用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物和试剂盒及使用方法

摘要

本发明提供了一组可用于检测多囊卵巢综合征的生物标志物，并进一步提供包含该等生物标志物的用于检测多囊卵巢综合征的试剂盒及其使用方法，可用于对多囊卵巢综合征的快速高效诊断。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及多囊卵巢综合征诊断检测用的生物标志物和试剂盒领域。

背景技术

当前我国人群生殖健康面临严峻挑战，育龄人群不孕不育率逐年升高，全国生殖健康调查数据显示，我国育龄人群不孕率从2007年的11.9%上升至2020年的17.9%，估计全国不孕夫妇超过2000万。多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）是一种复杂、异质性的内分泌代谢紊乱症候群，是育龄妇女无排卵性不孕最主要的原因，占80%以上。由于种族特异性及诊断标准不一，各国报道的PCOS发病率在5~10%，我国流行病学调查研究显示社区育龄女性中PCOS发病率高达5.6%。

PCOS患者表型复杂、多样，呈现高度异质性。PCOS基本临床表型有雄激素过多（高雄激素血症）、排卵功能异常（稀发排卵/无排卵）、卵巢多囊样改变。此外，PCOS患者的内分泌和代谢异常还表现在黄体生成素（luteinizing hormone, LH）水平增高、黄体生成素与促卵泡生成素（follicle stimulating hormone, FSH）比值（LH/FSH）增高、肥胖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、异常脂质血症等。

由于PCOS的临床表现和生化指标的异常呈高度异型性，包括从了轻微症状到伴有严重的生育障碍和多种内分泌代谢紊乱，而任何一种临床表现都不是PCOS所特有的，也不会表现于所有的PCOS患者中。正是由于PCOS的这一临床特点，使得PCOS的诊断标准一直以来争议很大。1990年美国国家健康协会（NIH）认为必须具备以下两点才可诊断: ① 临床雄激素过高或生化雄激素过高；②月经失调。2006年雄激素协会(AES) 的标准是高雄激素为必须的, 稀发排卵或无排卵和多囊卵巢之间有一项即可。目前在我国应用较广泛的是2003年美国生殖医学会鹿特丹会议提出的诊断标准，符合以下三项中的两项即可诊断为PCOS：①稀发排卵或无排卵；②实验室检查提示高雄激素血症或者具有高雄激素的临床表现；(3) 在月经周期或黄体酮撤退后出血的第3~5天进行超声检查，显示双侧卵巢均有≥12个且直径2~9mm 的卵泡，即卵巢多囊样改变，和/或卵巢体积大于10 ml。此外，诊断时还需除外引起高雄激素血症的其它原因，如高泌乳素血症和甲状腺疾病、先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征、雄激素分泌性肿瘤、21-羟化酶缺乏性非典型肾上腺皮质增生、外源性应用雄激素等。

根据以上诊断标准，患者需要在不同时间点进行多项临床检查，包括在月经第3~5天抽血检测性激素水平、在月经干净后的3~7天做超声检查卵巢卵泡数量及体积（有性生活经历的女性经阴道B超，无性生活经历的女性做经腹部或者经直肠B超检查），基本检查费用约800元（其中性激素6项检测约260元，AMH检测约340元，B超约180元），此外往往还会进行空腹血糖、血胰岛素、血脂等代谢指标的辅助检查。因此，亟需筛选PCOS特异标记物进而开发快速、便捷、经济的诊断方法，节约病人经济成本、时间成本和人力成本。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一组可用于诊断或检测多囊卵巢综合征（PCOS）的标记物分子、试剂盒及其应用。

本发明的第一个方面，提供了一组可用于多囊卵巢综合征诊断的生物标志物，所述生物标志物包括多种氨基酸，所述氨基酸至少包括酪氨酸、天门冬酰胺、瓜氨酸、苏氨酸和肌氨酸。

在一种实施方案中，所述生物标志物包括缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、精氨酸、瓜氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、肌氨酸、γ氨基丁酸。

在一种实施方案中，本发明生物标志物指受试体生物样本中存在的代谢物成分，受试体可以是人类或哺乳动物。生物样本可选自来源于受试体的血浆或血清。优选的，所述生物样本为血清。

本发明的第二个方面，提供将所述的生物标志物用于制备诊断或检测受试体多囊卵巢综合征的试剂盒的用途，所述试剂盒的使用方法包括，可通过测试受试体血浆或血清中代谢物的水平，任选地结合临床指标，诊断或检测受试体多囊卵巢综合征。

本发明的第三个方面，提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于定量检测生物标志物表达水平的试剂，所述生物标志物为酪氨酸、天门冬酰胺、瓜氨酸、苏氨酸和肌氨酸。

