一种早发型精神分裂症的分子标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种早发型精神分裂症的分子标志物及其应用，所述分子标志物为hsa‑miR‑1255b‑5p，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明分子标志物可以作为诊断精神分裂症的标志物，为精神分裂症的辅助诊断及疗效评价指标选取提供基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种早发型精神分裂症的分子标志物及其应用。

背景技术

精神分裂症是临床最常见的重性精神疾患之一，严重危害人类身心健康，给家庭和社会带来沉重负担。目前，单纯依赖症状学的诊断体系仍然是精神分裂症诊断的金标准，如《精神障碍诊断与统计手册(第五版)》(DSM-5)和国际疾病分类(ICD-10)等。但该诊断方法仍然主要依靠精神科医生的临床会谈，缺乏客观的生理、生化和病理指标；疗效的评价也主要是基于症状学的改变，而这种较为主观的判断极易造成误诊及漏诊。精神分裂症多起病于青少年晚期以及成年早期。既往研究认为生长发育期大脑的神经突触的过度修剪可能是造成精神分裂症早期发病的主要原因。

早发精神分裂症(early-onset schizophrenia,EOS)特指18岁以前发病的精神分裂症。EOS多为隐匿性起病，临床表现与成人精神分裂症相似，诊断标准相同。较成年精神分裂症患者而言，EOS患者较少受成年后环境因素的影响，表现出更显著的前驱期神经发育异常，更严重的家族遗传负担，长期预后更差；为此，选取处于神经发育敏感期且遗传负荷较高的EOS患者作为研究对象，不仅能减少临床异质性，而且能更多地排除环境等社会心理因素对于基因表达的影响，确保基因调控层面生物标记物的准确筛选。

要获得精神分裂症患者活体的脑组织很难，即使在中枢神经系统中发现了生物学改变，也很难在临床上推广应用。但疾病相关的分子标记会随着疾病的发展从组织或细胞上脱落下来，并进入到血液中。而中枢神经系统同样可以通过细胞因子、神经递质和激素，甚至是外泌体(exosomes)等形式影响外周血的基因表达。因此血浆及血清中的基因表达被证实比外周血白细胞更能体现大脑的生理及病理变化。

在影响基因表达的众多分子调控因素中，已知非编码RNA是一类重要的调控因子。MicroRNA(miRNAs)是一种内源性非编码RNA分子，长度在19-22个核苷酸之间，是基因转录后水平调控的重要调节因子。已知miRNA通过与靶基因mRNA的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，致mRNA降解或翻译受阻而发挥转录后调控作用。据估计整个人类基因转录组中约1/3～2/3的mRNA受miRNAs调控，其自身就能构成一个miRNA的协同调控网络。近年来不断积累的证据显示无论是尸检大脑还是外周血(白细胞、血清和血浆)，精神分裂症患者存在特异的miRNA表达谱，但将其单独作为诊断标记的研究却没有一致结果，可靠性较低。

加之精神分裂症的表型异质性极强，其在临床上主要表现为认知、情感、意志行为等方面的一组特征性症状(谱)的组合，因而单一标记物对于疾病的识别和发展程度的评估能力显得不足，复杂症状的异质性导致单一的指标难以适用于所有患者。而神经影像研究认为早期发病的精神分裂症患者在生长发育期间，大脑存在神经突触的过度修剪，其可能是造成严重精神障碍的原因。既往神经影像方面的研究多使用磁共振成像，该手段空间分辨率高；能在活体下反复观测脑活动改变；考察不同脑区间的相互联系。既往研究也发现一些精神分裂症患者异常表达的脑区。相较于健康对照，患者组灰质体积(中位数百分比)在全脑(3％)、颞叶(左侧6％、右侧9.5％)和杏仁核/海马复合体(6.5％，5.5％)呈整体下降趋势。如果基因层面的标记物能够作为疾病的指示器，那么神经影像层面指标的有机联合也许能大大提高该标记物客观诊断的准确性及可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种早发型精神分裂症的分子标志物及其应用，该分子标志物能够快捷、简单、准确的实现早发型精神分裂的客观辅助诊断。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种早发型精神分裂症的分子标志物，所述分子标志物为hsa-miR-1255b-5p，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明第二方面提供一种上述分子标志物在制备早发型精神分裂症检测或疗效评价产品中的应用。

