

cct tgg gta tac taa 975

Pro Trp Val Tyr

<210> 9

<211> 324

<212> PRT

<213> 米曲霉

<400> 9

Met Thr Met Asp Phe Leu Pro Ser Leu Val Asp Trp Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ala His Met Asp Ala Val Asp Val Leu Arg Ala Phe Phe Leu Phe Ala

20 25 30

Ser Cys Thr Ile Leu Ser Val Ser Leu Leu Asp Ser Leu Arg Ser Arg

35 40 45

Phe Val Pro Tyr Gly Ala Arg Ala Thr Val Thr Ala Glu Ser Asp Thr

50 55 60

Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Ser Ser Pro Leu Thr His Ile Leu Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Ala Ser Leu Lys Val Pro His Ser Tyr Phe Thr Gln Phe Tyr

85 90 95

Val Val Ser Leu Leu Ser Ser Val Phe Trp Ala Leu Gln Leu Met Cys

100 105 110

His Gly Gln Ala Phe Gln Ala Ile Ala Thr Arg Val His Ser Glu His

115 120 125

Leu Gln Arg Thr Met Ser Ile Asn Gln Ile Met Leu Cys Trp Val Leu

130 135 140

Met Leu Ala Gln Gly Val Arg Arg Leu His Glu Cys Phe Thr Phe Ser

145 150 155 160

Lys Pro Ser Ser Ser Gln Met Trp Phe Val His Trp Leu Ala Gly Ile

165 170 175

Ala Phe Tyr Leu Ala Val Ser Ile Ala Leu Trp Ile Glu Gly Thr Glu

180 185 190

Thr Leu Leu Ser His Lys Leu Ser Leu Asp Asp Val Thr Val Asn Asn

195 200 205

Ala Pro Ser Leu Arg Thr Phe Leu Cys Leu Pro Ile Phe Leu Phe Ala

210 215 220

Ser Gly Leu Gln His Asp Ala His His Tyr Leu Phe Ser Leu Lys Lys

225 230 235 240

Tyr Thr Leu Pro Ser His Pro Leu Phe Arg Ser Ile Val Cys Pro His

245 250 255

Tyr Thr Ala Glu Cys Ala Ile Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ala

260 265 270

Pro Arg Gly Glu Met Ile Asn Lys Thr Val Leu Ser Ala Ala Val Phe

275 280 285

Val Thr Val Asn Leu Gly Val Thr Ala Ser Glu Thr Lys Arg Trp Tyr

290 295 300

Met Gln Lys Phe Gly Glu Ser Ser Val Arg Glu Arg Trp Asn Met Ile

305 310 315 320

Pro Trp Val Tyr

<210> 10

<211> 1014

<212> DNA

<213> 镶片镰孢

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(571)

<220>

<221> 内含子

<222> (572)..(622)

<220>

<221> 外显子

<222> (623)..(1011)

<400> 10

atg gaa gaa ttg ata cac caa tcc atc gat ctg atg tcg att ttg aca 48

Met Glu Glu Leu Ile His Gln Ser Ile Asp Leu Met Ser Ile Leu Thr

1 5 10 15

cca gca caa tgg tgt cag act ttc ttc gcc ctt tct acg gcc atc gtc 96

Pro Ala Gln Trp Cys Gln Thr Phe Phe Ala Leu Ser Thr Ala Ile Val

20 25 30

ctt ggt atc caa gcc ctc cca caa gat gtt cgc agc gct ctc atg gac 144

Leu Gly Ile Gln Ala Leu Pro Gln Asp Val Arg Ser Ala Leu Met Asp

35 40 45

tac ggc gcc cga aga ccc aaa gat gcg aaa cac gga aag gag caa gaa 192

Tyr Gly Ala Arg Arg Pro Lys Asp Ala Lys His Gly Lys Glu Gln Glu

50 55 60

gaa aac gga cag aaa gct ctc gtg cct ctg agg tca ttt atg aag aat 240

Glu Asn Gly Gln Lys Ala Leu Val Pro Leu Arg Ser Phe Met Lys Asn

65 70 75 80

tta aca gag tac ggg caa gtg ccc cat tca tgg ttc ttg cac ttt tac 288

Leu Thr Glu Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Leu His Phe Tyr

85 90 95

att gtt tcg gtg gcc ctg tcg ggt ttc tgg gcg tgg cag tat ctc act 336

Ile Val Ser Val Ala Leu Ser Gly Phe Trp Ala Trp Gln Tyr Leu Thr

100 105 110

caa ggt cat gta ctg aaa agc att gtg acg tgg cag aat cga gct gat 384

Gln Gly His Val Leu Lys Ser Ile Val Thr Trp Gln Asn Arg Ala Asp

115 120 125

gga ccg tcc atg agc ctg gag caa att ttc gtg gca tgg ttg ctc atg 432

Gly Pro Ser Met Ser Leu Glu Gln Ile Phe Val Ala Trp Leu Leu Met

130 135 140

gcg ttg cag ggt tcg aga agg ctt tac gag agt ttg ttt gtg ttc aag 480

Ala Leu Gln Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Ser Leu Phe Val Phe Lys

145 150 155 160

cca ggg tca tca cct atg tgg ttt att cat tgg gca ctt ggt ctt tcg 528

Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Ile His Trp Ala Leu Gly Leu Ser

165 170 175

tac tac att gca atg agc ctt gct gtc tgg gtc gag ggt tcc a 571

Tyr Tyr Ile Ala Met Ser Leu Ala Val Trp Val Glu Gly Ser

180 185 190

gtatgttttc aatattcaca cctggctaca acagaagctg acaagttgca g gc gcc 627

Ser Ala

att tta gca gcc tgg gat tct ccc tat caa cct ctc cgg gtt cca cga 675

Ile Leu Ala Ala Trp Asp Ser Pro Tyr Gln Pro Leu Arg Val Pro Arg

195 200 205

cgg cta cct tca gcc cta gcg tta tat ttc gtg gct tac ttc aag caa 723

Arg Leu Pro Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Phe Val Ala Tyr Phe Lys Gln

210 215 220

aac caa tgt cac aga cac ttg gca agc ctc aag aag tat acc ctc cca 771

Asn Gln Cys His Arg His Leu Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro

225 230 235 240

agt gag gga tgg ttc aag tat ata atc tgt cca cac tat act tta gaa 819

Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Ile Ile Cys Pro His Tyr Thr Leu Glu

245 250 255

tgc ctt gtg tac ctt gcc att gca tgg atc gct gca cca cac ggc caa 867

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Ile Phe Asn Lys Ser Ile Leu Gly Ala Val Met Phe Val Ala Val Asn

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Leu Gly Ala Thr Ala Lys Gly Thr Lys Val Trp Tyr Glu Gln Lys Phe

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cacactgctg cctttaccaa gcagctgagg gtatgtgata ggcaaatgtt caggggccac 1860

tgcatggttt cgaatagaaa gagaagctta gccaagaaca atagccgata aagatagcct 1920

cattaaacgg aatgagctag taggcaaagt cagcgaatgt gtatatataa aggttcgagg 1980

tccgtgcctc cctcatgctc tccccatcta ctcatcaact cagatcctcc aggagacttg 2040

tacaccatct tttgaggcac agaaacccaa tagtcaaccg cggactgcgc accatgaagc 2100

ttcttccctc cttgattggc ctggccagtc tggcgtccct cgccgtcgcc cggatccccg 2160

gctttgacat ttcgggctgg caaccgacca ccgactttgc aagggcgtat gctaatggag 2220

atcgtttcgt ctacatcaag gtacgttcaa ccttgccacc aagttgcgaa cccgagacaa 2280

gactgtgacc gcctcctttg ccctggggca gctcacgcac ccagcagcat cccatccccc 2340

ggccccccac gtaccaccgg aaagctaaca tcaaccccct accactgcta ccaggccacc 2400

gagggcacca cattcaagag ctccgcattc agccgccagt acaccggcgc aacgcaaaac 2460

ggcttcatcc gcggcgccta ccacttcgcc cagcccgccg cgtcctcggg cgccgcgcag 2520

gcgagatact tcgccagcaa cggcggcggc tggtccaagg acggcatcac cctgcccggg 2580

gcgctggaca tcgagtacaa ccccaacggc gccacctgct acggcctctc gcaatcggcc 2640

atggtgaact ggatcgagga ctttgtcacc acctaccacg gcatcacctc ccgctggccc 2700

gtcatctaca ccaccaccga ctggtggacc cagtgcaccg gcaactccaa ccgcttcgcg 2760

aaccgctgcc cgctgtggat cgcccgctac gccagctccg tcggcactct gcccaatggc 2820

tggggctttt acaccttctg gcagtacaac gacaagtatc ctcagggcgg tgattcgaac 2880

tggttcaacg gcgatgcgtc gcgtctcagg gctctcgcta acggagacta ataagctccg 2940

tggcgaaagc ctgacgcacc ggtagattct tggtgagccc gtatcatgac ggcggcggga 3000

gctacatggc cccgggtgat ttattttttt tgtatctact tctgaccctt ttcaaatata 3060

cggtcaactc atctttcact ggagatgcgg cctgcttggt attgcgatgt tgtcagcttg 3120

gcaaattgtg gctttcgaaa acacaaaacg attccttagt agccatgcat caagcttggt 3180

accgagctct ggaaacgcaa ccctgaaggg attcttcctt tgagagatgg aagcgtgtca 3240

tatctcttcg gttctacggc aggttttttt ctgctctttc gtagcatggc atggtcactt 3300

cagcgcttat ttacagttgc tggtattgat ttcttgtgca aattgctatc tgacacttat 3360

tagctatgga gtcaccacat ttcccagcaa cttccccact tcctctgcaa tcgccaacgt 3420

cctctcttca ctgagtctcc gtccgataac ctgcactgca accggtgccc catgatacgc 3480

ctccggatca tactcttcct gcacgagggc atcaagctca ctaaccgcct tgaaactctc 3540

attcttctta tcgatgttct tatccgcaaa ggtaaccgga acaaccacgc tcgtgaaatc 3600

cagcaggttg atcacagagg catacccata gtaccggaac tggtcatgcc gtaccgcagc 3660

ggtaggcgta atcggcgcga tgatggcgtc cagttccttc ccggcctttt cttcagcctc 3720

ccgccatttc tcaaggtact ccatctggta attccacttc tggagatgcg tgtcccagag 3780

ctcgttcatg ttaacagctt tgatgttcgg gttcagtagg tctttgatat ttggagtcgc 3840

cggctcgccg gatgcactga tatcgcgcat tacgtcggcg ctgccgtcag ccgcgtagat 3900

atgggagatg agatcgtggc cgaaatcgtg cttgtatggc gtccacgggg tcacggtgtg 3960

accggctttg gcgagtgcgg cgacggtggt ttccacgccg cgcaggatag gagggtgtgg 4020

aaggacattg ccgtcgaagt tgtagtagcc gatattgagc ccgccgttct tgatcttgga 4080

ggcaataatg tccgactcgg actggcgcca gggcatgggg atgaccttgg agtcgtattt 4140

ccaaggctcc tgaccgagga cggatttggt gaagaggcgg aggtctaaca tacttcatca 4200

gtgactgccg gtctcgtata tagtataaaa agcaagaaag gaggacagtg gaggcctggt 4260

atagagcagg aaaagaagga agaggcgaag gactcaccct caacagagtg cgtaatcggc 4320

ccgacaacgc tgtgcaccgt ctcctgaccc tccatgctgt tcgccatctt tgcatacggc 4380

agccgcccat gactcggcct tagaccgtac aggaagttga acgcggccgg cactcgaatc 4440

gagccaccga tatccgttcc tacaccgatg acgccaccac gaatcccaac gatcgcaccc 4500

tcaccaccag aactgccgcc gcacgaccag ttcttgttgc gtgggttgac ggtgcgcccg 4560

atgatgttgt tgactgtctc gcagaccatc agggtctgcg ggacagaggt cttgacgtag 4620

aagacggcac cggctttgcg gagcatggtt gtcagaaccg agtccccttc gtcgtacttg 4680

tttagccatg agatgtagcc cattgatgtt tcgtagccct ggtggcatat gttagctgac 4740

aaaaagggac atctaacgac ttaggggcaa cggtgtacct tgactcgaag ctggtctttg 4800

agagagatgg ggaggccatg aagtggacca acgggtctct tgtgctttgc gtagtattca 4860

tcgagttccc ttgcctgcgc gagagcggcg tcagggaaga actcgtgggc gcagtttgtc 4920

tgcacagaag ccagcgtcag cttgatagtc ccataaggtg gcgttgttac atctccctga 4980

gaggtagagg ggaccctact aactgctggg cgattgctgc ccgtttacag aatgctagcg 5040

taacttccac cgaggtcaac tctccggccg ccagcttgga cacaagatct gcagcggagg 5100

cctctgtgat cttcagttcg gcctctgaaa ggatccccga tttctttggg aaatcaataa 5160

cgctgtcttc cgcaggcagc gtctggactt tccattcatc agggatggtt tttgcgaggc 5220

gggcgcgctt atcagcggcc agttcttccc aggattgagg cattctgtgt tagcttatag 5280

tcaggatgtt ggctcgacga gtgtaaactg ggagttggca tgagggttat gtaggcttct 5340

ttagccccgc atccccctca ttctcctcat tgatcccggg ggagcggatg gtgttgataa 5400

gagactaatt atagggttta gctggtgcct agctggtgat tggctggctt cgccgaattt 5460

tacgggccaa ggaaagctgc agaaccgcgg cactggtaaa cggtaattaa gctatcagcc 5520

ccatgctaac gagtttaaat tacgtgtatt gctgataaac accaacagag ctttactgaa 5580

agatgggagt cacggtgtgg cttccccact gcgattattg cacaagcagc gagggcgaac 5640

ttgactgtcg tcgctgagca gcctgcagtc aaacatacat atatatcaac cgcgaagacg 5700

tctggccttg tagaacacga cgctccctag caacacctgc cgtgtcagcc tctacggttg 5760

ttacttgcat tcaggatgct ctccagcggg cgagctattc aaaatattca aagcaggtat 5820

ctcgtattgc caggattcag ctgaagcaac aggtgccaag gaaatctgcg tcggttctca 5880

tctgggcttg ctcggtcctg gcgtagacaa gggcgaattc tgcattgaag ttcctattcc 5940

gagttcctat tcttcaaata gtataggaac ttcagatatc catcacactg ggagtaccat 6000

ttaattctat ttgtgtttga tcgagaccta atacagcccc tacaacgacc atcaaagtcg 6060

tatagctacc agtgaggaag tggactcaaa tcgacttcag caacatctcc tggataaact 6120

ttaagcctaa actatacaga ataagatggt ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt 6180

ccagatcatg gttgaccggt gcctggatct tcctatagaa ccatccttat tcgttgacct 6240

agctgattct ggagtgaccc agagggtcat gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc 6300

atttgtagaa aaatgtgacg aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg 6360

catgcggaga gacggacgga cgcagagaga agggctgagt aataagcgcc actgcgccag 6420

acagctctgg cggctctgag gtgcagtgga tgattattaa tccgggaccg gccgcccctc 6480

cgccccgaag tggaaaggct ggtgtgcccc tcgttgacca agaatctatt gcatcatcgg 6540

agaatatgga gcttcatcga atcaccggca gtaagcgaag gagaatgtga agccaggggt 6600

gtatagccgt cggcgaaata gcatgccatt aacctaggta cagaagtcca attgcttccg 6660

atctggtaaa agattcacga gatagtacct tctccgaagt aggtagagcg agtacccggc 6720

gcgtaagctc cctaattggc ccatccggca tctgtagggc gtccaaatat cgtgcctctc 6780

ctgctttgcc cggtgtatga aaccggaaag gccgctcagg agctggccag cggcgcagac 6840

cgggaacaca agctggcagt cgacccatcc ggtgctctgc actcgacctg ctgaggtccc 6900

tcagtccctg gtaggcagct ttgccccgtc tgtccgcccg gtgtgtcggc ggggttgaca 6960

aggtcgttgc gtcagtccaa catttgttgc catattttcc tgctctcccc accagctgct 7020

cttttctttt ctctttcttt tcccatcttc agtatattca tcttcccatc caagaacctt 7080

tatttcccct aagtaagtac tttgctacat ccatactcca tccttcccat cccttattcc 7140

tttgaacctt tcagttcgag ctttcccact tcatcgcagc ttgactaaca gctaccccgc 7200

ttgagcagac atcaccatgc cccagttcga tatcctctgc aagacccccc ccaaggtcct 7260

cgtccgccag ttcgtcgagc gcttcgagcg cccctccggc gagaagatcg ccctctgcgc 7320

cgccgagctc acctacctct gctggatgat cacccataac ggcaccgcca tcaagcgcgc 7380

caccttcatg tcctacaaca ccatcatctc caactccctc tccttcgata tcgtcaacaa 7440

gtccctccag ttcaagtaca agacccagaa ggccaccatc ctggaggcct ccctcaagaa 7500

gctcatcccc gcctgggagt tcaccatcat cccctactac ggccagaagc atcagtccga 7560

tatcaccgat atcgtctcct ccctccagct ccagttcgag tcctccgagg aggccgataa 7620

gggcaactcc cattccaaga agatgctcaa ggccctcctc tccgagggcg agtccatctg 7680

ggagatcacc gagaagatcc tcaactcctt cgagtacacc tcccgcttca ccaagaccaa 7740

gaccctctac cagttcctct tcctcgccac cttcatcaac tgcggccgct tctccgatat 7800

caagaacgtc gatcccaagt ccttcaagct cgtccagaac aagtacctcg gcgtcatcat 7860

ccagtgcctc gtcaccgaga ccaagacctc cgtctcccgc catatctact tcttctccgc 7920

ccgcggccgc atcgatcccc tcgtctacct cgatgagttc ctccgcaact ccgagcccgt 7980

cctcaagcgc gtcaaccgca ccggcaactc ctcctccaac aagcaggagt accagctcct 8040

caaggataac ctcgtccgct cctacaacaa ggccctcaag aagaacgccc cctactccat 8100

cttcgccatc aagaacggcc ccaagtccca tatcggccgc catctcatga cctccttcct 8160

ctccatgaag ggcctcaccg agctcaccaa cgtcgtcggc aactggtccg ataagcgcgc 8220

ctccgccgtc gcccgcacca cctacaccca tcagatcacc gccatccccg atcattactt 8280

cgcactagtc tcccgctact acgcctacga tcccatctcc aaggagatga tcgccctcaa 8340

ggatgagacc aaccccatcg aggagtggca gcatatcgag cagctcaagg gctccgccga 8400

gggctccatc cgctaccccg cctggaacgg catcatctcc caggaggtcc tcgattacct 8460

ctcctcctac atcaaccgcc gcatccccaa gaagaagcgc aaggtctgag tcgagattat 8520

ccaagggaat gacttaatga gtatgtaaga catgggtcat aacggcgttc gaaacatata 8580

cagggttatg tttgggaata gcacacgaat aataacgtta ataggtacca aagtccttga 8640

tacattagca cggtagaaaa agaataatac aacgagctgg gaatattctt taatataaaa 8700

ctccaagaag agctggtgcg gtggagcttg ttttcgactc tcagtaatat ttcctcatat 8760

ccaagcgcgc taggaggtgg tcgaatacac atgtaggcgc ttctctggat gcaaaagtcg 8820

tgccggacct gccgaaagac tttgaagatg cgttcacgcc atctaagttg cgtagataat 8880

tcacaaaaag ggatgtttgt ttccggaatg tagcaaagag ctgataggca atagcctcac 8940

ttgcatgcat cctagagttt aaacagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 9000

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 9060

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaac 9120

ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 9180

atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac 9240

ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 9300

caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 9360

cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata 9420

atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 9480

ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 9540

cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 9600

cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 9660

aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 9720

ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 9780

gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 9840

cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 9900

acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 9960

gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 10020

aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 10080

ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 10140

ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 10200

gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 10260

aaatctggag cctccaaggg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 10320

aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 10380

aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 10440

gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 10500

gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 10560

tgagcgtcag ac 10572

<210> 13

<211> 8029

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cbh1基因座，在FRT-F和FRT-F3位点之间插入了溶菌酶盒