在一种实施方案中，所述试剂盒的使用方法为利用质谱仪对受试者血液或血清中的生物标志物水平进行定量检测。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 确定PCOS中显著差异的氨基酸。(A). 火山图分析PCOS组显著差异氨基酸，其中灰色圆点表示显著上调的氨基酸；灰色菱形表示显著下调的氨基酸。Val缬氨酸, Ile异亮氨酸, Leu亮氨酸, Tyr酪氨酸, Phe苯丙氨酸, Trp色氨酸, Kyn犬尿氨酸, Gln谷氨酰胺, His组氨酸, Asp天门冬氨酸, Asn天门冬酰胺, Arg精氨酸, Pro脯氨酸, Orn鸟氨酸,Cit瓜氨酸, Met甲硫氨酸, Thr苏氨酸, Sar肌氨酸, EA乙醇胺, GABA γ氨基丁酸, Gly甘氨酸。(B). 差异氨基酸的显著性比较，其中灰色圆点表示PCOS中上调氨基酸的显著性，灰色菱形表示PCOS中下调氨基酸的显著性。fold change, 氨基酸水平变化倍数; FDR,PCOS和对照组比较的显著性（校正后P值）。

图2筛选与PCOS发生密切相关的氨基酸。(A). 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），横坐标表示正交信号校正过程中的主要成分的得分值，从横坐标的方向可以看出两组间差异，圆形表示对照组，三角形表示PCOS组，两组区分明显；从纵坐标上看组内样本间的差异，对照组和PCOS组组内样本间无明显差异。(B). OPLS-DA分析的模型检验，横坐标permutations表示模型的准确率，纵坐标表示100次permutation test中100个模型的准确率的频数，箭头表示改OPLS-DA模型准确率所在的位置，其中R2Y分别表示所建模型对Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，理论上数值高于0.5较好，越接近1越好。该模型Q2=0.714, R2Y=0.734, P<0.01，提示模型预测能力较好。(C). OPLS-DA的S-plot图，用来筛选正交信号校正过程中与主要成分的相关性比较强的氨基酸。横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，虚线表示纵坐标为0.5，在虚线上方的灰色圆点表示这些氨基酸的VIP值大于1。Val缬氨酸, Ile异亮氨酸, Leu亮氨酸, Tyr酪氨酸, Phe苯丙氨酸, His组氨酸, Asn天门冬酰胺, Arg精氨酸, Cit瓜氨酸, Met甲硫氨酸, Thr苏氨酸, Sar肌氨酸, GABA γ氨基丁酸。

图3 ROC曲线分析。AA signature, 5种氨基酸建模预测PCOS发生概率; AMH, 抗苗勒试管激素;T, 总睾酮; A, 雄烯二酮; LH/FSH, 黄体生成素与促卵泡刺激素比值。

图4肥胖人群ROC曲线分析。AA signature, 5种氨基酸建模预测正常体重人群发生PCOS概率; AMH, 抗苗勒试管激素;T, 总睾酮; A, 雄烯二酮; LH/FSH, 黄体生成素与促卵泡刺激素比值。

图5正常体重人群ROC曲线分析。AA signature, 5种氨基酸建模预测正常体重人群发生PCOS概率; AMH, 抗苗勒试管激素;T, 总睾酮; A, 雄烯二酮; LH/FSH, 黄体生成素与促卵泡刺激素比值。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.研究对象及样本采集

研究经北京大学第三医院伦理委员会批准，招募2017年0月至2018年12月就诊于北京大学第三医院生殖医学中心的女性患者。

1.1 纳入标准：

PCOS组：依据2003年鹿特丹PCOS诊断标准选择入组人群，符合下列三项条件中的两项即可：月经稀发和/或闭经、高雄激素血症或者高雄激素的临床表现（多毛、痤疮等）、超声下卵巢呈多囊样改变；同时排除引起高雄激素血症的其它原因。

对照组：因双侧输卵管梗阻或者因单纯男方因素就诊治疗的患者，其月经周期规律，并且无高雄激素和多囊样卵巢表现；

排除标准：诊断为子宫肌瘤、子宫内膜异位症、生殖系统畸形和卵巢肿瘤的患者；诊断为甲状腺疾病、糖尿病和心血管疾病的患者。

所有入选对象3个月内无服用激素类药物的病史。

1.2入组患者检测指标：

基本指标：年龄、身高、体重、血压等；

内分泌代谢指标：月经第3~5天抽血检测性激素水平（泌乳素、促卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、雌激素、孕酮、总睾酮T、雄烯二酮A）、性激素结合球蛋白SHBG、抗苗勒试管激素AMH；空腹血糖，空腹胰岛素，血脂（胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白）等；

B超检测：在月经干净后的3~7天做超声检查卵巢卵泡数量及体积（有性生活经历的女性经阴道B超，无性生活经历的女性做经腹部或者经直肠B超检查），确定窦卵泡数（AFC）。