优选地，所述产品包括但不限于试剂盒和药物。

本发明第三方面提供一种用于早发型精神分裂症检测或疗效评价的产品，所述产品包括用于扩增与所述分子标志物互补的cDNA的扩增引物。

优选地，所述产品还包括RNA提取试剂。

优选地，所述扩增引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明第四方面提供一种上述分子标志物在外周血浆中表达量的检测方法，包括如下步骤：

(a)收集外周血浆样品；

(b)提取外周血浆样品中的RNA并反转录，得到cDNA；

(c)采用实时荧光定量和2

优选地，所述实时荧光定量采用的扩增引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明分子标志物可以作为诊断精神分裂症的客观标志物，为精神分裂症的辅助诊断及疗效评价指标选取提供基础；此外，本发明分子标志物还能够作为精神分裂症药物治疗靶点。

本发明采用的扩增引物具有优异的特异性，能够稳定的扩增分子标志物，提高分子标志物的检测准确性。

本发明检测方法中，采用实时荧光定量PCR检测，无需增设探针即可同时检测目的miRNA和内参基因，具有经济、方便、高效的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例1中早发型精神分裂症miRNA分子标记物表达谱；

图2为本发明实施例2中扩大样本量实时荧光定量检测hsa-miR-1255b-5p表达量；

图3为本发明实施例3中hsa-miR-1255b-5p表达量与右侧小脑6区灰质体积(Graymatter volume,GMV)关联分析结果；

图4为本发明实施例3中hsa-miR-1255b-5p表达量与左侧小脑6区灰质体积(Graymatter volume,GMV)关联分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

目前，单纯依赖症状学的诊断体系仍然是精神分裂症诊断的金标准，如《精神障碍诊断与统计手册(第五版)》(DSM-5)和国际疾病分类(ICD-10)等。但该诊断方法仍然主要依靠精神科医生的临床会谈，缺乏客观的生理、生化和病理指标；疗效的评价也主要是基于症状学的改变，而这种较为主观的判断极易造成误诊及漏诊。

有鉴于此，本发明实施例提供一种早发型精神分裂症的分子标志物，该分子标志物为hsa-miR-1255b-5p，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体序列如下：

CGGAUGAGCAAAGAAAGUGGUU。

本发明上述分子标志物与精神分裂存在相关关系，其能够快捷、简单、客观的实现精神分裂的诊断，为精神分裂症的辅助诊断及疗效评价指标选取提供基础；此外，本发明分子标志物还能够作为精神分裂症药物治疗靶点。

本发明另一实施例提供一种上述分子标志物在制备早发型精神分裂症检测或疗效评价产品中的应用。

本发明中，对于产品的类型不作严格限制，例如，上述产品包括但不限于试剂盒。

本发明再一实施例提供一种用于早发型精神分裂症检测或疗效评价的产品，该产品包括用于扩增与所述分子标志物互补的cDNA的扩增引物。

进一步地，该产品还包括RNA提取试剂。

进一步地，上述扩增引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，具体为GGGCGGATGAGCAAAGAAA；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，具体为CAGTGCGTGTCGTGGAGT。

本发明上述扩增引物具有优异的特异性，能够稳定的扩增分子标志物，进而有效提高分子标志物的检测准确性。

本发明又一实施例提供一种上述分子标志物在外周血浆中表达量的检测方法，该检测方法包括如下步骤：

(a)收集外周血浆样品；

(b)提取外周血浆样品中的RNA并反转录，得到cDNA；

(c)采用实时荧光光定量和2

进一步地，实时荧光定量采用的扩增引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明检测方法中，采用实时荧光定量PCR检测，无需增设探针即可同时检测目的环状RNA和内参基因，具有经济、方便、高效的优点。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1