<400> 13

ggtgaaacac cgcccccttc ttgagagagc aacaacaatc attctgctgt cggcagaaga 60

gcagagactt gctgacccta gttaatgact acacagctcg gaggtttgtg acatgtccat 120

gattttgata catggcggag agcaatgtgg tggacgaaat caatcaccat atggcgctat 180

attggctgtt tcaggtcctg tttcaagctg ttcctacagc tctttcttgg tctacttgtg 240

gtcgcctgct acatcagttg atatacccgg aattactgca gccacttgca gtcccgtgga 300

attctcacgg tgaatgtagg ccttttgtag ggtaggaatt gtcactcaag cacccccaac 360

ctccattacg cctcccccat agagttccca atcagtgagt catggcactg ttctcaaata 420

gattggggag aagttgactt ccgcccagag ctgaaggtcg cacaaccgca tgatataggg 480

tcggcaacgg caaaaaagca cgtggctcac cgaaaagcaa gatgtttgcg atctaacatc 540

caggaacctg gatacatcca tcatcacgca cgaccacttt gatctgctgg taaactcgta 600

ttcgccctaa accgaagtgc gtggtaaatc tacacgtggg cccctttcgg tatactgcgt 660

gtgtcttctc taggtgccat tcttttccct tcctctagtg ttgaattgtt tgtgttggag 720

tccgagctgt aactacctct gaatctctgg agaatggtgg actaacgact accgtgcacc 780

tgcatcatgt atataatagt gatcctgaga aggggggttt ggagcaatgt gggactttga 840

tggtcatcaa acaaagaacg aagacgcctc ttttgcaaag ttttgtttcg gctacggtga 900

agaactggat acttgttgtg tcttctgtgt atttttgtgg caacaagagg ccagagacaa 960

tctattcaaa caccaagctt gctcttttga gctacaagaa cctgtggggt atatatctag 1020

agttgtgaag tcggtaatcc cgctgtatag taatacgagt cgcatctaaa tactccgaag 1080

ctgctgcgaa cccggagaat cgagatgtgc tggaaagctt ctagcgagcg gctaaattag 1140

catgaaaggc tatgagaaat tctggagacg gcttgttgaa tcatggcgtt ccattcttcg 1200

acaagcaaag cgttccgtcg cagtagcagg cactcattcc cgaaaaaact cggagattcc 1260

taagtagcga tggaaccgga ataatataat aggcaataca ttgagttgcc tcgacggttg 1320

caatgcaggg gtactgagct tggacataac tgttccgtac cccacctctt ctcaaccttt 1380

ggcgtttccc tgattcagcg tacccgtaca agtcgtaatc actattaacc cagactgacc 1440

ggacgtgttt tgcccttcat ttggagaaat aatgtcattg cgatgtgtaa tttgcctgct 1500

tgaccgactg gggctgttcg aacggccgcg aattcatctt gaagttccta ttccgagttc 1560

ctattctcta gaaagtatag gaacttccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1620

agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1680

accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1740

tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1800

aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1860

agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1920

tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1980

gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 2040

gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 2100

ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 2160

agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg 2220

ccttcggcct ttgggtgtac atgtttgtgc tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg 2280

aacacactgc tgcctttacc aagcagctga gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc 2340

actgcatggt ttcgaataga aagagaagct tagccaagaa caatagccga taaagatagc 2400

ctcattaaac ggaatgagct agtaggcaaa gtcagcgaat gtgtatatat aaaggttcga 2460

ggtccgtgcc tccctcatgc tctccccatc tactcatcaa ctcagatcct ccaggagact 2520

tgtacaccat cttttgaggc acagaaaccc aatagtcaac cgcggactgc gcaccatgaa 2580

gcttcttccc tccttgattg gcctggccag tctggcgtcc ctcgccgtcg cccggatccc 2640

cggctttgac atttcgggct ggcaaccgac caccgacttt gcaagggcgt atgctaatgg 2700

agatcgtttc gtctacatca aggtacgttc aaccttgcca ccaagttgcg aacccgagac 2760

aagactgtga ccgcctcctt tgccctgggg cagctcacgc acccagcagc atcccatccc 2820

ccggcccccc acgtaccacc ggaaagctaa catcaacccc ctaccactgc taccaggcca 2880

ccgagggcac cacattcaag agctccgcat tcagccgcca gtacaccggc gcaacgcaaa 2940

acggcttcat ccgcggcgcc taccacttcg cccagcccgc cgcgtcctcg ggcgccgcgc 3000

aggcgagata cttcgccagc aacggcggcg gctggtccaa ggacggcatc accctgcccg 3060

gggcgctgga catcgagtac aaccccaacg gcgccacctg ctacggcctc tcgcaatcgg 3120

ccatggtgaa ctggatcgag gactttgtca ccacctacca cggcatcacc tcccgctggc 3180

ccgtcatcta caccaccacc gactggtgga cccagtgcac cggcaactcc aaccgcttcg 3240

cgaaccgctg cccgctgtgg atcgcccgct acgccagctc cgtcggcact ctgcccaatg 3300

gctggggctt ttacaccttc tggcagtaca acgacaagta tcctcagggc ggtgattcga 3360

actggttcaa cggcgatgcg tcgcgtctca gggctctcgc taacggagac taataagctc 3420

cgtggcgaaa gcctgacgca ccggtagatt cttggtgagc ccgtatcatg acggcggcgg 3480

gagctacatg gccccgggtg atttattttt tttgtatcta cttctgaccc ttttcaaata 3540

tacggtcaac tcatctttca ctggagatgc ggcctgcttg gtattgcgat gttgtcagct 3600

tggcaaattg tggctttcga aaacacaaaa cgattcctta gtagccatgc atcaagcttg 3660

gtaccgagct ctggaaacgc aaccctgaag ggattcttcc tttgagagat ggaagcgtgt 3720

catatctctt cggttctacg gcaggttttt ttctgctctt tcgtagcatg gcatggtcac 3780

ttcagcgctt atttacagtt gctggtattg atttcttgtg caaattgcta tctgacactt 3840

attagctatg gagtcaccac atttcccagc aacttcccca cttcctctgc aatcgccaac 3900

gtcctctctt cactgagtct ccgtccgata acctgcactg caaccggtgc cccatgatac 3960

gcctccggat catactcttc ctgcacgagg gcatcaagct cactaaccgc cttgaaactc 4020

tcattcttct tatcgatgtt cttatccgca aaggtaaccg gaacaaccac gctcgtgaaa 4080

tccagcaggt tgatcacaga ggcataccca tagtaccgga actggtcatg ccgtaccgca 4140

gcggtaggcg taatcggcgc gatgatggcg tccagttcct tcccggcctt ttcttcagcc 4200

tcccgccatt tctcaaggta ctccatctgg taattccact tctggagatg cgtgtcccag 4260

agctcgttca tgttaacagc tttgatgttc gggttcagta ggtctttgat atttggagtc 4320

gccggctcgc cggatgcact gatatcgcgc attacgtcgg cgctgccgtc agccgcgtag 4380

atatgggaga tgagatcgtg gccgaaatcg tgcttgtatg gcgtccacgg ggtcacggtg 4440

tgaccggctt tggcgagtgc ggcgacggtg gtttccacgc cgcgcaggat aggagggtgt 4500

ggaaggacat tgccgtcgaa gttgtagtag ccgatattga gcccgccgtt cttgatcttg 4560

gaggcaataa tgtccgactc ggactggcgc cagggcatgg ggatgacctt ggagtcgtat 4620

ttccaaggct cctgaccgag gacggatttg gtgaagaggc ggaggtctaa catacttcat 4680

cagtgactgc cggtctcgta tatagtataa aaagcaagaa aggaggacag tggaggcctg 4740

gtatagagca ggaaaagaag gaagaggcga aggactcacc ctcaacagag tgcgtaatcg 4800

gcccgacaac gctgtgcacc gtctcctgac cctccatgct gttcgccatc tttgcatacg 4860

gcagccgccc atgactcggc cttagaccgt acaggaagtt gaacgcggcc ggcactcgaa 4920

tcgagccacc gatatccgtt cctacaccga tgacgccacc acgaatccca acgatcgcac 4980

cctcaccacc agaactgccg ccgcacgacc agttcttgtt gcgtgggttg acggtgcgcc 5040

cgatgatgtt gttgactgtc tcgcagacca tcagggtctg cgggacagag gtcttgacgt 5100

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<220>

<223> cbh2基因座，在FRT-F和FRT-F3位点之间插入了溶菌酶盒

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acatcaaccc cctaccactg ctaccaggcc accgagggca ccacattcaa gagctccgca 2880

ttcagccgcc agtacaccgg cgcaacgcaa aacggcttca tccgcggcgc ctaccacttc 2940

gcccagcccg ccgcgtcctc gggcgccgcg caggcgagat acttcgccag caacggcggc 3000

ggctggtcca aggacggcat caccctgccc ggggcgctgg acatcgagta caaccccaac 3060

ggcgccacct gctacggcct ctcgcaatcg gccatggtga actggatcga ggactttgtc 3120

accacctacc acggcatcac ctcccgctgg cccgtcatct acaccaccac cgactggtgg 3180

acccagtgca ccggcaactc caaccgcttc gcgaaccgct gcccgctgtg gatcgcccgc 3240

tacgccagct ccgtcggcac tctgcccaat ggctggggct tttacacctt ctggcagtac 3300

aacgacaagt atcctcaggg cggtgattcg aactggttca acggcgatgc gtcgcgtctc 3360

agggctctcg ctaacggaga ctaataagct ccgtggcgaa agcctgacgc accggtagat 3420

tcttggtgag cccgtatcat gacggcggcg ggagctacat ggccccgggt gatttatttt 3480

ttttgtatct acttctgacc cttttcaaat atacggtcaa ctcatctttc actggagatg 3540

cggcctgctt ggtattgcga tgttgtcagc ttggcaaatt gtggctttcg aaaacacaaa 3600

acgattcctt agtagccatg catcaagctt ggtaccgagc tctggaaacg caaccctgaa 3660

gggattcttc ctttgagaga tggaagcgtg tcatatctct tcggttctac ggcaggtttt 3720

tttctgctct ttcgtagcat ggcatggtca cttcagcgct tatttacagt tgctggtatt 3780

gatttcttgt gcaaattgct atctgacact tattagctat ggagtcacca catttcccag 3840

caacttcccc acttcctctg caatcgccaa cgtcctctct tcactgagtc tccgtccgat 3900

aacctgcact gcaaccggtg ccccatgata cgcctccgga tcatactctt cctgcacgag 3960

ggcatcaagc tcactaaccg ccttgaaact ctcattcttc ttatcgatgt tcttatccgc 4020

aaaggtaacc ggaacaacca cgctcgtgaa atccagcagg ttgatcacag aggcataccc 4080

atagtaccgg aactggtcat gccgtaccgc agcggtaggc gtaatcggcg cgatgatggc 4140

gtccagttcc ttcccggcct tttcttcagc ctcccgccat ttctcaaggt actccatctg 4200

gtaattccac ttctggagat gcgtgtccca gagctcgttc atgttaacag ctttgatgtt 4260

cgggttcagt aggtctttga tatttggagt cgccggctcg ccggatgcac tgatatcgcg 4320

cattacgtcg gcgctgccgt cagccgcgta gatatgggag atgagatcgt ggccgaaatc 4380

gtgcttgtat ggcgtccacg gggtcacggt gtgaccggct ttggcgagtg cggcgacggt 4440

ggtttccacg ccgcgcagga taggagggtg tggaaggaca ttgccgtcga agttgtagta 4500

gccgatattg agcccgccgt tcttgatctt ggaggcaata atgtccgact cggactggcg 4560

ccagggcatg gggatgacct tggagtcgta tttccaaggc tcctgaccga ggacggattt 4620

ggtgaagagg cggaggtcta acatacttca tcagtgactg ccggtctcgt atatagtata 4680

aaaagcaaga aaggaggaca gtggaggcct ggtatagagc aggaaaagaa ggaagaggcg 4740

aaggactcac cctcaacaga gtgcgtaatc ggcccgacaa cgctgtgcac cgtctcctga 4800

ccctccatgc tgttcgccat ctttgcatac ggcagccgcc catgactcgg ccttagaccg 4860

tacaggaagt tgaacgcggc cggcactcga atcgagccac cgatatccgt tcctacaccg 4920

atgacgccac cacgaatccc aacgatcgca ccctcaccac cagaactgcc gccgcacgac 4980

cagttcttgt tgcgtgggtt gacggtgcgc ccgatgatgt tgttgactgt ctcgcagacc 5040

atcagggtct gcgggacaga ggtcttgacg tagaagacgg caccggcttt gcggagcatg 5100

gttgtcagaa ccgagtcccc ttcgtcgtac ttgtttagcc atgagatgta gcccattgat 5160

gtttcgtagc cctggtggca tatgttagct gacaaaaagg gacatctaac gacttagggg 5220

caacggtgta ccttgactcg aagctggtct ttgagagaga tggggaggcc atgaagtgga 5280

ccaacgggtc tcttgtgctt tgcgtagtat tcatcgagtt cccttgcctg cgcgagagcg 5340

gcgtcaggga agaactcgtg ggcgcagttt gtctgcacag aagccagcgt cagcttgata 5400

gtcccataag gtggcgttgt tacatctccc tgagaggtag aggggaccct actaactgct 5460

gggcgattgc tgcccgttta cagaatgcta gcgtaacttc caccgaggtc aactctccgg 5520

ccgccagctt ggacacaaga tctgcagcgg aggcctctgt gatcttcagt tcggcctctg 5580

aaaggatccc cgatttcttt gggaaatcaa taacgctgtc ttccgcaggc agcgtctgga 5640

ctttccattc atcagggatg gtttttgcga ggcgggcgcg cttatcagcg gccagttctt 5700

cccaggattg aggcattctg tgttagctta tagtcaggat gttggctcga cgagtgtaaa 5760

ctgggagttg gcatgagggt tatgtaggct tctttagccc cgcatccccc tcattctcct 5820

cattgatccc gggggagcgg atggtgttga taagagacta attatagggt ttagctggtg 5880

cctagctggt gattggctgg cttcgccgaa ttttacgggc caaggaaagc tgcagaaccg 5940

cggcactggt aaacggtaat taagctatca gccccatgct aacgagttta aattacgtgt 6000

attgctgata aacaccaaca gagctttact gaaagatggg agtcacggtg tggcttcccc 6060

actgcgatta ttgcacaagc agcgagggcg aacttgactg tcgtcgctga gcagcctgca 6120

gtcaaacata catatatatc aaccgcgaag acgtctggcc ttgtagaaca cgacgctccc 6180

tagcaacacc tgccgtgtca gcctctacgg ttgttacttg cattcaggat gctctccagc 6240

gggcgagcta ttcaaaatat tcaaagcagg tatctcgtat tgccaggatt cagctgaagc 6300

aacaggtgcc aaggaaatct gcgtcggttc tcatctgggc ttgctcggtc ctggcgtaga 6360

caagggcgaa ttctgcattg aagttcctat tccgagttcc tattcttcaa atagtatagg 6420

aacttcatta attaagataa tggccacttt catctgaatc aaggacagga gccgttgatg 6480

atttccagat atcctatctt catcgctagt actaataaca agtaagcaaa cagccagcta 6540

cactcgtaca caccgctcat gaaaacataa gacaaagctc aagccatgtc aagcaccacc 6600

ccatcgtaca cgtacatctt ctaccaatct gtccagatgc cggctacgtc agcctccaac 6660

ccattgcgat acaatgacgg atgtcgtata gaccatggca acggctccca ccaccattgt 6720

cactgcgtcc aaagtcttct cccacctgct ctcagcaacg cccttgaaat gcaggaatgc 6780

cggatacatg tagaccaatg gaatgcaggc aaaagatccc gtcagcgcca caaacttatc 6840

caaatcactt gctcccacca ccgccacgcc gatgcatgcc acaatggtca aggcccggag 6900

gccgttcttc ttccacttga ttgccgcgct cttcttacca gtggcgcgct ctccgaaaat 6960

cgacgtttcc aatatgcgga tcgcggggaa cagctgcaca ggctcgccag ccagtacggc 7020

cagcgagtag agaaactgga ctgcattgac gagaggcgag tcctggggaa aattggagat 7080

gatttgaatc ttggtgtgtt ctccaaacgt cgcatagcag agtgcgccga ctgatgtgaa 7140

gatggccgtg atgaggagca tgacaaagta gaggaggccc ttgaactgat gaggcttctt 7200

catactcgac tgaattggca ggatcaggcc aatgccctca aacgtgaaga tcgccgagcc 7260

cagagtcagg ggaaaatcgg aggggttgaa gagcttgacg cttggctcca taccgtgcct 7320

gaccaggctt cgaatgtcaa aataccagat gtatacgagt ccaatgagga tgaaggcgtc 7380

cgccaccaga gcaaccggac ccagcttgga gatgttgcgg atccaggcta acggaatgag 7440

agggaggaac tgaagcgcaa ttaggcccga caccccgaaa tgaccaaggc cgttggtgac 7500

agcgtcgagg aaggagaaga gattttcagc agtgaagata atgcctgagc agacgaagcc 7560

cagctgagaa atggcaatgg aggcgagaat caagcttcga aaccggggtc caacgacggc 7620

ctcgccaatg tctccatagc caccgccgta cttgtggcgg cagtccagaa gtaagcggaa 7680

acagaagcaa ttgaccagtg acacggagat gagcgccagt gacgaaaaga ggatacctcc 7740

gttgcggaat gccttgggca ggaacaggat gcctgtgccg atgaaagcct tgagcagcgt 7800

gaagaaggtc ttgactgtgc tcgcgtcacc ctggcgggca agacggcggg agcttctccg 7860

gcgaccagca ctcggtcgcg caagcagcgg acgccgctcg tcggcggctt cttccgcctc 7920

atcagtgacg gcagac 7936

<210> 16

<211> 8996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> xyn2基因座，在FRT-F和FRT-F3位点之间插入了溶菌酶盒