本实施例为早发型精神分裂症的分子标志物的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：

(1)收集10例早发型精神分裂症和10例与之匹配的健康对照的外周血浆样品；

(2)分别提取外周血浆样品中的RNA，并采用每个样品的总RNA制备miRNA文库，具体包括：

a.预处理5μg总RNA，并连接3’接头和5’接头；

b.将连接接头的RNA进行反转录，得到cDNA；

c.对cDNA进行PCR扩增；

d.回收～150bp的PCR扩增片段(对应～22nt的miRNAs)；

(3)将文库变性为单链DNA分子，在Illumina flow cell上捕获，原位扩增为簇(cluster)，并根据操作说明在Illumina HiSeq测序仪上进行50cycle测序，图像分析，碱基识别和Q30质控后，产生原始reads，然后，使用cutadapt软件(v1.9.3)对原始reads去接头，去低质量reads，保留长度≥15nt的reads，得到去接头后的reads(即trimmed reads)。然后，合并所有样品的trimmed reads，利用miRDeep2软件(v2.0.0.5)进行新miRNA预测。使用Novoalign软件(v3.02.12)将每个样品的trimmed reads比对到合并的人类pre-miRNAs数据库上(miRBase pre-miRNAs(v21)+新预测的pre-miRNAs)，最多允许1处错配。统计比对到每条成熟miRNA上的tag数作为该miRNA的原始表达量，并使用TPM(tag counts permillion aligned miRNAs)方法进行标准化。计算两个样品间的Fold change，并筛选差异表达miRNAs。计算两组样品(有重复)间的P-value和Fold Change(如图1所示，图中，利用FC和P值绘制火山图，红色矩形代表差异表达的miRNAs(P值≦0.05，|FC|≧2.0倍))，筛选差异表达的基因，最终通过数据分析确定了目的基因为hsa-miR-1255b-5p。

实施例2

本实施例为实施例1中早发型精神分裂症分子标志物hsa-miR-1255b-5p尽可能免受样本个体异质性的前提下，进行表达趋势的验证，具体如下：

在扩大样本量(40例早发型精神分裂症患者和50例健康对照的外周血浆样品)中进行了实时荧光定量实验，以验证其表达趋势是否与一致，具体包括以下步骤：

(1)收集早发型精神分裂症患者和健康对照的外周血浆样品；

(2)RNA的提取及反转录；

(3)实时荧光定量，其中，实时荧光定量采用的上游引物为TGGCAAACACTGGAATCCTAC；

下游引物为GGGGAAATCAGGTAGAGAGAAAC；

(4)通过2

其中，40例早发型精神分裂症患者(EOS)与50例健康志愿者(HCs)的检测表达量如图2所示；

由图2可知：早发型精神分裂症患者与健康志愿者的外周血浆中hsa-miR-1255b-5p的表达量具有显著差异，因此，hsa-miR-1255b-5p可以作为早发型精神分裂症特异的客观标志物，能够用于早发型精神分裂症的辅助诊断。

实施例3

本实施例为实施例1中早发型精神分裂症分子标记物进行影像关联分析，以差异脑区为Mask,提取出每个差异脑区(双侧小脑)的平均灰质体积(mm

①先对患者和健康对照的结构磁共振数据进行预处理，包括如下步骤：

a.提取每个人磁共振图像的T1结构项；

b.对原始T1项原点矫正；

c.分割T1为灰质，白质，脑脊液；

d.利用线性与非线性仿射变换将灰质图像进行标准化，配准到MNI标准空间，体素大小为1.5×1.5×1.5mm

e.计算每个人的全脑体积(TIV)做为协变量在下一步的统计分析中，来消除个体大脑大小和体积差异的影响；

f.将所有的灰质图像使用6mm的高斯平滑核进行平滑。

②统计：病人与健康对照之间采用双样本T检验，性别，年龄，全脑体积做为协变量，设置绝对阈值0.1。

③分子标志物hsa-miR-1255b-5p表达量与右侧小脑6区灰质体积(Gray mattervolume,GMV)关联分析结果如图3所示，分子标志物hsa-miR-1255b-5p表达量与左侧小脑6区灰质体积(Gray matter volume,GMV)关联分析结果如图4所示；

结果显示，早发型精神分裂症患者相较与健康对照，双侧小脑6区和8区灰质体积呈明显下降趋势(蓝色区域)，FDR矫正p＜0.05。这与之前实施例2中大样本数据上得出的结果大致是一样的。小脑属于低级的感觉运动区域，同时小脑在小脑-丘脑-大脑皮层-小脑(CCTCC)这个环路中有着重要的作用，与认知情感功能密切相关。这符合正常人的大脑发育轨迹，从低级功能区到高级区域发育过程，青少年损伤过程也是从低级区域开始。此外，患者右侧小脑6区灰质体积(Gray matter volume,GMV)减少与hsa--miR-1255b-5p的2

综上，本发明分子标志物可以作为精神分裂症检测的标志物，为精神分裂症的辅助诊断及疗效评价指标选取提供基础；此外，本发明分子标志物还能够作为精神分裂症药物治疗靶点。

本发明采用的扩增引物具有优异的特异性，能够稳定的扩增分子标志物，提高分子标志物的检测准确性。

本发明检测方法中，采用实时荧光定量PCR检测，无需增设探针即可同时检测目的环状RNA和内参基因，具有经济、方便、高效的优点。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。