<400> 16

cttgaacgcg aaaatgttat cagggccgag gagatgtacc ctgagcctta ccagtggcca 60

gccatccttc aagggtccag gaagcattgg caaatctggc gagattgagg catctgctgg 120

tataccttgt agttaaggga actcttgtgc cttctttgtc aggaacctgc cttgcaaggc 180

taagcatcta ccttgcttgt tcgccttgcc ttacttagat tctgggagct tgtagttaca 240

tagctcatat gctatttgct tttgcgagga gggcacttgc aagactggct ctatgaaggg 300

cgttggatac tgtcgctact acggtcgtac gggatggtcc ttgcaaagaa gtgcaatcta 360

tttcagagga ttgttgttgc cttttgagtc ttaggttgtt gataggacac cttctttaca 420

ataaggtagt gaaaaccagc ctcttgtcgc tgagacttcc agttatctgg cctacctagg 480

taggtaccca gagaatatct acctaggcag tatggtgctt taaccgtggc ccttctgaac 540

ctgatctttc ttgtcgctct gatttctgct gctcataggc tggccttaca cttggatctt 600

tatggtcaaa tgttcatgaa acaacgctct gggtccttga gctatgtatc atgatatcag 660

ccttgaacag tctgggttat ggctgtaatg caagcatacc atggcttcaa ggggcaggag 720

taaagaaaag aaagacagat tctcagagat gatacagact cccttcaaaa acgctgctgt 780

acatgatccc cagtgtcgac atcctgatct attctaggta aggtagattc aactcagtat 840

atcgttattc gagataaaat ggatagcatt gagtatctga agaaagtagg taccaatatt 900

aaacttctct ttatagctag atcacagtac tgaaaagaaa agaagtagcg attattatct 960

tgaataaaag atatagcagt ctatatctct actagaggaa agtagaagaa gtagagctac 1020

ctagaattac aagtctcctc tttctacccc ctcctctccc ccctctcctc tgcttatttc 1080

ataaccatct cctgtttcgc catttaaacg tacattcaaa gctctctcgg cgccgtctgc 1140

ccacacatca acaagcatca cgcctgcagc agcatctcta ggactgctcg cgcctgaaaa 1200

gcagatcaac aagagcagtt cagactggca ttctatccgg ccctattctc attccgacgg 1260

ttactctgcc accgaccgtg cccagaagga ataccagaac acctgaacct gctggaaggc 1320

accttttagt ccaccaactt tggaacgacg cagcctcttc tctcaaagct cagatcatag 1380

acgcagccag cgacatgcag tgcaatgtca tggatgtttt gtgggttacg ttcgtcccta 1440

cagagtcact ggcaggctac atgcatgtca tggtcccata tcgcccattc gaccaccgtc 1500

agcccagtac ttgctcgtgt caatctccgt cagtcgcgtg tgatcagaca ttccaactgg 1560

atctgggcca gccgggcact ctttgccttg tcctgtttga caggttcaat ttgctctgta 1620

tgccacttct gtccagtctg tttagtgagc cagactgctg agacactctg aaccgaggag 1680

caagcgcctc cacagccaag aagttgaaga agacggcaga cacccacaca gtgaccacga 1740

agctttgtca cgcagtattg atcccatcaa ccactagcaa atccctagac accccgaaag 1800

gacttcaaca gtgacctagc agcaaagccg tgagtctcgg acggcctctt gttcaactca 1860

accgaccttc caagctacaa aaacgacaag gttggatgtc tgccgtttgc tgcctcgcca 1920

ccagctgact ttaggcaaaa caggtcattg aatccagatc ggagtcgaca ctcgcatccg 1980

tgcggccgcg aattcatctt gaagttccta ttccgagttc ctattctcta gaaagtatag 2040

gaacttccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt agaggcatgt tgtgaatctg 2100

tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa accaccgata gcagtgtcta 2160

gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa tacaaaccaa tggctaaaag 2220

tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct aataattgta caatcaagtg 2280

gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc agaagcaacg gcaaagcccc 2340

acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc tggtgatccc ccaattgggt 2400

cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa gaatgtctga ctcggagcgt 2460

tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat gttgacattc aaggagtatt 2520

tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt ctgccgatac gacgaatact 2580

gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta agtcggcact gaacaggcaa 2640

aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg ccttcggcct ttgggtgtac 2700

atgtttgtgc tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg aacacactgc tgcctttacc 2760

aagcagctga gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc actgcatggt ttcgaataga 2820

aagagaagct tagccaagaa caatagccga taaagatagc ctcattaaac ggaatgagct 2880

agtaggcaaa gtcagcgaat gtgtatatat aaaggttcga ggtccgtgcc tccctcatgc 2940

tctccccatc tactcatcaa ctcagatcct ccaggagact tgtacaccat cttttgaggc 3000

acagaaaccc aatagtcaac cgcggactgc gcaccatgaa gcttcttccc tccttgattg 3060

gcctggccag tctggcgtcc ctcgccgtcg cccggatccc cggctttgac atttcgggct 3120

ggcaaccgac caccgacttt gcaagggcgt atgctaatgg agatcgtttc gtctacatca 3180

aggtacgttc aaccttgcca ccaagttgcg aacccgagac aagactgtga ccgcctcctt 3240

tgccctgggg cagctcacgc acccagcagc atcccatccc ccggcccccc acgtaccacc 3300

ggaaagctaa catcaacccc ctaccactgc taccaggcca ccgagggcac cacattcaag 3360

agctccgcat tcagccgcca gtacaccggc gcaacgcaaa acggcttcat ccgcggcgcc 3420

taccacttcg cccagcccgc cgcgtcctcg ggcgccgcgc aggcgagata cttcgccagc 3480

aacggcggcg gctggtccaa ggacggcatc accctgcccg gggcgctgga catcgagtac 3540

aaccccaacg gcgccacctg ctacggcctc tcgcaatcgg ccatggtgaa ctggatcgag 3600

gactttgtca ccacctacca cggcatcacc tcccgctggc ccgtcatcta caccaccacc 3660

gactggtgga cccagtgcac cggcaactcc aaccgcttcg cgaaccgctg cccgctgtgg 3720

atcgcccgct acgccagctc cgtcggcact ctgcccaatg gctggggctt ttacaccttc 3780

tggcagtaca acgacaagta tcctcagggc ggtgattcga actggttcaa cggcgatgcg 3840

tcgcgtctca gggctctcgc taacggagac taataagctc cgtggcgaaa gcctgacgca 3900

ccggtagatt cttggtgagc ccgtatcatg acggcggcgg gagctacatg gccccgggtg 3960

atttattttt tttgtatcta cttctgaccc ttttcaaata tacggtcaac tcatctttca 4020

ctggagatgc ggcctgcttg gtattgcgat gttgtcagct tggcaaattg tggctttcga 4080

aaacacaaaa cgattcctta gtagccatgc atcaagcttg gtaccgagct ctggaaacgc 4140

aaccctgaag ggattcttcc tttgagagat ggaagcgtgt catatctctt cggttctacg 4200

gcaggttttt ttctgctctt tcgtagcatg gcatggtcac ttcagcgctt atttacagtt 4260

gctggtattg atttcttgtg caaattgcta tctgacactt attagctatg gagtcaccac 4320

atttcccagc aacttcccca cttcctctgc aatcgccaac gtcctctctt cactgagtct 4380

ccgtccgata acctgcactg caaccggtgc cccatgatac gcctccggat catactcttc 4440

ctgcacgagg gcatcaagct cactaaccgc cttgaaactc tcattcttct tatcgatgtt 4500

cttatccgca aaggtaaccg gaacaaccac gctcgtgaaa tccagcaggt tgatcacaga 4560

ggcataccca tagtaccgga actggtcatg ccgtaccgca gcggtaggcg taatcggcgc 4620

gatgatggcg tccagttcct tcccggcctt ttcttcagcc tcccgccatt tctcaaggta 4680

ctccatctgg taattccact tctggagatg cgtgtcccag agctcgttca tgttaacagc 4740

tttgatgttc gggttcagta ggtctttgat atttggagtc gccggctcgc cggatgcact 4800

gatatcgcgc attacgtcgg cgctgccgtc agccgcgtag atatgggaga tgagatcgtg 4860

gccgaaatcg tgcttgtatg gcgtccacgg ggtcacggtg tgaccggctt tggcgagtgc 4920

ggcgacggtg gtttccacgc cgcgcaggat aggagggtgt ggaaggacat tgccgtcgaa 4980

gttgtagtag ccgatattga gcccgccgtt cttgatcttg gaggcaataa tgtccgactc 5040

ggactggcgc cagggcatgg ggatgacctt ggagtcgtat ttccaaggct cctgaccgag 5100

gacggatttg gtgaagaggc ggaggtctaa catacttcat cagtgactgc cggtctcgta 5160

tatagtataa aaagcaagaa aggaggacag tggaggcctg gtatagagca ggaaaagaag 5220

gaagaggcga aggactcacc ctcaacagag tgcgtaatcg gcccgacaac gctgtgcacc 5280

gtctcctgac cctccatgct gttcgccatc tttgcatacg gcagccgccc atgactcggc 5340

cttagaccgt acaggaagtt gaacgcggcc ggcactcgaa tcgagccacc gatatccgtt 5400

cctacaccga tgacgccacc acgaatccca acgatcgcac cctcaccacc agaactgccg 5460

ccgcacgacc agttcttgtt gcgtgggttg acggtgcgcc cgatgatgtt gttgactgtc 5520

tcgcagacca tcagggtctg cgggacagag gtcttgacgt agaagacggc accggctttg 5580

cggagcatgg ttgtcagaac cgagtcccct tcgtcgtact tgtttagcca tgagatgtag 5640

cccattgatg tttcgtagcc ctggtggcat atgttagctg acaaaaaggg acatctaacg 5700

acttaggggc aacggtgtac cttgactcga agctggtctt tgagagagat ggggaggcca 5760

tgaagtggac caacgggtct cttgtgcttt gcgtagtatt catcgagttc ccttgcctgc 5820

gcgagagcgg cgtcagggaa gaactcgtgg gcgcagtttg tctgcacaga agccagcgtc 5880

agcttgatag tcccataagg tggcgttgtt acatctccct gagaggtaga ggggacccta 5940

ctaactgctg ggcgattgct gcccgtttac agaatgctag cgtaacttcc accgaggtca 6000

actctccggc cgccagcttg gacacaagat ctgcagcgga ggcctctgtg atcttcagtt 6060

cggcctctga aaggatcccc gatttctttg ggaaatcaat aacgctgtct tccgcaggca 6120

gcgtctggac tttccattca tcagggatgg tttttgcgag gcgggcgcgc ttatcagcgg 6180

ccagttcttc ccaggattga ggcattctgt gttagcttat agtcaggatg ttggctcgac 6240

gagtgtaaac tgggagttgg catgagggtt atgtaggctt ctttagcccc gcatccccct 6300

cattctcctc attgatcccg ggggagcgga tggtgttgat aagagactaa ttatagggtt 6360

tagctggtgc ctagctggtg attggctggc ttcgccgaat tttacgggcc aaggaaagct 6420

gcagaaccgc ggcactggta aacggtaatt aagctatcag ccccatgcta acgagtttaa 6480

attacgtgta ttgctgataa acaccaacag agctttactg aaagatggga gtcacggtgt 6540

ggcttcccca ctgcgattat tgcacaagca gcgagggcga acttgactgt cgtcgctgag 6600

cagcctgcag tcaaacatac atatatatca accgcgaaga cgtctggcct tgtagaacac 6660

gacgctccct agcaacacct gccgtgtcag cctctacggt tgttacttgc attcaggatg 6720

ctctccagcg ggcgagctat tcaaaatatt caaagcaggt atctcgtatt gccaggattc 6780

agctgaagca acaggtgcca aggaaatctg cgtcggttct catctgggct tgctcggtcc 6840

tggcgtagac aagggcgaat tctgcattga agttcctatt ccgagttcct attcttcaaa 6900

tagtatagga acttcaacta gctagtgcat gcggttgaag ggcttgtgtt ctttggctct 6960

gtagaggctc tagggggttg gattgggctg actatggtct cccctttgta tgctacacac 7020

tgatcagacg atcgtagtca gttgagagat gagcttcatt ggtcgatatg agtgctttga 7080

gactggacac ttgcgtgact gcatgttccg tttcttgtga taattgccgt gaagatgtgt 7140

ctgctggtat gacgacaaag tagcatcagc agcaaagtat ggcgaggact actaggccca 7200

agatattgtc ggcttcgtca aagtgagaaa ttttagggtc tccattgatt acattcatcc 7260

gtttcagaag cacgatatag aggagtagca ccatcaggtc ggaaaggtcg tcaacagctt 7320

gaacaagtca tactaaggta tgttagtgtg gtcgtggttg tcggtatcag taggtatcat 7380

tggagtatgt gttatataca gattaatggg accaatgcat cacgcatcag gacatgccct 7440

ggcaatcctc cctcttacaa atcgcgatga ggcttgggtt tgggggtaat agtagcggtc 7500

gtaaaggtgg tggtgccagt agcgcacacg cagccctggc cggaaatgct ggtaatggga 7560

ggagatttgc aggtgggctc ggtggtaaag gaggcgtagg tgctggtggg ctcaaccgtg 7620

ggctcaacca gctcagcctt gaccaggacg gggatgatct ggcctgtgga caggctgaag 7680

gagcggtggt tgagcacggt gagaatggcg ccaatctcgc ccgagtggct ggtgatgcta 7740

atccaggtgt tgtcgtcgtg cgaaaagacg tcgtcaatcg cctccttgga acgggcgacc 7800

tggtgagcag gcgtctcgcc ctcgtcctct ttgccgcgcc acagcaggtc ctcctcggtg 7860

aagccagcct cgaactcaaa gttgggagcg taggcgtgaa tctgagactt ggtggagcgg 7920

cggtcgcagg tgtggatgct gatgctctcg cgaaacagct ccttgatgac gggtttgaag 7980

gggtgtgagc gaggtagctt ctggttggca aaggtgaatt gggccgtctg gaggcagcgc 8040

ttgagaggcg agctgtagta cgactcaaaa aaggggaggc cttcctgctc gaagcgcgac 8100

ttgaagtagg cgttggcctt ggtagtctgc tgaatgccgt tgggggtcag ttcagggtca 8160

gcccaggtgg aagtgccgtt gccatcttgc tcggcccagt agcactatgg aagcgtaagt 8220

cagcagctgt ttgagcaacg aagaggagat ttgtcgaggc tcacattcca ggcgggagtg 8280

ccgtaaaagc tttcggcagt gttgtgccat ccctcgccgt ggcggcccat gaagagcacc 8340

ttgtaggtgc tcttgtcctc cttgcggcac tcgctgttga gcgactcgac gtagtgggcg 8400

aagcgctgcc actgggtctt cctgtggtga ggatcgaacc tggcatctgt ggggtaggtc 8460

ctgttgatga gaccaaagtt gaaggcggcc tgtgtcaagc aaagcgtgag tcggagtctc 8520

taaccagagc ggcacagatg ctggcaacac ctacatagtc gaagctgccg gggtcagtgc 8580

tcgggtcgtc ctggaggaag aagcccggaa ccgacgagta cttgatgtcg tcgcagtcgg 8640

agacgtgctt ccaggccacg gcgccgcgag cgagcgccag ggcgacggac agcagagagg 8700

ccttcatctt ggcgataatg aggatgtaga tgaagacgaa gaggaggcag aggctcagac 8760

tcgttggctg cgacggaaga caggcgtcct agagagcaac gtcatgtcga tcccggggcg 8820

acgcagcgac ttatatgtct gaacctgtcc agctgctctc tcctgcatgc gacgttgaga 8880

cactcgcaac aggctggtga acaccaggat gtaaccagtc gacagggctg ggaggctgca 8940

cccgctgcgc cagatggagc ctgtcagtgc tgctctgggg cctctgtcag cacttg 8996

<210> 17

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ587

<400> 17

gtaaaacgac ggccagtgaa ttcgagctcg tttaaacgtg ctggacctgc taaggaggaa 60

g 61

<210> 18

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ605

<400> 18

ctgggctgcc cgtgaagccg tttaaatgaa ctacctgtgg cattcatttt gctgg 55

<210> 19

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ606

<400> 19

gcactgtttc ttccttgaac tctcagatct gtggtttgtc cattgggttc tcg 53

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ607

<400> 20

gcgtgtactt cttgagccct gccagctacc tgtggcattc attttgctgg 50

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ608

<400> 21

ggtagctggc agggctcaag aagtacacg 29

<210> 22

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ609

<400> 22

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgtttaaa ccactcgata tccacgcatg 60

cac 63

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ610

<400> 23

aggtagttca tttaaacggc ttcacgggca g 31

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ611

<400> 24

gaacccaatg gacaaaccac agatctgaga gttcaaggaa gaaacagtgc 50

<210> 25

<211> 963

<212> DNA

<213> 镶片镰孢

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(960)

<400> 25

atg gaa gaa ttg ata cac caa tcc atc gat ctg atg tcg att ttg aca 48

Met Glu Glu Leu Ile His Gln Ser Ile Asp Leu Met Ser Ile Leu Thr

1 5 10 15

cca gca caa tgg tgt cag act ttc ttc gcc ctt tct acg gcc atc gtc 96

Pro Ala Gln Trp Cys Gln Thr Phe Phe Ala Leu Ser Thr Ala Ile Val

20 25 30

ctt ggt atc caa gcc ctc cca caa gat gtt cgc agc gct ctc atg gac 144

Leu Gly Ile Gln Ala Leu Pro Gln Asp Val Arg Ser Ala Leu Met Asp

35 40 45

tac ggc gcc cga aga ccc aaa gat gcg aaa cac gga aag gag caa gaa 192

Tyr Gly Ala Arg Arg Pro Lys Asp Ala Lys His Gly Lys Glu Gln Glu

50 55 60

gaa aac gga cag aaa gct ctc gtg cct ctg agg tca ttt atg aag aat 240

Glu Asn Gly Gln Lys Ala Leu Val Pro Leu Arg Ser Phe Met Lys Asn

65 70 75 80

tta aca gag tac ggg caa gtg ccc cat tca tgg ttc ttg cac ttt tac 288

Leu Thr Glu Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Leu His Phe Tyr

85 90 95

att gtt tcg gtg gcc ctg tcg ggt ttc tgg gcg tgg cag tat ctc act 336

Ile Val Ser Val Ala Leu Ser Gly Phe Trp Ala Trp Gln Tyr Leu Thr

100 105 110

caa ggt cat gta ctg aaa agc att gtg acg tgg cag aat cga gct gat 384

Gln Gly His Val Leu Lys Ser Ile Val Thr Trp Gln Asn Arg Ala Asp

115 120 125

gga ccg tcc atg agc ctg gag caa att ttc gtg gca tgg ttg ctc atg 432

Gly Pro Ser Met Ser Leu Glu Gln Ile Phe Val Ala Trp Leu Leu Met

130 135 140

gcg ttg cag ggt tcg aga agg ctt tac gag agt ttg ttt gtg ttc aag 480

Ala Leu Gln Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Ser Leu Phe Val Phe Lys

145 150 155 160

cca ggg tca tca cct atg tgg ttt att cat tgg gca ctt ggt ctt tcg 528

Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Ile His Trp Ala Leu Gly Leu Ser

165 170 175

tac tac att gca atg agc ctt gct gtc tgg gtc gag ggt tcc agc gcc 576

Tyr Tyr Ile Ala Met Ser Leu Ala Val Trp Val Glu Gly Ser Ser Ala

180 185 190

att tta gca gcc tgg gat tct ccc tat caa cct ctc cgg gtt cca cga 624

Ile Leu Ala Ala Trp Asp Ser Pro Tyr Gln Pro Leu Arg Val Pro Arg

195 200 205

cgg cta cct tca gcc cta gcg tta tat ttc gtg gct tac ttc aag caa 672

Arg Leu Pro Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Phe Val Ala Tyr Phe Lys Gln

210 215 220

aac caa tgt cac aga cac ttg gca agc ctc aag aag tat acc ctc cca 720

Asn Gln Cys His Arg His Leu Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro

225 230 235 240

agt gag gga tgg ttc aag tat ata atc tgt cca cac tat act tta gaa 768

Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Ile Ile Cys Pro His Tyr Thr Leu Glu

245 250 255

tgc ctt gtg tac ctt gcc att gca tgg atc gct gca cca cac ggc caa 816

Cys Leu Val Tyr Leu Ala Ile Ala Trp Ile Ala Ala Pro His Gly Gln

260 265 270

atc ttc aac aaa agt atc ttg ggc gct gtc atg ttt gtg gct gtg aat 864

Ile Phe Asn Lys Ser Ile Leu Gly Ala Val Met Phe Val Ala Val Asn

275 280 285

ctc ggt gcc acg gca aag ggc acc aag gta tgg tat gag cag aaa ttc 912

Leu Gly Ala Thr Ala Lys Gly Thr Lys Val Trp Tyr Glu Gln Lys Phe

290 295 300

ggt gca aac aag gtc gct ggg cgg tgg ctc atg atc ccg cct gtc tac 960

Gly Ala Asn Lys Val Ala Gly Arg Trp Leu Met Ile Pro Pro Val Tyr

305 310 315 320

tag 963

<210> 26

<211> 320

<212> PRT

<213> 镶片镰孢

<400> 26

Met Glu Glu Leu Ile His Gln Ser Ile Asp Leu Met Ser Ile Leu Thr

1 5 10 15

Pro Ala Gln Trp Cys Gln Thr Phe Phe Ala Leu Ser Thr Ala Ile Val

20 25 30

Leu Gly Ile Gln Ala Leu Pro Gln Asp Val Arg Ser Ala Leu Met Asp

35 40 45

Tyr Gly Ala Arg Arg Pro Lys Asp Ala Lys His Gly Lys Glu Gln Glu

50 55 60

Glu Asn Gly Gln Lys Ala Leu Val Pro Leu Arg Ser Phe Met Lys Asn

65 70 75 80

Leu Thr Glu Tyr Gly Gln Val Pro His Ser Trp Phe Leu His Phe Tyr

85 90 95

Ile Val Ser Val Ala Leu Ser Gly Phe Trp Ala Trp Gln Tyr Leu Thr

100 105 110

Gln Gly His Val Leu Lys Ser Ile Val Thr Trp Gln Asn Arg Ala Asp

115 120 125

Gly Pro Ser Met Ser Leu Glu Gln Ile Phe Val Ala Trp Leu Leu Met

130 135 140

Ala Leu Gln Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Ser Leu Phe Val Phe Lys

145 150 155 160

Pro Gly Ser Ser Pro Met Trp Phe Ile His Trp Ala Leu Gly Leu Ser

165 170 175

Tyr Tyr Ile Ala Met Ser Leu Ala Val Trp Val Glu Gly Ser Ser Ala

180 185 190

Ile Leu Ala Ala Trp Asp Ser Pro Tyr Gln Pro Leu Arg Val Pro Arg

195 200 205

Arg Leu Pro Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Phe Val Ala Tyr Phe Lys Gln

210 215 220

Asn Gln Cys His Arg His Leu Ala Ser Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro

225 230 235 240

Ser Glu Gly Trp Phe Lys Tyr Ile Ile Cys Pro His Tyr Thr Leu Glu

245 250 255

Cys Leu Val Tyr Leu Ala Ile Ala Trp Ile Ala Ala Pro His Gly Gln

260 265 270

Ile Phe Asn Lys Ser Ile Leu Gly Ala Val Met Phe Val Ala Val Asn

275 280 285

Leu Gly Ala Thr Ala Lys Gly Thr Lys Val Trp Tyr Glu Gln Lys Phe

290 295 300

Gly Ala Asn Lys Val Ala Gly Arg Trp Leu Met Ile Pro Pro Val Tyr

305 310 315 320

<210> 27

<211> 10371

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pNJOC569

<400> 27

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcgtt taaacgtgct 420

ggacctgcta aggaggaagt tttttttggg acggaaaagc ctggtgaggc atgaagatgg 480

agagagtttt cggtgtgtga ggatttcgag tatcatggaa aaagaaggaa ttcaagtttg 540

taacagaaag atgtttaatg gttgatttgc gaacatgata gacgtccaaa tttcataatc 600

ttttgcaatt gagccttgga gatattacga aaatgagatg tgagatctcg aaatgttgag 660

gaatattcat gcctggttac acctgccgtc gttgtcatgc cactcgggcg ggcaggagca 720

tccatgcttc gcctagcacc aaggattggc aaccgccaga tggatcatga cggcaggatt 780

ccttgaatcg gttctagacc tttttgtgca cgtgccttag ctataagcca acgacttgca 840

aagcggaagg cagcacctgg gcatggctgg gaaagaagct tgaagcatgc gccttgctgt 900

tgccttcgct tggttgatgt tatcggggca acttgcttga gacattggtc gcacttgccg 960

acctgtgaat aggcaagaca tatttcgtca gtagtaccta cccagcgtaa gggatttcac 1020

gaggaagaag gtgagtcatc gggttcaaat gctgtactac ctcttgatgg agttgcagat 1080

actatcacga gcttgtgtgc tactattctg ttggaattcg gtctcttata ccgtccactc 1140

ggttcagcac tgtacgaaca acgtcttcat gctgcaacac tggtccatac atcctttgca 1200

tccgtcggtc aatcctgcat cgcctcatac caagtccctc ctcgtggaac caagccctct 1260

catcctcctt gtctcccagc tcttctcaag ccatcaaatc ccaactgcaa catggaactt 1320

gaagttgctg tgaagcaagc gccaatacga cgaatccacc gcccaatcaa aaccccacag 1380

cagtgcaacg ccacctcagc gtcaattaga ctacggattg gccgtcaagc cgtgtatcgt 1440

attgctggtt gccaagagcc tcagtcacaa gttcaaaaag caagcaaata cgcattctct 1500

ctccttccag tggcaatcca tgatttcatt gaagccatgt tctggtagta ggatctatgc 1560

gagctgcaga gaagtttctc cgcactccat atctgctgca atggccggca atcaagtaaa 1620

tgcaccgaga gtcgttggtt caagggacgg agcaatgtgc cgattttggg accacaagag 1680

cggcggctca gcatgcaggc gaccaaattt cgcacaattg tgcttctcct tggtaggggc 1740

atatcactcc acgcctggct ttggcagtgc aattcggcag ctttcaacca gcgcaacgaa 1800

tgtctgccct ttcatccctt cctgagtcat tttctcccat tcactttatc tggcccctca 1860

atctctaagg tcttgttctt gtggcctggc tgaaccttgc ctcgccgcat cacgccagcc 1920

gcttgaattc acaacttcat ttaaacggct tcacgggcag cccagcggtc gatttcgctt 1980

ccaaattttg ggggaaaggg tccctgagca gcctcacaaa cgcaaacatg cgcacgcgcc 2040

acacggaaaa tgaagctgac tttgaatttt taagaatccc ctttgcccgt ggcaccttct 2100

gatttttgtc ttcgtgtcca atccatctcc ttgaacgaca acccagccct ttctatttcc 2160

tatcccctaa tatctaatgt gagtcctcat cgtcacagac ggcgacggac gcgacatttc 2220

gcccgtgctc atcgaccgct ctgctgtcgc caacagaaca cgcggttatg tcgcgttccg 2280

ctttgtcgta ccactttcgc cccacaccgc tgacctcgcg ttcccagcat gaaaaagcct 2340

gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac 2400

ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt 2460

ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat 2520

cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggagttcagc 2580

gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct 2640

gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg 2700

gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac 2760

actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact 2820

gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg 2880

gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc 2940

ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat 3000

tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag 3060

cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg 3120

tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat 3180

gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc 3240

gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta 3300

ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaggaa tagtaaatga 3360

ttcgttagtt ctttcctgaa ctgatgattc gcgcgattcg tatttctctt tgttggttgt 3420

tctgatgatg atgaaaatga cgcatctctt tatttgctgc actcgtacac ccatcctttg 3480

gaatgattaa tacccctcct ttttcatcgc ggacggtagt cgttctcttt ggggccgtgt 3540

ttcttcccat tcgcatgcga cctcgtggtc attgactgtc tgtcctcttc ctctccacct 3600

acctccacca cctacgttga ctgcatatca ctttttcaaa cattcatgat aatacgctac 3660

cttctggcat gaccttttga tgatcgcttt ttactatcct ttcaattacg atgttgtcac 3720

ttctatttgt cattttgcgg aattagtatt ttctttccat cttcgatgga gagatgaata 3780

ttgggtaccc caagggcgta gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattcgccc 3840

ttggccgact actagatcga ccggtgactc tttctggcat gcggagagac ggacggacgc 3900

agagagaagg gctgagtaat aagcgccact gcgccagaca gctctggcgg ctctgaggtg 3960

cagtggatga ttattaatcc gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg aaaggctggt 4020

gtgcccctcg ttgaccaaga atctattgca tcatcggaga atatggagct tcatcgaatc 4080

accggcagta agcgaaggag aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg cgaaatagca 4140

tgccattaac ctaggtacag aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga ttcacgagat 4200

agtaccttct ccgaagtagg tagagcgagt acccggcgcg taagctccct aattggccca 4260

tccggcatct gtagggcgtc caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg tgtatgaaac 4320

cggaaaggcc gctcaggagc tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc tggcagtcga 4380

cccatccggt gctctgcact cgacctgctg aggtccctca gtccctggta ggcagctttg 4440

ccccgtctgt ccgcccggtg tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc agtccaacat 4500

ttgttgccat attttcctgc tctccccacc agctgtagat cgatcttggt ggcgtgaaac 4560

tcccgcacct cttcggccag cgccttgtag aagcgcgtat ggcttcgtac cccggccatc 4620

aacacgcgtc tgcgttcgac caggctgcgc gttctcgcgg ccatagcaac cgacgtacgg 4680

cgttgcgccc tcgccggcag caagaagcca cggaagtccg cccggagcag aaaatgccca 4740

cgctactgcg ggtttatata gacggtcccc acgggatggg gaaaaccacc accacgcaac 4800

tgctggtggc cctgggttcg cgcgacgata tcgtctacgt acccgagccg atgacttact 4860

ggcgggtgct gggggcttcc gagacaatcg cgaacatcta caccacacaa caccgcctcg 4920

accagggtga gatatcggcc ggggacgcgg cggtggtaat gacaagcgcc cagataacaa 4980

tgggcatgcc ttatgccgtg accgacgccg ttctggctcc tcatatcggg ggggaggctg 5040

ggagctcaca tgccccgccc ccggccctca ccctcatctt cgaccgccat cccatcgccg 5100

ccctcctgtg ctacccggcc gcgcggtacc ttatgggcag catgaccccc caggccgtgc 5160

tggcgttcgt ggccctcatc ccgccgacct tgcccggcac caacatcgtg cttggggccc 5220

ttccggagga cagacacatc gaccgcctgg ccaaacgcca gcgccccggc gagcggctgg 5280

acctggctat gctggctgcg attcgccgcg tttacgggct acttgccaat acggtgcggt 5340

atctgcagtg cggcgggtcg tggcgggagg actggggaca gctttcgggg acggccgtgc 5400

cgccccaggg tgccgagccc cagagcaacg cgggcccacg accccatatc ggggacacgt 5460

tatttaccct gtttcggggc cccgagttgc tggcccccaa cggcgacctg tataacgtgt 5520

ttgcctgggc cttggacgtc ttggccaaac gcctccgttc catgcacgtc tttatcctgg 5580

attacgacca atcgcccgcc ggctgccggg acgccctgct gcaacttacc tccgggatgg 5640

tccagaccca cgtcaccacc cccggctcca taccgacgat atgcgacctg gcgcgcacgt 5700

ttgcccggga gatgggggag gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc 5760

cgcgctatcc ggatcgatcc acttaacgtt actgaaatca tcaaacagct tgacgaatct 5820

ggatataaga tcgttggtgt cgatgtcagc tccggagttg agacaaatgg tgttcaggat 5880

ctcgataaga tacgttcatt tgtccaagca gcaaagagtg ccttctagtg atttaatagc 5940

tccatgtcaa caagaataaa acgcgtttcg ggtttacctc ttccagatac agctcatctg 6000

caatgcatta atgcattgga cctcgcaacc ctagtacgcc cttcaggctc cggcgaagca 6060

gaagaatagc ttagcagagt ctattttcat tttcgggaga cgagatcaag cagatcaacg 6120

gtcgtcaaga gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg ctccacgcga ctatatattt 6180

gtctctaatt gtactttgac atgctcctct tctttactct gatagcttga ctatgaaaat 6240

tccgtcacca gcccctgggt tcgcaaagat aattgcactg tttcttcctt gaactctcag 6300

atctcaaggg acggagcaat gtgccgattt tgggaccaca agagcggcgg ctcagcatgc 6360

aggcgaccaa atttcgcaca attgtgcttc tccttggtag gggcatatca ctccacgcct 6420

ggctttggca gtgcaattcg gcagctttca accagcgcaa cgaatgtctg ccctttcatc 6480

ccttcctgag tcattttctc ccattcactt tatctggccc ctcaatctct aaggtcttgt 6540

tcttgtggcc tggctgaacc ttgcctcgcc gcatcacgcc agccgcttga attcacaact 6600

aagctactga gcaattcggg aaaacgggtt agagcacgct ctcatcgctt gccgaagagg 6660

cctaatttgg ctccgacttt ggacacttgg aggacgtctc ggtatgtgag gctggtgcgg 6720

gtctgtctcg ggttccgacc gccagcaaac gcctcgggat ctcgaagcaa gggccagttc 6780

acaatggtgt cggcagatag atcaagatcc tcctcagcgt cggcgatgcc atgcagatag 6840

tccgtataga ggttggctgt ggtgatgaga agactacgag gttcttggag aatgcgccag 6900

gcaggctcgg gatcaagggc gccgtcctcc ttgctgcggt acaggttcag gcagagactc 6960

gcgccgaggc tgacggtgca caccacgggc caatacgcag cgccatccta gggtggatga 7020

gcatttcgaa gctgtcaagg attcttcaac tacgtttcca taacacttaa cttatgcggc 7080

atgatgccga ttcccggagg atactcgttg ataaggacgt gattcgggcg ctggtggggg 7140

ctttcggcga agatgtgctt gggagagtca ccgtcgtcgg agagcggaag ggacagtagc 7200

cgcggcacaa tgggggtctc aagccaagag ggcagcggtg cgtcgaggag cctgttgttg 7260

acgaggtccg acggccaggt ctggagccgt cgatgggtga gctgtttcca tcgtggacga 7320

ggagccgcgg cgatctgtga ggaaaaaaaa aagcgtgtgc tgtgatcagc agggctgcag 7380

gcggagacga ccggcaccat ggacggcacc ggccacggcg gcaagacgca ctttgtcaag 7440

aatcaggcgc tcctcttcct cgctgatgaa gtttggcaag tagtaggccg tcgagggcag 7500

cgaggcgatt cgggcggctt cgagagacga gggcagccac gcgtcgccgg tgcctcgagc 7560

tgccatgatt gaaggtatgt aggtaggtat ctatgcacgg ctcgggcagg caggcaggca 7620

ggcaggcaga cagacagaca gacagacagc tgcagtgagt tgcaggagga gagctgcctt 7680

gacagcgcca agagtgagcc caccagtgag cgagaaggca gcctggctcg gaatcagatg 7740

gggggtcgag agggcggacg gattgcgaga gaagaagcga tcaaatggtc gtaagagggg 7800

gatgatgggg tgatgatcca gcgaatggcc gtatcgagtt aggagggggg ctgcagcgcc 7860

tgtttgctct cgcagcagca cgacttgaac agcgaggtgc cggttagggc tagccgggca 7920

ttaatgcctt ttgtcctacc aaggttgcat ggcgcatgtg ctgcgcgagc tgttcggtcg 7980

gtggcctcgt tatcggcgtg cagcgtctgg tcggtccagc tgcttgttgc tcgaaagggg 8040

ggaggcgtcg tgtctctgcc gtctgcggga ggcggactgg gccaggcctg accgggtcat 8100

cgatggatgg attgaatgga ctggtttaaa caagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 8160

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 8220

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 8280

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 8340

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 8400

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 8460

ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 8520

ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 8580

atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 8640

aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 8700

gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 8760

ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 8820

ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 8880

acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 8940

gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 9000

ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 9060

ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 9120

gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 9180

ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 9240

agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 9300

ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 9360

gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 9420

catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 9480

cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 9540

cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 9600

gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 9660

tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 9720

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 9780

tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 9840

gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 9900

gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 9960

taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 10020

tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 10080

ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 10140

taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 10200

tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 10260

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 10320

ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 10371

<210> 28

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ588

<400> 28

ctgggctgcc cgtgaagccg tttaaatgaa gttgtgaatt caagcggctg gc 52

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ595

<400> 29

cacaacttca tttaaacggc ttcacgggca g 31

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ596

<400> 30

cccaaaatcg gcacattgct ccgtcccttg agatctgaga gttcaaggaa gaaacagtgc 60

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ592

<400> 31

gcactgtttc ttccttgaac tctcagatct caagggacgg agcaatgtgc 50

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ593

<400> 32

cccgttttcc cgaattgctc agtagcttag ttgtgaattc aagcggctgg 50

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ589

<400> 33

cacaactaag ctactgagca attcgggaaa acgg 34

<210> 34

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ590

<400> 34

ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttgtttaaa ccagtccatt caatccatcc 60

atcgatg 67

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ632

<400> 35

cagccaagaa gtgctcggct c 21

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AgJg685

<400> 36

ctacatcgaa gctgaaagca cgaga 25

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oNJ633

<400> 37

gatgtggtgc tgcagccagc 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AgJg604

<400> 38

gggacgccct gctgcaactt acc 23

<210> 39

<211> 10679

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTmmD-Tl_脂肪酶：疏棉状嗜热丝孢菌HL703脂肪酶变体表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点

<400> 39

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 60

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 120

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 180

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttgtttaaac 240

gcggccgcga attcatcttg aagttcctat tccgagttcc tattctctag aaagtatagg 300

aacttcgcta gccgagagca gccgaatgta ggattgttat ccgaactctg ctcgtagagg 360

catgttgtga atctgtgtcg ggcaggacac gcctcgaagg ttcacggcaa gggaaaccac 420

cgatagcagt gtctagtagc aacctgtaaa gccgcaatgc agcatcactg gaaaatacaa 480

accaatggct aaaagtacat aagttaatgc ctaaagaagt catataccag cggctaataa 540

ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta atttgccaac ggcttgtggg gttgcagaag 600

caacggcaaa gccccacttc cccacgtttg tttcttcact cagtccaatc tcagctggtg 660

atcccccaat tgggtcgctt gtttgttccg gtgaagtgaa agaagacaga ggtaagaatg 720

tctgactcgg agcgttttgc atacaaccaa gggcagtgat ggaagacagt gaaatgttga 780

cattcaagga gtatttagcc agggatgctt gagtgtatcg tgtaaggagg tttgtctgcc 840

gatacgacga atactgtata gtcacttctg atgaagtggt ccatattgaa atgtaagtcg 900

gcactgaaca ggcaaaagat tgagttgaaa ctgcctaaga tctcgggccc tcgggccttc 960

ggcctttggg tgtacatgtt tgtgctccgg gcaaatgcaa agtgtggtag gatcgaacac 1020

actgctgcct ttaccaagca gctgagggta tgtgataggc aaatgttcag gggccactgc 1080

atggtttcga atagaaagag aagcttagcc aagaacaata gccgataaag atagcctcat 1140

taaacggaat gagctagtag gcaaagtcag cgaatgtgta tatataaagg ttcgaggtcc 1200

gtgcctccct catgctctcc ccatctactc atcaactcag atcctccagg agacttgtac 1260

accatctttt gaggcacaga aacccaatag tcaaccgcgg actgcgcaca tgaagttctt 1320

caccaccatc ctcagcaccg ccagccttgt tgctgctctc cccgccgctg ttgactcgaa 1380

ccataccccg gccgctcctg aacttgttgc ccggagtcct attcgtcgag aggtctcgca 1440

ggatctgttt aaccagttca atctctttgc acagtattct gcagccgcat actgcggaaa 1500

aaacaatgat gccccagctg gtacaaacat tacgtgcacg ggaaatgcct gccccgaggt 1560

agagaaggcg gatgcaacgt ttctctactc gtttgaagac tctggagtgg gcgatgtcac 1620

cggcttcctt gctctcgaca acacgaacaa attgatcgtc ctctctttcc gtggctctcg 1680

ttccatagag aactggatcg ggaatcttaa cttcgacttg aaagaaataa atgacatttg 1740

ctccggctgc aggggacatg acggcttcac ttcgtcctgg aggtctgtag ccgatacgtt 1800

aaggcagaag gtggaggatg ctgtgaggga gcatcccgac tatcgcgtgg tgtttaccgg 1860

acatagcttg ggtggtgcat tggcaactgt tgccggagca gacctgcgtg gaaatgggta 1920

tgatatcgac gtgttttcat atggcgcccc ccgagtcgga aacagggctt ttgcagaatt 1980

cctgaccgta cagaccggcg gaacactcta ccgcattacc cacaccaatg atattgtccc 2040

tagactcccg ccgcgcgaat tcggttacag ccattctagc ccagaatact ggatcaaatc 2100

tggaaccctt gtccccgtcc ggcgacgaga catcgtgaag atagaaggca tcgatgccac 2160

cggcggcaat aaccagccta acattccgga tatccctgcg cacctatggt acttcgggtt 2220

aattgggaca tgtctttagt aagctccgtg gcgaaagcct gacgcaccgg tagattcttg 2280

gtgagcccgt atcatgacgg cggcgggagc tacatggccc cgggtgattt attttttttg 2340

tatctacttc tgaccctttt caaatatacg gtcaactcat ctttcactgg agatgcggcc 2400

tgcttggtat tgcgatgttg tcagcttggc aaattgtggc tttcgaaaac acaaaacgat 2460

tccttagtag ccatgcatca agcttggtac cgagctctgg aaacgcaacc ctgaagggat 2520

tcttcctttg agagatggaa gcgtgtcata tctcttcggt tctacggcag gtttttttct 2580

gctctttcgt agcatggcat ggtcacttca gcgcttattt acagttgctg gtattgattt 2640

cttgtgcaaa ttgctatctg acacttatta gctatggagt caccacattt cccagcaact 2700

tccccacttc ctctgcaatc gccaacgtcc tctcttcact gagtctccgt ccgataacct 2760

gcactgcaac cggtgcccca tgatacgcct ccggatcata ctcttcctgc acgagggcat 2820

caagctcact aaccgccttg aaactctcat tcttcttatc gatgttctta tccgcaaagg 2880

taaccggaac aaccacgctc gtgaaatcca gcaggttgat cacagaggca tacccatagt 2940

accggaactg gtcatgccgt accgcagcgg taggcgtaat cggcgcgatg atggcgtcca 3000

gttccttccc ggccttttct tcagcctccc gccatttctc aaggtactcc atctggtaat 3060

tccacttctg gagatgcgtg tcccagagct cgttcatgtt aacagctttg atgttcgggt 3120

tcagtaggtc tttgatattt ggagtcgccg gctcgccgga tgcactgata tcgcgcatta 3180

cgtcggcgct gccgtcagcc gcgtagatat gggagatgag atcgtggccg aaatcgtgct 3240

tgtatggcgt ccacggggtc acggtgtgac cggctttggc gagtgcggcg acggtggttt 3300

ccacgccgcg caggatagga gggtgtggaa ggacattgcc gtcgaagttg tagtagccga 3360

tattgagccc gccgttcttg atcttggagg caataatgtc cgactcggac tggcgccagg 3420

gcatggggat gaccttggag tcgtatttcc aaggctcctg accgaggacg gatttggtga 3480

agaggcggag gtctaacata cttcatcagt gactgccggt ctcgtatata gtataaaaag 3540

caagaaagga ggacagtgga ggcctggtat agagcaggaa aagaaggaag aggcgaagga 3600

ctcaccctca acagagtgcg taatcggccc gacaacgctg tgcaccgtct cctgaccctc 3660

catgctgttc gccatctttg catacggcag ccgcccatga ctcggcctta gaccgtacag 3720

gaagttgaac gcggccggca ctcgaatcga gccaccgata tccgttccta caccgatgac 3780

gccaccacga atcccaacga tcgcaccctc accaccagaa ctgccgccgc acgaccagtt 3840

cttgttgcgt gggttgacgg tgcgcccgat gatgttgttg actgtctcgc agaccatcag 3900

ggtctgcggg acagaggtct tgacgtagaa gacggcaccg gctttgcgga gcatggttgt 3960

cagaaccgag tccccttcgt cgtacttgtt tagccatgag atgtagccca ttgatgtttc 4020

gtagccctgg tggcatatgt tagctgacaa aaagggacat ctaacgactt aggggcaacg 4080

gtgtaccttg actcgaagct ggtctttgag agagatgggg aggccatgaa gtggaccaac 4140

gggtctcttg tgctttgcgt agtattcatc gagttccctt gcctgcgcga gagcggcgtc 4200

agggaagaac tcgtgggcgc agtttgtctg cacagaagcc agcgtcagct tgatagtccc 4260

ataaggtggc gttgttacat ctccctgaga ggtagagggg accctactaa ctgctgggcg 4320

attgctgccc gtttacagaa tgctagcgta acttccaccg aggtcaactc tccggccgcc 4380

agcttggaca caagatctgc agcggaggcc tctgtgatct tcagttcggc ctctgaaagg 4440

atccccgatt tctttgggaa atcaataacg ctgtcttccg caggcagcgt ctggactttc 4500

cattcatcag ggatggtttt tgcgaggcgg gcgcgcttat cagcggccag ttcttcccag 4560

gattgaggca ttctgtgtta gcttatagtc aggatgttgg ctcgacgagt gtaaactggg 4620

agttggcatg agggttatgt aggcttcttt agccccgcat ccccctcatt ctcctcattg 4680

atcccggggg agcggatggt gttgataaga gactaattat agggtttagc tggtgcctag 4740

ctggtgattg gctggcttcg ccgaatttta cgggccaagg aaagctgcag aaccgcggca 4800

ctggtaaacg gtaattaagc tatcagcccc atgctaacga gtttaaatta cgtgtattgc 4860

tgataaacac caacagagct ttactgaaag atgggagtca cggtgtggct tccccactgc 4920

gattattgca caagcagcga gggcgaactt gactgtcgtc gctgagcagc ctgcagtcaa 4980

acatacatat atatcaaccg cgaagacgtc tggccttgta gaacacgacg ctccctagca 5040

acacctgccg tgtcagcctc tacggttgtt acttgcattc aggatgctct ccagcgggcg 5100

agctattcaa aatattcaaa gcaggtatct cgtattgcca ggattcagct gaagcaacag 5160

gtgccaagga aatctgcgtc ggttctcatc tgggcttgct cggtcctggc gtagacaagg 5220

gcgaattctg cattgaagtt cctattccga gttcctattc ttcaaatagt ataggaactt 5280

cagatatcca tcacactggg agtaccattt aattctattt gtgtttgatc gagacctaat 5340

acagccccta caacgaccat caaagtcgta tagctaccag tgaggaagtg gactcaaatc 5400

gacttcagca acatctcctg gataaacttt aagcctaaac tatacagaat aagatggtgg 5460

agagcttata ccgagctccc aaatctgtcc agatcatggt tgaccggtgc ctggatcttc 5520

ctatagaacc atccttattc gttgacctag ctgattctgg agtgacccag agggtcatga 5580

cttgagccta aaatccgccg cctccaccat ttgtagaaaa atgtgacgaa ctcgtgagct 5640

ctgtacagtg accggtgact ctttctggca tgcggagaga cggacggacg cagagagaag 5700

ggctgagtaa taagcgccac tgcgccagac agctctggcg gctctgaggt gcagtggatg 5760

attattaatc cgggaccggc cgcccctccg ccccgaagtg gaaaggctgg tgtgcccctc 5820

gttgaccaag aatctattgc atcatcggag aatatggagc ttcatcgaat caccggcagt 5880

aagcgaagga gaatgtgaag ccaggggtgt atagccgtcg gcgaaatagc atgccattaa 5940

cctaggtaca gaagtccaat tgcttccgat ctggtaaaag attcacgaga tagtaccttc 6000

tccgaagtag gtagagcgag tacccggcgc gtaagctccc taattggccc atccggcatc 6060

tgtagggcgt ccaaatatcg tgcctctcct gctttgcccg gtgtatgaaa ccggaaaggc 6120

cgctcaggag ctggccagcg gcgcagaccg ggaacacaag ctggcagtcg acccatccgg 6180

tgctctgcac tcgacctgct gaggtccctc agtccctggt aggcagcttt gccccgtctg 6240

tccgcccggt gtgtcggcgg ggttgacaag gtcgttgcgt cagtccaaca tttgttgcca 6300

tattttcctg ctctccccac cagctgctct tttcttttct ctttcttttc ccatcttcag 6360

tatattcatc ttcccatcca agaaccttta tttcccctaa gtaagtactt tgctacatcc 6420

atactccatc cttcccatcc cttattcctt tgaacctttc agttcgagct ttcccacttc 6480

atcgcagctt gactaacagc taccccgctt gagcagacat caccatgccc cagttcgata 6540

tcctctgcaa gacccccccc aaggtcctcg tccgccagtt cgtcgagcgc ttcgagcgcc 6600

cctccggcga gaagatcgcc ctctgcgccg ccgagctcac ctacctctgc tggatgatca 6660

cccataacgg caccgccatc aagcgcgcca ccttcatgtc ctacaacacc atcatctcca 6720

actccctctc cttcgatatc gtcaacaagt ccctccagtt caagtacaag acccagaagg 6780

ccaccatcct ggaggcctcc ctcaagaagc tcatccccgc ctgggagttc accatcatcc 6840

cctactacgg ccagaagcat cagtccgata tcaccgatat cgtctcctcc ctccagctcc 6900

agttcgagtc ctccgaggag gccgataagg gcaactccca ttccaagaag atgctcaagg 6960

ccctcctctc cgagggcgag tccatctggg agatcaccga gaagatcctc aactccttcg 7020

agtacacctc ccgcttcacc aagaccaaga ccctctacca gttcctcttc ctcgccacct 7080

tcatcaactg cggccgcttc tccgatatca agaacgtcga tcccaagtcc ttcaagctcg 7140

tccagaacaa gtacctcggc gtcatcatcc agtgcctcgt caccgagacc aagacctccg 7200

tctcccgcca tatctacttc ttctccgccc gcggccgcat cgatcccctc gtctacctcg 7260

atgagttcct ccgcaactcc gagcccgtcc tcaagcgcgt caaccgcacc ggcaactcct 7320

cctccaacaa gcaggagtac cagctcctca aggataacct cgtccgctcc tacaacaagg 7380

ccctcaagaa gaacgccccc tactccatct tcgccatcaa gaacggcccc aagtcccata 7440

tcggccgcca tctcatgacc tccttcctct ccatgaaggg cctcaccgag ctcaccaacg 7500

tcgtcggcaa ctggtccgat aagcgcgcct ccgccgtcgc ccgcaccacc tacacccatc 7560

agatcaccgc catccccgat cattacttcg cactagtctc ccgctactac gcctacgatc 7620

ccatctccaa ggagatgatc gccctcaagg atgagaccaa ccccatcgag gagtggcagc 7680

atatcgagca gctcaagggc tccgccgagg gctccatccg ctaccccgcc tggaacggca 7740

tcatctccca ggaggtcctc gattacctct cctcctacat caaccgccgc atccccaaga 7800

agaagcgcaa ggtctgagtc gagattatcc aagggaatga cttaatgagt atgtaagaca 7860

tgggtcataa cggcgttcga aacatataca gggttatgtt tgggaatagc acacgaataa 7920

taacgttaat aggtaccaaa gtccttgata cattagcacg gtagaaaaag aataatacaa 7980

cgagctggga atattcttta atataaaact ccaagaagag ctggtgcggt ggagcttgtt 8040

ttcgactctc agtaatattt cctcatatcc aagcgcgcta ggaggtggtc gaatacacat 8100

gtaggcgctt ctctggatgc aaaagtcgtg ccggacctgc cgaaagactt tgaagatgcg 8160

ttcacgccat ctaagttgcg tagataattc acaaaaaggg atgtttgttt ccggaatgta 8220

gcaaagagct gataggcaat agcctcactt gcatgcatcc tagagtttaa acagcttggc 8280

actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 8340

ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 8400

cccttcccaa cagttgcgca gcctgaacgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct 8460

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 8520

tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 8580

ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 8640

tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 8700

atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 8760

gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 8820

gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 8880

tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 8940

tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 9000

gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 9060

acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 9120

tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 9180

gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 9240

tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 9300

accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 9360

ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 9420

agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 9480

gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 9540

ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc tccaagggtg ggtctcgcgg 9600

tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 9660

ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 9720

gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 9780

acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 9840

aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 9900

atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 9960

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 10020

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 10080

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 10140

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 10200

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 10260

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 10320

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 10380

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 10440

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 10500

cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 10560

tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 10620

cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagc 10679

<210> 40

<211> 12973

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pSMai326，其含有类芽孢杆菌属物种黄原胶酶变体表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点

<400> 40

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 60

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 120

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 180

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttgtttaaac 240

gcggccgcga attcatcttg aagttcctat tccgagttcc tattctctag aaagtatagg 300

aacttcgcta gccgagagca gccgaatgta ggattgttat ccgaactctg ctcgtagagg 360

catgttgtga atctgtgtcg ggcaggacac gcctcgaagg ttcacggcaa gggaaaccac 420

cgatagcagt gtctagtagc aacctgtaaa gccgcaatgc agcatcactg gaaaatacaa 480

accaatggct aaaagtacat aagttaatgc ctaaagaagt catataccag cggctaataa 540

ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta atttgccaac ggcttgtggg gttgcagaag 600

caacggcaaa gccccacttc cccacgtttg tttcttcact cagtccaatc tcagctggtg 660

atcccccaat tgggtcgctt gtttgttccg gtgaagtgaa agaagacaga ggtaagaatg 720

tctgactcgg agcgttttgc atacaaccaa gggcagtgat ggaagacagt gaaatgttga 780

cattcaagga gtatttagcc agggatgctt gagtgtatcg tgtaaggagg tttgtctgcc 840

gatacgacga atactgtata gtcacttctg atgaagtggt ccatattgaa atgtaagtcg 900

gcactgaaca ggcaaaagat tgagttgaaa ctgcctaaga tctcgggccc tcgggccttc 960

ggcctttggg tgtacatgtt tgtgctccgg gcaaatgcaa agtgtggtag gatcgaacac 1020

actgctgcct ttaccaagca gctgagggta tgtgataggc aaatgttcag gggccactgc 1080

atggtttcga atagaaagag aagcttagcc aagaacaata gccgataaag atagcctcat 1140

taaacggaat gagctagtag gcaaagtcag cgaatgtgta tatataaagg ttcgaggtcc 1200

gtgcctccct catgctctcc ccatctactc atcaactcag atcctccagg agacttgtac 1260

accatctttt gaggcacaga aacccaatag tcaaccgcgg actgcgcacc atgaagcttc 1320

ttccctcctt gattggcctg gccagtctgg cgtccctcgc cgtcgccatc gccggcgtcg 1380

tccagagcgt caacgtcagc caggccggct acagcagcaa cgacttcaag accgccaccg 1440

tcaccgccag cgacaagctc agcgacacca gctaccagat cctccagggc accaccgtca 1500

ttgccaccgg caccatgaag gacgagggct acgtctgggg caagtacgtc tacagcatcg 1560

acttctccag cgtcacggcc acgggcacca acttcaccat ccgcagcaac ggcgtcagca 1620

gctacacgtt ccccatccag accaacatgt ggaacgagta caaggacgag atgaccgcct 1680

tctaccgcct cctccgcacc accgacacct tcgccgccta tcctgccggc tactccaaca 1740

ttgcccctag caacaagatt ctgcaccccg actcgttcct cgacgacgcc ttctcgcccg 1800

accgcaccac gcactacgac ctcaccggcg gctggttcga tgccggcgac tacggcaagt 1860

atggcggcaa ccagtgggtc cagggcaaca ttgctatcag ctacctccgc cacgccagct 1920

ctgccgccgt caacttcgac aaggacacca acggcatccc cgacctggtc gacgaggcca 1980

tcttcggcag ccagtacctc gtcaagttcg cccagcagct tggcggcgct atccacaaca 2040

tcctccgcaa gggcggcttc gtcctgcctc acaaggtcac cgacaacgtc cccggcaaca 2100

ccgacgatcg cgccctcgag gctgtcgagg ccgtcggcgg cagcggcaag agcagcggca 2160

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acaactacac cctcacgcac caggacggca accacggcag ctacggcacg atgaacaacg 2340

gcggcattgc taacccgctc ctctgggccg aggtccagct ctacctcctg accggcgacg 2400

ccgcctacaa gacgcaggcc cagacgcgca tcaacgccat caacgaggcc tacgtgagca 2460

gcaccaacta ctgggacatg caccccattg ctctcgccga gttctacccc gtcgccgaca 2520

gcgccatcaa gaccaagatc cagagcatcc tgaagcacca ggcctactac ttcatcaccc 2580

tcatggacga cacgccctac ggcgtcctca accagttcgg caacttcggc gtcaacgagc 2640

cccacgcctc ctacatggcc gacctgctcc gctactacga gctgttcaac gaccctgtcg 2700

ctctccgagc cgccaagaag gccctctact ggatcgtcgg caacaacccc tggaacatca 2760

gctgggtcag cggcgtcggc agcaacttta cccgcttcct gcacacccgc ctcgacgagg 2820

aggcctacag ccagacgaac acgggcgtcg tgctccctgg cgccatggtg agcggcccca 2880

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gggccgacga cacgaaccag tggcgctaca acgagtactc cgtcagcatc cagacgggcc 3000

tcttctacac catcatgggc ctcagcgccc tcggcggcaa cgcctccact ggcggcgctg 3060

agcccgtcaa gctccccatc acgtggccca tcatcggcga ctgggtcacg ggcgacgtca 3120

ccgtctttgc ccagcctgag ggcagcctct cgaacgtcag cgccaacggc accgtgctca 3180

gccccagcga cggcgtctac accaccacgg tcagcaccag cgccgacgct ccctacaccg 3240

agcgcaaggt ccagatcaag ggcaccgacg actcgggcaa caccacctac agcaacaccc 3300

acttcacggt cgcccctccg ctgcctgatc cttcgcaccc tctcctcttc gacgacttta 3360

accagaaggg catctggggc agccagaagc tcgattgggt caactggtac aaccagaacg 3420

gcggcaccgc cagctacacc cgcaccacgg tcgacggccg caccgtcggc aagttcgctc 3480

acacccctgc cgccaccacc agcaaggcca agtttcagcc ccgcaagtac aacgccaacc 3540

tcaacggcta ccgctacctc aacttcacga tgaagaaccc tggctacccc aacacgaaga 3600

tccgcattgc cgccaacgac ggcaccaagt ccgtcaacct cacctccggc gaggtcgcca 3660

tcagcagcac ctggaccacc taccagtacg acctgaacct ccatcctacg ctcaacaaga 3720

gcaacgtcct catcgaggtc tggctcagca accccacggc tggcgcctac ggcgagatcc 3780

tgatcgacga gatctctgcc gtcaacacca acagcggcac ggcccctacg ctctccgcca 3840

ccggcgtgaa cgccagcatt ggcaaccaga gcaccgtgtt cacctacacc gccacgtaca 3900

ccgacgccaa caaccaggct cctttcgacg tccaggtcgt cattgacggc gtcatccgct 3960

ccatgaccgc tgctgacccc acggacacga cctactccga cggcaaggtt tacacctacg 4020

ccacgaagct ccccgtcggc acccacaagt tctacttccg cacgacggac accacgacca 4080

acttcgtcag cacctccgtc cagactggcc ccacggtcat ccgcaaccga ctcgaggccg 4140

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tgaacgtccc caaggccggc acgtaccagg tcagcgcccg agccatgcgc ctctccgata 4320

acggcatcta tcagctccag attaacggct ccaaccaggg cacgcccttc gacacttacc 4380

agtcctcggg caagtatctc gactacgccc tgggcaacgt caccatcacg agccccggca 4440

cgcagctgtt ccgcttcaag gtgaccggca agaacgcctc gagcctcggc tacaagctgc 4500

ccctggactt tatccagctc gtccccgtgc cttaaagctc cgtggcgaaa gcctgacgca 4560

ccggtagatt cttggtgagc ccgtatcatg acggcggcgg gagctacatg gccccgggtg 4620

atttattttt tttgtatcta cttctgaccc ttttcaaata tacggtcaac tcatctttca 4680

ctggagatgc ggcctgcttg gtattgcgat gttgtcagct tggcaaattg tggctttcga 4740

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aaccctgaag ggattcttcc tttgagagat ggaagcgtgt catatctctt cggttctacg 4860

gcaggttttt ttctgctctt tcgtagcatg gcatggtcac ttcagcgctt atttacagtt 4920

gctggtattg atttcttgtg caaattgcta tctgacactt attagctatg gagtcaccac 4980

atttcccagc aacttcccca cttcctctgc aatcgccaac gtcctctctt cactgagtct 5040

ccgtccgata acctgcactg caaccggtgc cccatgatac gcctccggat catactcttc 5100

ctgcacgagg gcatcaagct cactaaccgc cttgaaactc tcattcttct tatcgatgtt 5160

cttatccgca aaggtaaccg gaacaaccac gctcgtgaaa tccagcaggt tgatcacaga 5220

ggcataccca tagtaccgga actggtcatg ccgtaccgca gcggtaggcg taatcggcgc 5280

gatgatggcg tccagttcct tcccggcctt ttcttcagcc tcccgccatt tctcaaggta 5340

ctccatctgg taattccact tctggagatg cgtgtcccag agctcgttca tgttaacagc 5400

tttgatgttc gggttcagta ggtctttgat atttggagtc gccggctcgc cggatgcact 5460

gatatcgcgc attacgtcgg cgctgccgtc agccgcgtag atatgggaga tgagatcgtg 5520

gccgaaatcg tgcttgtatg gcgtccacgg ggtcacggtg tgaccggctt tggcgagtgc 5580

ggcgacggtg gtttccacgc cgcgcaggat aggagggtgt ggaaggacat tgccgtcgaa 5640

gttgtagtag ccgatattga gcccgccgtt cttgatcttg gaggcaataa tgtccgactc 5700

ggactggcgc cagggcatgg ggatgacctt ggagtcgtat ttccaaggct cctgaccgag 5760

gacggatttg gtgaagaggc ggaggtctaa catacttcat cagtgactgc cggtctcgta 5820

tatagtataa aaagcaagaa aggaggacag tggaggcctg gtatagagca ggaaaagaag 5880

gaagaggcga aggactcacc ctcaacagag tgcgtaatcg gcccgacaac gctgtgcacc 5940

gtctcctgac cctccatgct gttcgccatc tttgcatacg gcagccgccc atgactcggc 6000

cttagaccgt acaggaagtt gaacgcggcc ggcactcgaa tcgagccacc gatatccgtt 6060

cctacaccga tgacgccacc acgaatccca acgatcgcac cctcaccacc agaactgccg 6120

ccgcacgacc agttcttgtt gcgtgggttg acggtgcgcc cgatgatgtt gttgactgtc 6180

tcgcagacca tcagggtctg cgggacagag gtcttgacgt agaagacggc accggctttg 6240

cggagcatgg ttgtcagaac cgagtcccct tcgtcgtact tgtttagcca tgagatgtag 6300

cccattgatg tttcgtagcc ctggtggcat atgttagctg acaaaaaggg acatctaacg 6360

acttaggggc aacggtgtac cttgactcga agctggtctt tgagagagat ggggaggcca 6420

tgaagtggac caacgggtct cttgtgcttt gcgtagtatt catcgagttc ccttgcctgc 6480

gcgagagcgg cgtcagggaa gaactcgtgg gcgcagtttg tctgcacaga agccagcgtc 6540

agcttgatag tcccataagg tggcgttgtt acatctccct gagaggtaga ggggacccta 6600

ctaactgctg ggcgattgct gcccgtttac agaatgctag cgtaacttcc accgaggtca 6660

actctccggc cgccagcttg gacacaagat ctgcagcgga ggcctctgtg atcttcagtt 6720

cggcctctga aaggatcccc gatttctttg ggaaatcaat aacgctgtct tccgcaggca 6780

gcgtctggac tttccattca tcagggatgg tttttgcgag gcgggcgcgc ttatcagcgg 6840

ccagttcttc ccaggattga ggcattctgt gttagcttat agtcaggatg ttggctcgac 6900

gagtgtaaac tgggagttgg catgagggtt atgtaggctt ctttagcccc gcatccccct 6960

cattctcctc attgatcccg ggggagcgga tggtgttgat aagagactaa ttatagggtt 7020

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attacgtgta ttgctgataa acaccaacag agctttactg aaagatggga gtcacggtgt 7200

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cagcctgcag tcaaacatac atatatatca accgcgaaga cgtctggcct tgtagaacac 7320

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ctctccagcg ggcgagctat tcaaaatatt caaagcaggt atctcgtatt gccaggattc 7440

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tagtatagga acttcagata tccatcacac tgggagtacc atttaattct atttgtgttt 7620

gatcgagacc taatacagcc cctacaacga ccatcaaagt cgtatagcta ccagtgagga 7680

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gaataagatg gtggagagct tataccgagc tcccaaatct gtccagatca tggttgaccg 7800

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cgaactcgtg agctctgtac agtgaccggt gactctttct ggcatgcgga gagacggacg 7980

gacgcagaga gaagggctga gtaataagcg ccactgcgcc agacagctct ggcggctctg 8040

aggtgcagtg gatgattatt aatccgggac cggccgcccc tccgccccga agtggaaagg 8100

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tagcatgcca ttaacctagg tacagaagtc caattgcttc cgatctggta aaagattcac 8280

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gcccatccgg catctgtagg gcgtccaaat atcgtgcctc tcctgctttg cccggtgtat 8400

gaaaccggaa aggccgctca ggagctggcc agcggcgcag accgggaaca caagctggca 8460

gtcgacccat ccggtgctct gcactcgacc tgctgaggtc cctcagtccc tggtaggcag 8520

ctttgccccg tctgtccgcc cggtgtgtcg gcggggttga caaggtcgtt gcgtcagtcc 8580

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gccccagttc gatatcctct gcaagacccc ccccaaggtc ctcgtccgcc agttcgtcga 8880

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ctgctggatg atcacccata acggcaccgc catcaagcgc gccaccttca tgtcctacaa 9000

caccatcatc tccaactccc tctccttcga tatcgtcaac aagtccctcc agttcaagta 9060

caagacccag aaggccacca tcctggaggc ctccctcaag aagctcatcc ccgcctggga 9120

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gaagatgctc aaggccctcc tctccgaggg cgagtccatc tgggagatca ccgagaagat 9300

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cttcctcgcc accttcatca actgcggccg cttctccgat atcaagaacg tcgatcccaa 9420

gtccttcaag ctcgtccaga acaagtacct cggcgtcatc atccagtgcc tcgtcaccga 9480

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cctcgtctac ctcgatgagt tcctccgcaa ctccgagccc gtcctcaagc gcgtcaaccg 9600

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ctcctacaac aaggccctca agaagaacgc cccctactcc atcttcgcca tcaagaacgg 9720

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cgagctcacc aacgtcgtcg gcaactggtc cgataagcgc gcctccgccg tcgcccgcac 9840

cacctacacc catcagatca ccgccatccc cgatcattac ttcgcactag tctcccgcta 9900

ctacgcctac gatcccatct ccaaggagat gatcgccctc aaggatgaga ccaaccccat 9960

cgaggagtgg cagcatatcg agcagctcaa gggctccgcc gagggctcca tccgctaccc 10020

cgcctggaac ggcatcatct cccaggaggt cctcgattac ctctcctcct acatcaaccg 10080

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gagtatgtaa gacatgggtc ataacggcgt tcgaaacata tacagggtta tgtttgggaa 10200

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ggtcgaatac acatgtaggc gcttctctgg atgcaaaagt cgtgccggac ctgccgaaag 10440

actttgaaga tgcgttcacg ccatctaagt tgcgtagata attcacaaaa agggatgttt 10500

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aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 11220

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 11280

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 11340

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 11400

gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 11460

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 11520

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 11580

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 11640

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 11700

accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 11760

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 11820

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ggtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 11940

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 12000

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tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 12120

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 12180

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 12240

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tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 12360

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 12420

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agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 12540

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 12600

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 12660

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 12720

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 12780

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 12840

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 12900

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 12960

gaagcggaag agc 12973

<210> 41

<211> 10427

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pTmmD-Mf_溶菌酶，其含有弗格斯毁丝霉溶菌酶表达盒，该表达盒侧接FRT-F和FRT-F3位点

<400> 41

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 60

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 120

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 180

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttgtttaaac 240

gcggccgcga attcatcttg aagttcctat tccgagttcc tattctctag aaagtatagg 300

aacttcgcta gccgagagca gccgaatgta ggattgttat ccgaactctg ctcgtagagg 360

catgttgtga atctgtgtcg ggcaggacac gcctcgaagg ttcacggcaa gggaaaccac 420

cgatagcagt gtctagtagc aacctgtaaa gccgcaatgc agcatcactg gaaaatacaa 480

accaatggct aaaagtacat aagttaatgc ctaaagaagt catataccag cggctaataa 540

ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta atttgccaac ggcttgtggg gttgcagaag 600

caacggcaaa gccccacttc cccacgtttg tttcttcact cagtccaatc tcagctggtg 660

atcccccaat tgggtcgctt gtttgttccg gtgaagtgaa agaagacaga ggtaagaatg 720

tctgactcgg agcgttttgc atacaaccaa gggcagtgat ggaagacagt gaaatgttga 780

cattcaagga gtatttagcc agggatgctt gagtgtatcg tgtaaggagg tttgtctgcc 840

gatacgacga atactgtata gtcacttctg atgaagtggt ccatattgaa atgtaagtcg 900

gcactgaaca ggcaaaagat tgagttgaaa ctgcctaaga tctcgggccc tcgggccttc 960

ggcctttggg tgtacatgtt tgtgctccgg gcaaatgcaa agtgtggtag gatcgaacac 1020

actgctgcct ttaccaagca gctgagggta tgtgataggc aaatgttcag gggccactgc 1080

atggtttcga atagaaagag aagcttagcc aagaacaata gccgataaag atagcctcat 1140

taaacggaat gagctagtag gcaaagtcag cgaatgtgta tatataaagg ttcgaggtcc 1200

gtgcctccct catgctctcc ccatctactc atcaactcag atcctccagg agacttgtac 1260

accatctttt gaggcacaga aacccaatag tcaaccgcgg actgcgcaca tgaaggctgc 1320

cctcctcgct acggtgtcgg ctcttgctgc tggcgttcaa gccgctgtcc agggtttcga 1380

catcagccac tggcagtctt ctgtcgactt caaggctgcg tacaactctg gcgctcgctt 1440

cgtgatcatc aaggctaccg aaggaacctc gttcatcgat cccaagttct cgagccatta 1500

cactggtgct accaatgctg gcttcattcg tggtgcctat catttcgccc atcccggtca 1560

aagctctgga gaagcgcaag ccgactactt cctcgcgcat ggcggtggct ggactccgga 1620

cggcatcacc cttcctggca tgttggacct ggaggcctac aatgcgggtg aatgctgggg 1680

tctcagccag agcgcgatgg tggcctggat caaggccttc tccgatcgct atcatgcgcg 1740

tacgggagtc tacccgatgc tgtacaccaa cctctcgtgg tggaagacgt gcacgggcaa 1800

ctctaaggcc ttcgtgaaca ccaatccctt ggtcctggct cgatgggctt ccagccctgg 1860

cgagattcct ggcggatggc catggcagac catttggcag aactccgaca gctatcgcta 1920

tggcggtgac tcggacatct tcaacggcga catgaaccag cttcgccgac tcgctacggc 1980

tgcttaataa gctccgtggc gaaagcctga cgcaccggta gattcttggt gagcccgtat 2040

catgacggcg gcgggagcta catggccccg ggtgatttat tttttttgta tctacttctg 2100

acccttttca aatatacggt caactcatct ttcactggag atgcggcctg cttggtattg 2160

cgatgttgtc agcttggcaa attgtggctt tcgaaaacac aaaacgattc cttagtagcc 2220

atgcatcaag cttggtaccg agctctggaa acgcaaccct gaagggattc ttcctttgag 2280

agatggaagc gtgtcatatc tcttcggttc tacggcaggt ttttttctgc tctttcgtag 2340

catggcatgg tcacttcagc gcttatttac agttgctggt attgatttct tgtgcaaatt 2400

gctatctgac acttattagc tatggagtca ccacatttcc cagcaacttc cccacttcct 2460

ctgcaatcgc caacgtcctc tcttcactga gtctccgtcc gataacctgc actgcaaccg 2520

gtgccccatg atacgcctcc ggatcatact cttcctgcac gagggcatca agctcactaa 2580

ccgccttgaa actctcattc ttcttatcga tgttcttatc cgcaaaggta accggaacaa 2640

ccacgctcgt gaaatccagc aggttgatca cagaggcata cccatagtac cggaactggt 2700

catgccgtac cgcagcggta ggcgtaatcg gcgcgatgat ggcgtccagt tccttcccgg 2760

ccttttcttc agcctcccgc catttctcaa ggtactccat ctggtaattc cacttctgga 2820

gatgcgtgtc ccagagctcg ttcatgttaa cagctttgat gttcgggttc agtaggtctt 2880

tgatatttgg agtcgccggc tcgccggatg cactgatatc gcgcattacg tcggcgctgc 2940

cgtcagccgc gtagatatgg gagatgagat cgtggccgaa atcgtgcttg tatggcgtcc 3000

acggggtcac ggtgtgaccg gctttggcga gtgcggcgac ggtggtttcc acgccgcgca 3060

ggataggagg gtgtggaagg acattgccgt cgaagttgta gtagccgata ttgagcccgc 3120

cgttcttgat cttggaggca ataatgtccg actcggactg gcgccagggc atggggatga 3180

ccttggagtc gtatttccaa ggctcctgac cgaggacgga tttggtgaag aggcggaggt 3240

ctaacatact tcatcagtga ctgccggtct cgtatatagt ataaaaagca agaaaggagg 3300

acagtggagg cctggtatag agcaggaaaa gaaggaagag gcgaaggact caccctcaac 3360

agagtgcgta atcggcccga caacgctgtg caccgtctcc tgaccctcca tgctgttcgc 3420

catctttgca tacggcagcc gcccatgact cggccttaga ccgtacagga agttgaacgc 3480

ggccggcact cgaatcgagc caccgatatc cgttcctaca ccgatgacgc caccacgaat 3540

cccaacgatc gcaccctcac caccagaact gccgccgcac gaccagttct tgttgcgtgg 3600

gttgacggtg cgcccgatga tgttgttgac tgtctcgcag accatcaggg tctgcgggac 3660

agaggtcttg acgtagaaga cggcaccggc tttgcggagc atggttgtca gaaccgagtc 3720

cccttcgtcg tacttgttta gccatgagat gtagcccatt gatgtttcgt agccctggtg 3780

gcatatgtta gctgacaaaa agggacatct aacgacttag gggcaacggt gtaccttgac 3840

tcgaagctgg tctttgagag agatggggag gccatgaagt ggaccaacgg gtctcttgtg 3900

ctttgcgtag tattcatcga gttcccttgc ctgcgcgaga gcggcgtcag ggaagaactc 3960

gtgggcgcag tttgtctgca cagaagccag cgtcagcttg atagtcccat aaggtggcgt 4020

tgttacatct ccctgagagg tagaggggac cctactaact gctgggcgat tgctgcccgt 4080

ttacagaatg ctagcgtaac ttccaccgag gtcaactctc cggccgccag cttggacaca 4140

agatctgcag cggaggcctc tgtgatcttc agttcggcct ctgaaaggat ccccgatttc 4200

tttgggaaat caataacgct gtcttccgca ggcagcgtct ggactttcca ttcatcaggg 4260

atggtttttg cgaggcgggc gcgcttatca gcggccagtt cttcccagga ttgaggcatt 4320

ctgtgttagc ttatagtcag gatgttggct cgacgagtgt aaactgggag ttggcatgag 4380

ggttatgtag gcttctttag ccccgcatcc ccctcattct cctcattgat cccgggggag 4440

cggatggtgt tgataagaga ctaattatag ggtttagctg gtgcctagct ggtgattggc 4500

tggcttcgcc gaattttacg ggccaaggaa agctgcagaa ccgcggcact ggtaaacggt 4560

aattaagcta tcagccccat gctaacgagt ttaaattacg tgtattgctg ataaacacca 4620

acagagcttt actgaaagat gggagtcacg gtgtggcttc cccactgcga ttattgcaca 4680

agcagcgagg gcgaacttga ctgtcgtcgc tgagcagcct gcagtcaaac atacatatat 4740

atcaaccgcg aagacgtctg gccttgtaga acacgacgct ccctagcaac acctgccgtg 4800

tcagcctcta cggttgttac ttgcattcag gatgctctcc agcgggcgag ctattcaaaa 4860

tattcaaagc aggtatctcg tattgccagg attcagctga agcaacaggt gccaaggaaa 4920

tctgcgtcgg ttctcatctg ggcttgctcg gtcctggcgt agacaagggc gaattctgca 4980

ttgaagttcc tattccgagt tcctattctt caaatagtat aggaacttca gatatccatc 5040

acactgggag taccatttaa ttctatttgt gtttgatcga gacctaatac agcccctaca 5100

acgaccatca aagtcgtata gctaccagtg aggaagtgga ctcaaatcga cttcagcaac 5160

atctcctgga taaactttaa gcctaaacta tacagaataa gatggtggag agcttatacc 5220

gagctcccaa atctgtccag atcatggttg accggtgcct ggatcttcct atagaaccat 5280

ccttattcgt tgacctagct gattctggag tgacccagag ggtcatgact tgagcctaaa 5340

atccgccgcc tccaccattt gtagaaaaat gtgacgaact cgtgagctct gtacagtgac 5400

cggtgactct ttctggcatg cggagagacg gacggacgca gagagaaggg ctgagtaata 5460

agcgccactg cgccagacag ctctggcggc tctgaggtgc agtggatgat tattaatccg 5520

ggaccggccg cccctccgcc ccgaagtgga aaggctggtg tgcccctcgt tgaccaagaa 5580

tctattgcat catcggagaa tatggagctt catcgaatca ccggcagtaa gcgaaggaga 5640

atgtgaagcc aggggtgtat agccgtcggc gaaatagcat gccattaacc taggtacaga 5700

agtccaattg cttccgatct ggtaaaagat tcacgagata gtaccttctc cgaagtaggt 5760

agagcgagta cccggcgcgt aagctcccta attggcccat ccggcatctg tagggcgtcc 5820

aaatatcgtg cctctcctgc tttgcccggt gtatgaaacc ggaaaggccg ctcaggagct 5880

ggccagcggc gcagaccggg aacacaagct ggcagtcgac ccatccggtg ctctgcactc 5940

gacctgctga ggtccctcag tccctggtag gcagctttgc cccgtctgtc cgcccggtgt 6000

gtcggcgggg ttgacaaggt cgttgcgtca gtccaacatt tgttgccata ttttcctgct 6060

ctccccacca gctgctcttt tcttttctct ttcttttccc atcttcagta tattcatctt 6120

cccatccaag aacctttatt tcccctaagt aagtactttg ctacatccat actccatcct 6180

tcccatccct tattcctttg aacctttcag ttcgagcttt cccacttcat cgcagcttga 6240

ctaacagcta ccccgcttga gcagacatca ccatgcccca gttcgatatc ctctgcaaga 6300

ccccccccaa ggtcctcgtc cgccagttcg tcgagcgctt cgagcgcccc tccggcgaga 6360

agatcgccct ctgcgccgcc gagctcacct acctctgctg gatgatcacc cataacggca 6420

ccgccatcaa gcgcgccacc ttcatgtcct acaacaccat catctccaac tccctctcct 6480

tcgatatcgt caacaagtcc ctccagttca agtacaagac ccagaaggcc accatcctgg 6540

aggcctccct caagaagctc atccccgcct gggagttcac catcatcccc tactacggcc 6600

agaagcatca gtccgatatc accgatatcg tctcctccct ccagctccag ttcgagtcct 6660

ccgaggaggc cgataagggc aactcccatt ccaagaagat gctcaaggcc ctcctctccg 6720

agggcgagtc catctgggag atcaccgaga agatcctcaa ctccttcgag tacacctccc 6780

gcttcaccaa gaccaagacc ctctaccagt tcctcttcct cgccaccttc atcaactgcg 6840

gccgcttctc cgatatcaag aacgtcgatc ccaagtcctt caagctcgtc cagaacaagt 6900

acctcggcgt catcatccag tgcctcgtca ccgagaccaa gacctccgtc tcccgccata 6960

tctacttctt ctccgcccgc ggccgcatcg atcccctcgt ctacctcgat gagttcctcc 7020

gcaactccga gcccgtcctc aagcgcgtca accgcaccgg caactcctcc tccaacaagc 7080

aggagtacca gctcctcaag gataacctcg tccgctccta caacaaggcc ctcaagaaga 7140

acgcccccta ctccatcttc gccatcaaga acggccccaa gtcccatatc ggccgccatc 7200

tcatgacctc cttcctctcc atgaagggcc tcaccgagct caccaacgtc gtcggcaact 7260

ggtccgataa gcgcgcctcc gccgtcgccc gcaccaccta cacccatcag atcaccgcca 7320

tccccgatca ttacttcgca ctagtctccc gctactacgc ctacgatccc atctccaagg 7380

agatgatcgc cctcaaggat gagaccaacc ccatcgagga gtggcagcat atcgagcagc 7440

tcaagggctc cgccgagggc tccatccgct accccgcctg gaacggcatc atctcccagg 7500

aggtcctcga ttacctctcc tcctacatca accgccgcat ccccaagaag aagcgcaagg 7560

tctgagtcga gattatccaa gggaatgact taatgagtat gtaagacatg ggtcataacg 7620

gcgttcgaaa catatacagg gttatgtttg ggaatagcac acgaataata acgttaatag 7680

gtaccaaagt ccttgataca ttagcacggt agaaaaagaa taatacaacg agctgggaat 7740

attctttaat ataaaactcc aagaagagct ggtgcggtgg agcttgtttt cgactctcag 7800

taatatttcc tcatatccaa gcgcgctagg aggtggtcga atacacatgt aggcgcttct 7860

ctggatgcaa aagtcgtgcc ggacctgccg aaagactttg aagatgcgtt cacgccatct 7920

aagttgcgta gataattcac aaaaagggat gtttgtttcc ggaatgtagc aaagagctga 7980

taggcaatag cctcacttgc atgcatccta gagtttaaac agcttggcac tggccgtcgt 8040

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 8100

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 8160

gttgcgcagc ctgaacggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 8220

cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 8280

aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 8340

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 8400

accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt 8460

taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 8520

cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 8580

ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 8640

ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 8700

aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 8760

actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 8820

gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 8880

agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 8940

cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 9000

catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 9060

aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 9120

gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 9180

aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 9240

agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 9300

ctggtttatt gctgataaat ctggagcctc caagggtggg tctcgcggta tcattgcagc 9360

actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 9420

aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 9480

gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 9540

atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 9600

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 9660

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 9720

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 9780

agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 9840

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 9900

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 9960

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 10020

cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 10080

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 10140

agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 10200

tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 10260

ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 10320

ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 10380

ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagc 10427

<210> 42

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1232-3'steD-F

<400> 42

aactctctcc tctagattat gtagcatgag accagcgggg a 41

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1233-3'steD-R

<400> 43

acaggagaat tcttaattaa agtccggggt ggggagtttt caggc 45

<210> 44

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1230-5'steD-F

<400> 44

gtggcggccg cgtttaaaca tccctatttt aaataccgag tatg 44

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1231-5'steD-R

<400> 45

tcagtcaccc ggatccctaa tggtggcagt cgtgttggat gcct 44

<210> 46

<211> 11166

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pIhar473

<400> 46

ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 60

taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 120

tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 180

ttacgccaag ctcgaaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc tccaccgcgg 240

tggcggccgc gtttaaacat ccctatttta aataccgagt atgctggggt agtacacacg 300

catacacaac aacacaccgg acggaggaga ggaaaactga agttcctcca agtcctcctc 360

cgccttctcc cttcttccct tcccccctcc ggacctccga agtcccggtt atttgggagg 420

gattgtttat tgcaggagat gagaggccgc tttagtctcg ggtctagctc gcaagctgct 480

tccttctcac gagaccctgg tggatcaaac acacgccgat tcctactcgg atggggagcg 540

cctgtttatg atttatgact gctcatctcg ctcatcccct tggctgtgga gtggtttcgg 600

tggtttttct gttctccaca tctcgagctt tttgaacgtg tcgcatcatc atgacagcct 660

ataccctttg taaccgtaat attaccagag cctcctccgg tgccatgata ccgtccggcc 720

cggggcgcag cttgctctct ttgcctctct ctcgcgcatc ttctccagct tctctcctgt 780

tgtctagact cttgtcacca aatttaggag ccggcggaac tggtgaccat tagctgttct 840

cttctccccc ccctctcttc tccctccgct gcaaaagtcc tactccgcat tggcggcgga 900

ctccggtcgc aatggagctc cccttcagcc tggtggatac agctctttcc tccacgcaca 960

ttgacgccat cgacgccctt cgagcctttt tccttttggc atcctgcacg gtatgcaccg 1020

atatgttgcc atcccaaatt cgaggcggac gacgttgcaa agtgaccctg catcaactaa 1080

acccagaata tcccaactag atactctccg tcagcatcct gccagattcg cttcattcac 1140

gcttcattcc ttatggcgct cgtacaactt cgacggccga ctcgcagtcc tcgcagtcct 1200

cgcccccggc gtcctcggac tcctccccag ccgcccgcgc tcttgactac gctgccgcct 1260

tgacagtccc tcacagctac ttcacgcaat tctacattgc ctccgttttg gcctcggtct 1320

tctgggctgc gcagcttctg tgtcaaggag ccgtgttcca ggcctttgca acgagaatca 1380

gtccggaaca tatgcaacag tccatgtcca tacaccaagt cttcttgtgc tgggcgctca 1440

tgctcattca gggtgcaagg cggctatatg agtgcaaggc cttcgccaag ccttcagcct 1500

caagaatgtg gtttgttcac tggctcgtag gccttgcatt ttacctagca gtatccgttg 1560

ccttatggat cgaaggagca ggtaccactc tgactgacag gctaaaatac cgaaccccac 1620

tgattgcatc taggagccct gctgtctcat aaagtgattc tcgacgacct caaggttaca 1680

atagcaccct ctctccgcac ctttgtctgc attcctcttt tcttgattgc atcaggcatc 1740

caacacgact gccaccatta gggatccggg tgactgacac ctggcggtag acaatcaatc 1800

catttcgcta tagttaaagg atggggatga gggcaattgg ttatatgatc atgtatgtag 1860

tgggtgtgca taatagtagt gaaatggaag ccaagtcatg tgattgtaat cgaccgacgg 1920

aattgaggat atccggaaat acagacaccg tgaaagccat ggtctttcct tcgtgtagaa 1980

gaccagacag acagtccctg atttaccctt gcacaaagca ctagaaaatt agcattccat 2040

ccttctctgc ttgctctgct gatatcactg tcattcaatg catagccatg agctcatctt 2100

agatccaagc acgtaattcc atagccgagg tccacagtgg agcagcaaca ttccccatca 2160

ttgctttccc caggggcctc ccaacgacta aatcaagagt atatctctac cgtccaatag 2220

atcgtcttcg cttcaaaatc tttgacaatt ccaagagggt ccccatccat caaacccagt 2280

tcaataatag ccgagatgca tggtggagtc aattaggcag tattgctgga atgtcggggc 2340

cagttggccg ggtggtcatt ggccgcctgt gatgccatct gccactaaat ccgatcattg 2400

atccaccgcc cacgaggcgc gtctttgctt tttgcgcggc gtccaggttc aactctctcc 2460

tctagtacta aatgacgttt gtgaacagcc caaagcctac aaattcaact gcgcacaacg 2520

cgcccacggc aacttcctcg agaacgcgcc gcagacaatg ctctctatcc tggtggcagg 2580

cgtcaagtac ccagaggcag cagcgggctt aggagcggcc tgggttgttc tccgcaccct 2640

ctacatgctg ggctatattt atagcgacaa gccgaacggc accggcaggt acaatggttc 2700

gctgtacttg cttgcgcaag cgggtctttg gggattgagc gcatttggtg ttgcaaagga 2760

tttgatgtaa atgtagtcga catcttagca cagaggggag agttgataaa atgtggtctg 2820

tttgaatgat agtcgggttc gtgacctata ttcgtgatag tggagatagg tctgcgccta 2880

tcttatcggg ccggagcaaa aattccaccg cagcggggtg agttttcgtt atacagccat 2940

cccacttcca gcttcaaatt gtcagtttaa tccagcccaa ttcaatcatt ggagaaccgc 3000

catcatgtct tcgaagtccc acctccccta cgcaattcgc gcaaccaacc atcccaaccc 3060

tttaacatct aaactcttct ccatcgccga ggagaagaaa accaacgtca ccgtctccgc 3120

agacgttact acttccgccg agctcctcga tcttgctgac cgcctaggcc cctatatcgc 3180

agttctgaaa acccacatcg acatcctcac cgatctcacc ccgtcgaccc tttcctcgct 3240

ccaatccctc gcgacaaagc acaacttcct catctttgag gaccgcaagt tcatcgacat 3300

cggcaacacc gtgcaaaagc agtaccacgg tggcgctctc cgcatctccg aatgggcaca 3360

catcatcaac tgcgccatcc tgccgggcga agggatcgtc gaggccctcg cacagacaac 3420

caagtctcct gactttaaag acgcgaatca acgaggtctc ctgattcttg ccgagatgac 3480

gagtaaggga tctcttgcga caggggagta cacggcacgc tcggttgagt acgcgcggaa 3540

gtataagggg tttgtgatgg gattcgtgag tacaagggcg ttgagtgagg tgctgcccga 3600

acagaaagag gagagcgagg attttgtcgt ctttacgact ggggtgaatc tgtcggataa 3660

gggggataag ctggggcagc agtatcagac acctgggtcg gcggttgggc gaggtgcgga 3720

ctttatcatt gcgggtaggg gcatctataa ggcggacgat ccagtcgagg cggttcagag 3780

gtaccgggag gaaggctgga aagcttacga gaaaagagtt ggactttgag ggtgactgac 3840

acctggcggt agacaatcaa tccatttcgc tatagttaaa ggatggggat gagggcaatt 3900

ggttatatga tcatgtatgt agtgggtgtg cataatagta gtgaaatgga agccaagtca 3960

tgtgattgta atcgaccgac ggaattgagg atatccggaa atacagacac cgtgaaagcc 4020

atggtctttc cttcgtgtag aagaccagac agacagtccc tgatttaccc ttgcacaaag 4080

cactagaaaa ttagcattcc atccttctct gcttgctctg ctgatatcac tgtcattcaa 4140

tgcatagcca tgagctcatc ttagatccaa gcacgtaatt ccatagccga ggtccacagt 4200

ggagcagcaa cattccccat cattgctttc cccaggggcc tcccaacgac taaatcaaga 4260

gtatatctct accgtccaat agatcgtctt cgcttcaaaa tctttgacaa ttccaagagg 4320

gtccccatcc atcaaaccca gttcaataat agccgagatg catggtggag tcaattaggc 4380

agtattgctg gaatgtcggg gccagttggc cgggtggtca ttggccgcct gtgatgccat 4440

ctgccactaa atccgatcat tgatccaccg cccacgaggc gcgtctttgc tttttgcgcg 4500

gcgtccaggt tcaactctct cctctagatt atgtagcatg agaccagcgg ggaaattggc 4560

ctgagacatg agccccggat gcgtcgcgtc accgactgcc gaggaacttc atcgtattcc 4620

cgagactggc aactttgagc acatctcgat aagtcaagct tatcctagtc tccctctcca 4680

gccagccgca ctcatatctg tctggctccc gcaacaaatc ccagttgcag atggattctg 4740

cgccaagccc ttcatccctg gtggtctctg caattccatg cagaaagtcg gtatagatac 4800

tcttcgtggt aacgagcagg ctgcgccttt cctgcaaaat cctatacacc ggacgccggc 4860

catgtccgct ccctttgcca tcctcgcttc tctcgtacag atctagcacg ataggagctc 4920

ccaggctcac agtagctacg agcgggtagt aggcagcacc gtcttcatgc ggcattatgc 4980

cctgtcccgg gcggtattca tttaccagaa catgattcgg ggcgtggtgc ggggcgtccg 5040

cgaaaagacc caaggagtcg aagcgagggg tgatgatggg tgagacgagc caagagggca 5100

acggggagga gatgagcgcg ttcgattttg tcagggccga aggccaggtt tgaagtcgcc 5160

ggtgagctag atgagtccag cggggtaacg gcgcagtcgt tatctatagc cgggggtcca 5220

tgagcgccca acatccccac agggcctgaa tgaacttagg ccactgcaca gtaaagccac 5280

ggtaactcac tcacctttcg gaggagaaac tcctcttcat cctccgagat gaaatccgct 5340

atgtagaatc catcgtccgg cagtgatttg atgcgggcgg tctcaagatc ggctctcatt 5400

tgttggagtc aatcccgggg agcacacgga gcaaatatcc ctgttgttca atggggggtc 5460

ggatgacgac tgggaggaga ttaatctatc agaacgagtc cgttgagttg gttacacggt 5520

aagccgggcg atcagacagg gggggtgtgg tcggtcacgg tgaaagaagg ggatcgtagt 5580

gaaacttacc gggcgttgag cgtagacccg gaacccagac gggatgaatg gtaagggaag 5640

tgatgatgcc gatgaatggc atgtcgtcac gatgagacgc aatggctgcc cacttggccg 5700

agctgtggta cgtaatccgt agcgttaact ccatcacaat ggattgatgc ccagtgactg 5760

ttcaattagt cgtgtgggtg ataagaatag aagtcacttt cccctcacct gacatctgcg 5820

gacagctcat gactcgacaa aaagcttatc tatcaactat actccggatc aaagttactt 5880

caatcatcaa aataaacaat gcctgagcat cacataaaca tacacaaata tatatatata 5940

cccatatgga tatagatgaa cccctcgttc taccatgatg caaacagtat gttcaaccca 6000

gtagcctgaa aactccccac cccggacttt aattaagaat tctcctgtag gcttgagagt 6060

tcaaggaaga aacagtgcaa ttatctttgc gaacccaggg gctggtgacg gaattttcat 6120

agtcaagcta tcagagtaaa gaagaggagc atgtcaaagt acaattagag acaaatatat 6180

agtcgcgtgg agccaagagc ggattcctca gtctcgtagg tctcttgacg accgttgatc 6240

tgcttgatct cgtctcccga aaatgaaaat agactctgct aagctattct tctgcttcgc 6300

cggagcctga agggcgtact agggttgcga ggtccaatgc attaatgcat tgcagatgag 6360

ctgtatctgg aagaggtaaa cccgaaacgc gttttattct tgttgacatg gagctattaa 6420

atcactagaa ggcactcttt gctgcttgga caaatgaacg tatcttatcg agatcctgaa 6480

caccatttgt ctcaactccg gagctgacat cgacaccaac gatcttatat ccagattcgt 6540

caagctgttt gatgatttca gtaacgttaa gtggatcgat ccggatagcg cgggttcctt 6600

ccggtattgt ctccttccgt gtttcagtta gcctccccca tctcccgggc aaacgtgcgc 6660

gccaggtcgc atatcgtcgg tatggagccg ggggtggtga cgtgggtctg gaccatcccg 6720

gaggtaagtt gcagcagggc gtcccggcag ccggcgggcg attggtcgta atccaggata 6780

aagacgtgca tggaacggag gcgtttggcc aagacgtcca aggcccaggc aaacacgtta 6840

tacaggtcgc cgttgggggc cagcaactcg gggccccgaa acagggtaaa taacgtgtcc 6900

ccgatatggg gtcgtgggcc cgcgttgctc tggggctcgg caccctgggg cggcacggcc 6960

gtccccgaaa gctgtcccca gtcctcccgc cacgacccgc cgcactgcag ataccgcacc 7020

gtattggcaa gtagcccgta aacgcggcga atcgcagcca gcatagccag gtccagccgc 7080

tcgccggggc gctggcgttt ggccaggcgg tcgatgtgtc tgtcctccgg aagggcccca 7140

agcacgatgt tggtgccggg caaggtcggc gggatgaggg ccacgaacgc cagcacggcc 7200

tggggggtca tgctgcccat aaggtaccgc gcggccgggt agcacaggag ggcggcgatg 7260

ggatggcggt cgaagatgag ggtgagggcc gggggcgggg catgtgagct cccagcctcc 7320

cccccgatat gaggagccag aacggcgtcg gtcacggcat aaggcatgcc cattgttatc 7380

tgggcgcttg tcattaccac cgccgcgtcc ccggccgata tctcaccctg gtcgaggcgg 7440

tgttgtgtgg tgtagatgtt cgcgattgtc tcggaagccc ccagcacccg ccagtaagtc 7500

atcggctcgg gtacgtagac gatatcgtcg cgcgaaccca gggccaccag cagttgcgtg 7560

gtggtggttt tccccatccc gtggggaccg tctatataaa cccgcagtag cgtgggcatt 7620

ttctgctccg ggcggacttc cgtggcttct tgctgccggc gagggcgcaa cgccgtacgt 7680

cggttgctat ggccgcgaga acgcgcagcc tggtcgaacg cagacgcgtg ttgatggccg 7740

gggtacgaag ccatacgcgc ttctacaagg cgctggccga agaggtgcgg gagtttcacg 7800

ccaccaagat cgatctacag ctggtgggga gagcaggaaa atatggcaac aaatgttgga 7860

ctgacgcaac gaccttgtca accccgccga cacaccgggc ggacagacgg ggcaaagctg 7920

cctaccaggg actgagggac ctcagcaggt cgagtgcaga gcaccggatg ggtcgactgc 7980

cagcttgtgt tcccggtctg cgccgctggc cagctcctga gcggcctttc cggtttcata 8040

caccgggcaa agcaggagag gcacgatatt tggacgccct acagatgccg gatgggccaa 8100

ttagggagct tacgcgccgg gtactcgctc tacctacttc ggagaaggta ctatctcgtg 8160

aatcttttac cagatcggaa gcaattggac ttctgtacct aggttaatgg catgctattt 8220

cgccgacggc tatacacccc tggcttcaca ttctccttcg cttactgccg gtgattcgat 8280

gaagctccat attctccgat gatgcaatag attcttggtc aacgaggggc acaccagcct 8340

ttccacttcg gggcggaggg gcggccggtc ccggattaat aatcatccac tgcacctcag 8400

agccgccaga gctgtctggc gcagtggccg ttattactca gcccttctct ctgcgtccgt 8460

ccgtctctcc gcatgccaga aagagtcacc ggtcactgta cagagctcaa gcttcgatta 8520

actcgagggg gggcccggta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg 8580

ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 8640

cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 8700

cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggaaattgta agcgttaata ttttgttaaa 8760

attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa 8820

aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa 8880

caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca 8940

gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg 9000

taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc 9060

ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc 9120

aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca 9180

gggcgcgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 9240

ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 9300

atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 9360

tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 9420

tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 9480

ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 9540

atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 9600

ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 9660

catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 9720

cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 9780

ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 9840

cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 9900

cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 9960

tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 10020

agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 10080

ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 10140

gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 10200

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 10260

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 10320

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 10380

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 10440

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 10500

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 10560

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 10620

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 10680

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 10740

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 10800

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 10860

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 10920

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 10980

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 11040

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 11100

agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 11160

gattca 11166

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1252-ste-proF

<400> 47

atactctccg tcagcatcct gccag 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物IH1253-ste-500R

<400> 48

ctgctccttc gatccataag gcaac 25

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物HTJP-324

<400> 49

aagggatgca agaccaaacc 20

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物HTJP-325

<400> 50

tgaagaattt gtgttgtctg ag 22

<210> 51

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oAT3303

<400> 51

tgctgcggaa caaggggtgg gagggaaggg tgtacttctt gagagagtta agctagtggt 60

gggcgtcatg ttgtaggcca gat 83

<210> 52

<211> 17132

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒pAT3631

<400> 52

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 60

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 120

gcgctgcgat gataccgcga gaaccacgct caccggctcc ggatttatca gcaataaacc 180

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 240

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 300

ttgttgccat cgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 360

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 420

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 480

tggttatggc agcgctacat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 540

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 600

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 660

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 720

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 780

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 840

ggaaatgttg aatactcata ttcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 900

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggtca 960

gtgttacaac caattaacca attctgaaca ttatcgcgag cccatttata cctgaatatg 1020

gctcataaca ccccttgttt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg 1080

ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggactcc ccatgcgaga 1140

gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 1200

cccgggctaa ttatggggtg tcgcccttat tcgactctat agtgaagttc ctattctcta 1260

gaaagtatag gaacttctga agtggggatt taaatgcggc cgcgctgagg gtttaatcga 1320

cgaagcagct gacggccagt gccaagctta acgcgtaccc gggcccagta tatgttccgc 1380

agatgactgg agctctgcca tacgtgccct ctcaagcacc atttgttcca tctacagaga 1440

ctagtcacca actagtctat caagactcac agggtacatt gctgagacca actgaccaga 1500

ggcagggtag cggattgacg gctccatctc cttcacttac aaggtctatt gaaagccctt 1560

tagcatcacc aagcggagaa tagattgtta agcttatttt ttgtatactg ttttgtgata 1620

gcacgaagtt tttccacggt atcttgtaaa aatatatatt tgtggcgggc ttacctacat 1680

caaattaata agagactaat tataaactaa acacacaagc aagctacttt agggtaaaag 1740

tttataaatg cttttgacgt ataaacgttg cttgtattta ttattacaat taaaggtgga 1800

tagaaaacct agagactagt tagaaactaa tctcaggttt gcgttaaact aaatcagagc 1860

ccgagaggtt aacagaacct agaaggggac tagatatccg ggtagggaaa caaaaaaaaa 1920

aaacaagaca gccacatatt agggagacta gttagaagct agttccagga ctaggaaaat 1980

aaaagacaat gataccacag tctagttgac aactagatag attctagatt gaggccaaag 2040

tctctgagat ccaggttagt tgcaactaat actagttagt atctagtctc ctataactct 2100

gaagctagaa taacttacta ctattatcct caccactgtt cagctgcgca aacggagtga 2160

ttgcaaggtg ttcagagact agttattgac tagtcagtga ctagcaataa ctaacaaggt 2220

attaacctac catgtctgcc atcaccctgc acttcctcgg gctcagcagc cttttcctcc 2280

tcattttcat gctcattttc cttgtttaag actgtgacta gtcaaagact agtccagaac 2340

cacaaaggag aaatgtctta ccactttctt cattgcttgt ctcttttgca ttatccatgt 2400

ctgcaactag ttagagtcta gttagtgact agtccgacga ggacttgctt gtctccggat 2460

tgttggagga actctccagg gcctcaagat ccacaacaga gccttctaga agactggtca 2520

ataactagtt ggtctttgtc tgagtctgac ttacgaggtt gcatactcgc tccctttgcc 2580

tcgtcaatcg atgagaaaaa gcgccaaaac tcgcaatatg gctttgaacc acacggtgct 2640

gagactagtt agaatctagt cccaaactag cttggatagc ttacctttgc cctttgcgtt 2700

gcgacaggtc ttgcagggta tggttccttt ctcaccagct gatttagctg ccttgctacc 2760

ctcacggcgg atctgccata aagagtggct agaggttata aattagcact gatcctaggt 2820

acggggctga atgtaacttg cctttccttt ctcatcgcgc ggcaagacag gcttgctcaa 2880

attcctacca gtcacagggg tatgcacggc gtacggacca cttgaactag tcacagatta 2940

gttagcaact agtctgcatt gaatggctgt acttacgggc cctcgccatt gtcctgatca 3000

tttccagctt caccctcgtt gctgcaaagt agttagtgac tagtcaagga ctagttgaaa 3060

tgggagaaga aactcacgaa ttctcgactc ccttagtatt gtggtccttg gacttggtgc 3120

tgctatatat tagctaatac actagttaga ctcacagaaa cttacgcagc tcgcttgcgc 3180

ttcttggtag gagtcggggt tgggagaaca gtgccttcaa acaagccttc ataccatgct 3240

acttgactag tcagggacta gtcaccaagt aatctagata ggacttgcct ttggcctcca 3300

tcagttcctt catagtggga ggaccattgt gcaatgtaaa ctccatgccg tgggagttct 3360

tgtccttcaa gtgcttgacc aatatgtttc tgttggcaga gggaacctgt caactagtta 3420

ataactagtc agaaactatg atagcagtag actcactgta cgcttgaggc atcccttcac 3480

tcggcagtag acttcatatg gatggatatc aggcacgcca ttgtcgtcct gtggactagt 3540

cagtaactag gcttaaagct agtcgggtcg gcttactatc ttgaaatccg gcagcgtaag 3600

ctccccgtcc ttaactgcct cgagatagtg acagtactct ggggactttc ggagatcgtt 3660

atcgttatcg cgaatgctcg gcatactaac tgttgactag tcttggacta gtcccgagca 3720

aaaaggattg gaggaggagg aggaaggtga gagtgagaca aagagcgaaa taagagcttc 3780

aaaggctatc tctaagcagt atgaaggtta agtatctagt tcttgactag atttaaagag 3840

atttcgacta gttatgtacc tggagtttgg atataggaat gtgttgtggt aacgaaatgt 3900

aagggggagg aaagaaaaag tcgtcaagag gtaactctaa gtcggccatt cctttttggg 3960

aggcgctaac cataaacggc atggtcgact tagagttagc tcagggaatt tagggagtta 4020

tctgcgacca ccgaggaacg gcggaatgcc aaagaatccc gatggagctc tagctggcgg 4080

ttgacaaccc caccttttgg cgtttctgcg gcgttgcagg cgggactgga tacttcgtag 4140

aaccagaaag gcaaggcaga acgcgctcag caagagtgtt ggaagtgata gcatgatgtg 4200

ccttgttaac taggtaccaa tctgcagtat gcttgatgtt atccaaagtg tgagagagga 4260

aggtccaaac atacacgatt gggagagggc ctaggtataa gagtttttga gtagaacgca 4320

tgtgagccca gccatctcga ggagattaaa cacgggccgg catttgatgg ctatgttagt 4380

accccaatgg aaacggtgag agtccagtgg tcgcagataa ctccctaaat tccctgagct 4440

aactctaagt cgaccatgcc gtttatggtt agcgcctccc aaaaaggaat ggccgactta 4500

gagttacctc ttgacgactt tttctttcct cccccttaca tttcgttacc acaacacatt 4560

cctatatcca aactccaggt acataactag tcgaaatctc tttaaatcta gtcaagaact 4620

agatacttaa ccttcatact gcttagagat agcctttgaa gctcttattt cgctctttgt 4680

ctcactctca ccttcctcct cctcctccaa tcctttttgc tcgggactag tccaagacta 4740

gtcaacagtt agtatgccga gcattcgcga taacgataac gatctccgaa agtccccaga 4800

gtactgtcac tatctcgagg cagttaagga cggggagctt acgctgccgg atttcaagat 4860

agtaagccga cccgactagc tttaagccta gttactgact agtccacagg acgacaatgg 4920

cgtgcctgat atccatccat atgaagtcta ctgccgagtg aagggatgcc tcaagcgtac 4980

agtgagtcta ctgctatcat agtttctgac tagttattaa ctagttgaca ggttccctct 5040

gccaacagaa acatattggt caagcacttg aaggacaaga actcccacgg catggagttt 5100

acattgcaca atggtcctcc cactatgaag gaactgatgg aggccaaagg caagtcctat 5160

ctagattact tggtgactag tccctgacta gtcaagtagc atggtatgaa ggcttgtttg 5220

aaggcactgt tctcccaacc ccgactccta ccaagaagcg caagcgagct gcgtaagttt 5280

ctgtgagtct aactagtgta ttagctaata tatagcagca ccaagtccaa ggaccacaat 5340

actaagggag tcgagaattc gtgagtttct tctcccattt caactagtcc ttgactagtc 5400

actaactact ttgcagcaac gagggtgaag ctggaaatga tcaggacaat ggcgagggcc 5460

cgtaagtaca gccattcaat gcagactagt tgctaactaa tctgtgacta gttcaagtgg 5520

tccgtacgcc gtgcataccc ctgtgactgg taggaatttg agcaagcctg tcttgccgcg 5580

cgatgagaaa ggaaaggcaa gttacattca gccccgtacc taggatcagt gctaatttat 5640

aacctctagc cactctttat ggcagatccg ccgtgagggt agcaaggcag ctaaatcagc 5700

tggtgagaaa ggaaccatac cctgcaagac ctgtcgcaac gcaaagggca aaggtaagct 5760

atccaagcta gtttgggact agattctaac tagtctcagc accgtgtggt tcaaagccat 5820

attgcgagtt ttggcgcttt ttctcatcga ttgacgaggc aaagggagcg agtatgcaac 5880

ctcgtaagtc agactcagac aaagaccaac tagttattga ccagtcttct agaaggctct 5940

gttgtggatc ttgaggccct ggagagttcc tccaacaatc cggagacaag caagtcctcg 6000

tcggactagt cactaactag actctaacta gttgcagaca tggataatgc aaaagagaca 6060

agcaatgaag aaagtggtaa gacatttctc ctttgtggtt ctggactagt ctttgactag 6120

tcacagtctt aaacaaggaa aatgagcatg aaaatgagga ggaaaaggct gctgagcccg 6180

aggaagtgca gggtgatggc agacatggta ggttaatacc ttgttagtta ttgctagtca 6240

ctgactagtc aataactagt ctctgaacac cttgcaatca ctccgtttgc gcagctgaac 6300

agtggtgagg ataatagtag taagttattc tagcttcaga gttataggag actagatact 6360

aactagtatt agttgcaact aacctggatc tcagagactt tggcctcaat ctagaatcta 6420

tctagttgtc aactagactg tggtatcatt gtcttttatt ttcctagtcc tggaactagc 6480

ttctaactag tctccctaat atgtggctgt cttgtttttt ttttttgttt ccctacccgg 6540

atatctagtc cccttctagg ttctgttaac ctctcgggct ctgatttagt ttaacgcaaa 6600

cctgagatta gtttctaact agtctctagg ttttctatcc acctttaatt gtaataataa 6660

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tgtgtgttta gtttataatt agtctcttat taatttgatg taggtaagcc cgccacaaat 6780

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ataagcttaa caatctattc tccgcttggt gatgctaaag ggctttcaat agaccttgta 6900

agtgaaggag atggagccgt caatccgcta ccctgcctct ggtcagttgg tctcagcaat 6960

gtaccctgtg agtcttgata gactagttgg tgactagtct ctgtagatgg aacaaatggt 7020

gcttgagagg gcacgtatgg cagagctcca gtcatctgcg gaacatatac tgggcccggg 7080

aagatctcat ggtcatagct gtttccgtta attaatggtt cacttctctt tagaaatcaa 7140

ctgtgggttt tgctttttgc ttcattctct ttgtcttctc catctttgat caaatcctgg 7200

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tcttttgaaa tgtgattaac aaccagtccg ttatatatct tgtacccaga ttacgcccaa 7320

ctcgtgctcc tcagccacaa agatactcaa ttgatagcca agatacatac ataccacaaa 7380

gtaaggactc catgcattga gtattactca tcgtattcta gactactcca aaactcagca 7440

catagacaaa caatacgaac ctcgtctagg ggtgattcag aggcggcaaa gcggggtttt 7500

cgcatttgat gttcctggca cttatgtaag cccacgcttc ccgctcaact aaaccatcag 7560

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agtggcttgc ttgtcaagca atggcatcat tggtctagtg gtagaattcg tcgttgccat 7680

cgacgaggcc cgtgttcgat tcacggatga tgcaggaatt tctactcttg tagattctct 7740

caagaagtac accctttttt tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt 7800

atggaggtgc agaatggcta ttttgttatt ggagcgggtt cgaaacggag ggcaggagac 7860

tttttctaaa tacgtcacgt gatatagagc tgctttaatt aagacctcag ccgagacagc 7920

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gaaaagcaaa ggagcgttta gtgaggggca atttgactca cctcccaggc aacagatgag 8040

gggggcaaaa agaaagaaat tttcgtgagt caatatggat tccgagcatc attttcttgc 8100

ggtctatctt gctacgtatg ttgatcttga cgctgtggat caagcaacgc cactcgctcg 8160

ctccatcgca ggctggtcgc agacaaatta aaaggcggca aactcgtaca gccgcggggt 8220

tgtccgctgc aaagtacaga gtgataaaag ccgccatgcg accatcaacg cgttgatgcc 8280

cagctttttc gatccgagaa tccaccgtag aggcgatagc aagtaaagaa aagctaaaca 8340

aaaaaaaatt tctgccccta agccatgaaa acgagatggg gtggagcaga accaaggaaa 8400

gagtcgcgct gggctgccgt tccggaaggt gttgtaaagg ctcgacgccc aaggtgggag 8460

tctaggagaa gaatttgcat cgggagtggg gcgggttacc cctccatatc caatgacaga 8520

tatctaccag ccaagggttt gagcccgccc gcttagtcat cgtcctcgct tgcccctcca 8580

taaaaggatt tcccctcccc ctcccacaaa attttctttc ccttcctctc cttgtccgct 8640

tcagtacgta tatcttccct tccctcgctt ctctcctcca tccttctttc atccatctcc 8700

tgctaacttc tctgctcagc acctctacgc attactagcc gtagtatctg agcacttctc 8760

ccttttatat tccacaaaac ataacacaac cttcaccatg aacaacggca caaacaactt 8820

ccagaacttc attggaatct cgtcgttgca gaagactttg cgcaacgccc tcatccccac 8880

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cgagaaccgc cagattttga aggacatcat ggatgattac taccgtggtt tcatctcgga 9000

aacgctctcc tccattgacg acatcgattg gacttcgttg ttcgaaaaga tggaaatcca 9060

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gatccataag aagttcgcca acgatgatcg gttcaagaac atgttctcgg ccaagttgat 9180

ttccgacatt ctccccgaat tcgtgatcca taacaacaac tactcggcgt cggagaagga 9240

ggagaagacg caggtcatca agttgttctc gaggttcgcc acatcgttca aagagtattt 9300

taagaatcgt gcgaactgtt tctcggcaga tgatatctcc tcgtcctcct gtcaccgcat 9360

tgtgaacgac aacgcggaaa tcttcttctc gaacgcgttg gtgtataggc gcatcgtgaa 9420

gtccctctcc aacgatgaca tcaacaaaat ctcgggagat atgaaggatt cgctcaagga 9480

gatgtcgttg gaggaaatct actcctatga gaagtatggc gagttcatta cgcaggaggg 9540

catttccttc tacaacgaca tttgtggtaa agtcaactcg tccatgaacc tctactgtca 9600

gaaaaacaag gagaacaaaa acctctataa gctccagaag ttgcataagc agatcctctg 9660

tatcgcagac acctcgtacg aggtccctta caagttcgaa tccgatgagg aggtctacca 9720

gtccgtcaac ggattcttgg acaacatctc ctcgaaacac attgtcgagc ggctccgaaa 9780

gatcggcgat aactacaacg gctacaactt ggacaaaatc tatatcgtct ccaagttcta 9840

tgagtccgtc tcgcagaaaa cctatcgtga ttgggagact atcaacactg cgctcgagat 9900

tcactataac aacatcttgc ctggtaacgg caaatcgaaa gccgacaagg tgaagaaggc 9960

cgtgaaaaac gatctccaga agtcgatcac agaaatcaac gaactcgtct cgaactacaa 10020

gctctgttcg gatgataaca tcaaggcgga aacgtacatc catgaaatct cgcatatctt 10080

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ttccgtgttc atgaccgagg aactcgtcga taaagacaac aacttctacg cggaactcga 10260

ggaaatctac gatgaaatct atcccgtgat ctccctctac aacctcgtgc gaaactacgt 10320

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cctctactac ttgggtatct tcaacgcaaa gaacaagccg gataagaaga tcattgaagg 10500

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caacaagatg attcctaaag tgttcctctc gtcgaagact ggtgtggaaa cgtataagcc 10620

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ctcggaggag aacttgaagg atatcgtgct caaattgaac ggagaggccg aaatcttctt 11040

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gacttacgaa gcagaggaaa aagatcagtt cggaaacatc cagattgtca ggaagaacat 11160

ccctgaaaac atctatcagg agttgtataa gtacttcaac gacaagtcgg ataaggagct 11220

ctccgacgaa gcagccaaac tcaagaacgt cgtcggacac catgaagcag caaccaacat 11280

tgtgaaggac taccggtaca cttacgacaa gtacttcttg cacatgccga tcactatcaa 11340

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aaaggacctc catgtcatcg gtatcgatag gggagaacgg aacctcatct acgtctccgt 11460

gattgacact tgtggcaaca ttgtcgaaca gaagtcgttc aacatcgtca acggttacga 11520

ttaccagatt aagttgaaac agcaggaagg tgcgaggcag attgcgcgaa aggaatggaa 11580

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caaaaaggga cggttcaaag tggagcgtca ggtgtaccag aagttcgaaa caatgttgat 11760

caacaagttg aactacttgg tgttcaagga catttccatt accgagaacg gaggattgct 11820

caagggttat cagctcacgt acatccccga caagttgaaa aacgtgggac accagtgtgg 11880

ctgtatcttc tacgtgcctg cagcctacac gtcgaaaatc gaccctacaa caggattcgt 11940

gaacatcttc aagttcaagg atctcaccgt cgacgcgaag cgggagttca tcaaaaagtt 12000

cgactccatc cgctatgatt cggagaagaa cttgttctgt ttcacattcg actacaacaa 12060

cttcattact cagaacaccg tgatgtccaa atcgtcgtgg tccgtgtaca cgtatggtgt 12120

gcgcatcaaa aggcgcttcg tcaacggtcg cttctccaac gaatcggaca cgatcgatat 12180

cacgaaagac atggagaaaa cattggaaat gaccgacatc aactggcgtg acggccatga 12240

cctcaggcag gacatcatcg attacgagat cgtccagcac atcttcgaaa tcttccgtct 12300

caccgtgcag atgaggaact ccctctccga gctcgaagat cgggattacg accggctcat 12360

ttcccctgtg ttgaacgaga acaacatctt ctacgactcg gcaaaagcgg gagatgcatt 12420

gccgaaggac gccgatgcga acggtgcata ttgtattgca ctcaagggtc tctacgaaat 12480

caagcagatc accgaaaact ggaaggagga cggcacattc tcgagggaca agttgaagat 12540

ttcgaacaag gattggttcg atttcatcca gaacaagagg tacttgcctc cgaagaagaa 12600

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cgaatgaaag aaatggaatt agacttgtta tgtagttgat tctacaatgg attatgattc 12720

ctgaacttca aatccgctgt tcattattaa tctcagctct tcccgtaaag ccaatgttga 12780

aactattcgt aaatgtacct cgttttgcgt gtaccttgct tatcacgtga tattacatga 12840

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gcggaaggta gttttctcgt ccaccccaac gcgtttatca acctcaactt tcaacaacca 12960

tcatgccacc aaaagcgcgt aaaacaaagc gagatttgat tgagcaagag ggcaggatcc 13020

aatgcgcgat tcaagacatt aaaaatggaa aatttcaaaa aattgcgccc gcagcgcgtg 13080

catacaaaat tcatcccaat acaggggacc agacaggcgc cactcggccg ggccacagct 13140

gcttgggtgt tgaccgggag cggaccaatt aaggactcga acgaccgcgg ggttcaaatg 13200

caaacaagta caacacgcag caaacgaagc agcccaccac tgcgttgatg cccagtttga 13260

ctgtccgaaa tccaccggaa aggtggaaac atactatgta acaatcagag ggaagaaaaa 13320

atttttatcg acgaggcagg acagtgactg atggtggggt catggtcggg tctccgagcg 13380

aaagagaacc aaggaaacaa gatcaacgag gttggtgtac ccaaaaggcc gcagcaacaa 13440

gagtcatcgc ccaaaagtca acagtctgga agagactccg ccgtgcagat tctgcgtcgg 13500

tcccgcacat atcgggaagc aagacttgag cgccgagaga agcagttaga ctatcgaaca 13560

cgaatgctgg atgtgttaga tgagagattg gatgatgcct tgcgccgacg catgtccctg 13620

agagacgctg gtccgtatta ctctcgacag tattatgaaa attattgatt tgagttctct 13680

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aataacgtca ttcaccgggg accgttttgt ataccagtgt tgtcgcgacc tgttgcgttt 13860

agtgtatgtt ccacgtatgt actttctcta aaaaaaagtc gaatgagtca tgagaatgag 13920

atatgatatg caccttaccg cactataact gggatcattg tatagtatgg atctgtagag 13980

gacaggatgt tcagggccaa gtcagcagtt gacagcgcat tgcatccggt gacgagaact 14040

tatcgataag ccccaccagt gccggcctca ggcagtccaa cccccgccat agagtgggat 14100

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caaactcgtc gtatcttact tccaccggat ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca 14280

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tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg 14460

gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgagtcga 14520

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tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca 14640

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atccgtcgac ctgcagccaa gctttcgcga gctcgagatc tagagggtga ctgacacctg 14880

gcggtagaca atcaatccat ttcgctatag ttaaaggatg gggatgaggg caattggtta 14940

tatgatcatg tatgtagtgg gtgtgcataa tagtagtgaa atggaagcca agtcatgtga 15000

ttgtaatcga ccgacggaat tgaggatatc cggaaataca gacaccgtga aagccatggt 15060

ctttccttcg tgtagaagac cagacagaca gtccctgatt tacccttgca caaagcacta 15120

gaaaattagc attccatcct tctctgcttg ctctgctgat atcactgtca ttcaatgcat 15180

agccatgagc tcatcttaga tccaagcacg taattccata gccgaggtcc acagtggagc 15240

agcaacattc cccatcattg ctttccccag gggcctccca acgactaaat caagagtata 15300

tctctaccgt ccaatagatc gtcttcgctt caaaatcttt gacaattcca agagggtccc 15360

catccatcaa acccagttca ataatagccg agatgcatgg tggagtcaat taggcagtat 15420

tgctggaatg tcggggccag ttggcccggt ggtcattggc cgcctgtgat gccatctgcc 15480

actaaatccg atcattgatc caccgcccac gaggcgcgtc tttgcttttt gcgcggcgtc 15540

caggttcaac tctctcgcta gcacaattga ggcatcccca ctaccgcatt aagacctcag 15600

cgcggccgca aatttaaata aaatgaagtg aagttcctat actttctaga gaataggaac 15660

ttctatagtg agtcgaataa gggcgacaca aaatttattc taaatgcata ataaatactg 15720

ataacatctt atagtttgta ttatattttg tattatcgtt gacatgtata attttgatat 15780

caaaaactga ttttcccttt attattttcg agatttattt tcttaattct ctttaacaaa 15840

ctagaaatat tgtatataca aaaaatcata aataatagat gaatagttta attataggtg 15900

ttcatcaatc gaaaaagcaa cgtatcttat ttaaagtgcg ttgctttttt ctcatttata 15960

aggttaaata attctcatat atcaagcaaa gtgacaggcg cccttaaata ttctgacaaa 16020

tgctctttcc ctaaactccc cccataaaaa aacccgccga agcgggtttt tacgttattt 16080

gcggattaac gattactcgt tatcagaacc gcccaggggg cccgagctta agactggccg 16140

tcgttttaca acacagaaag agtttgtaga aacgcaaaaa ggccatccgt caggggcctt 16200

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cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 16380

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 16440

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 16500

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 16560

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 16620

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 16680

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 16740

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 16800

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtgggcta actacggcta cactagaaga 16860

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 16920

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 16980

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 17040

gctcagtgga acgacgcgcg cgtaactcac gttaagggat tttggtcatg agcttgcgcc 17100

gtcccgtcaa gtcagcgtaa tgctctgctt tt 17132

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 米曲霉类固醇脱氢酶基因组原型间隔子

<400> 53

tctctcaaga agtacaccct t 21

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oAT3163

<400> 54

ctagcagtct caatcgc 17

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物oAT3164

<400> 55

ttgaccgtga caaagac 17