质谱检测全谱氨基酸水平

主要仪器：高效液相色谱-四级杆离子 阱 串 联 质 谱 仪（HPLC /Q-TRAP-MS/MS，LC 液相：美国戴安公司；质谱：美国 AB 公司）

检测方法：液相色谱采用的是梯度洗脱的方法，色谱柱选择 MSLab-AA-C18，柱 温控 制 在 50℃，流 速 为1 ml/min，进样量为 5 微升。色谱柱的流动相：A 为去离子水（含有 1%甲酸）；B 为乙腈（含有 1%甲酸）。质谱条件：离子源为电喷雾离子源，采用正离子检测模式，扫描方式为多反应监测。样本前处理：取标准品混标、待测血样本 50微升，加 50 微升蛋白沉淀剂，混匀后 4℃、13 200 r/min 离心（离心半径为7.4 cm）4 min。取上清 10微升加 50微升标记缓冲液混匀，瞬离。再加20 微升衍生液混匀，瞬离后置 55℃恒温衍生 15min。将衍生后的样本置冰箱冷却后混匀瞬离，取50 微升上机检测。

定量检测全谱氨基酸指标（50种）： 丝胺酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、磷酸丝胺酸、磷酸乙醇胺、牛磺酸、羟基脯氨酸、乙醇胺、瓜氨酸、同型瓜氨酸、鸟氨酸、精氨基琥珀酸、肌氨酸、β-丙氨酸、肌肽、鹅肌肽、α氨基已二酸、γ氨基丁酸、3氨基异丁酸、2氨基异丁酸、2氨基正丁酸、5-羟基赖氨酸、5氨基戊酸、6氨基已酸、同型半胱氨酸、胱硫醚、5羟色胺、5羟色氨酸、犬尿氨酸、3甲基组氨酸、同型精氨酸、同型脯氨酸、同型丝氨酸。

筛选可用于PCOS精确诊断的氨基酸标记物

3.1 确定PCOS组中显著差异的氨基酸

筛选符合入组标准的人群，最终共入组380例，包括190例PCOS患者和190例对照组，两组人群基本特征及临床检测指标标记如表1所示。两组间年龄、BMI、血压、泌乳素、促卵泡刺激素、雌激素、孕酮、空腹血糖、高密度胆固醇均无显著差异；PCOS组中内分泌、血脂、胰岛素敏感性、肝功、炎症相关指标异常，具体为黄体生成素LH、雄激素（总睾酮、雄烯二酮）、抗苗勒试管激素AMH、窦卵泡数AFC、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、尿酸、C反应蛋白水平显著高于对照组（

表1：PCOS和对照组临床检测指标比较

注释：

临床指标英文及缩写：收缩压, SBP; 舒张压, DBP; 泌乳素, Prolactin; 雌激素, Estradiol; 总睾酮, Total testosterone; 雄烯二酮, Androstenedione; 孕酮,Progesterone; 空腹血糖, FPG, fasting plasma glucose; 空腹胰岛素, FSI, fastingserum insulin; 胰岛素抵抗指数, HOMA-IR, homeostasis model assessment ofinsulin resistance; 总胆固醇, TC, total cholesterol; 低密度脂蛋白, LDL-C,low-density lipoprotein cholesterol; 高密度脂蛋白, HDL-C, high-densitylipoprotein cholesterol; 谷丙转氨酶, ALT, Alanine aminotransferase; 谷草转氨酶, AST, Aspartate aminotransferase; γ-谷氨酰转肽酶, γ-GT, γ-glutamyltranspeptidase; 尿酸, Uric acid; C反应蛋白, CRP, C-reactive protein。

统计分析方法：采用SPSS 20.0软件进行数据处理和分析。数据符合正态分布的用平均值±标准差表示，不符合正态分布的采用中位数和（25%-75%四分位区间差）表示，组间差异比较分别采用t检验或非参数检验（Mann–Whitney U检验），

利用质谱方法定量检测PCOS和对照组血浆样本中全谱氨基酸水平，其中45种氨基酸在检测范围内。与对照组比较，PCOS组中多种氨基酸水平均显著升高，包括丙氨酸、支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）、芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸）、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苏氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸等；而甘氨酸水平则在PCOS组显著降低（见表2，图1）。

表2：PCOS和对照组血浆氨基酸水平分析（单位μmol/L）

注释：

氨基酸英文：丙氨酸, Alanine; β-丙氨酸, β-alanline; 缬氨酸, Valine; 异亮氨酸, Isoleucine; 亮氨酸, Leucine; 酪氨酸, Tyrosine; 苯丙氨酸,Phenylalanine; 色氨酸, Tryptophan; 5羟色氨酸, 5-Hydroxytryptophan; 5羟色胺（褪黑素）,Serotonin; 犬尿氨酸, Kynurenine; 谷氨酸, Glutamic acid; 谷氨酰胺,Glutamine; 组氨酸, Histidine; 1甲基组氨酸Methylhistidine; 3甲基组氨酸, 3-methylhistidine; 天门冬氨酸, Aspartic acid; 天门冬酰胺, Asparagine; 甘氨酸,Glycine; 精氨酸, Arginine; 羟基精氨酸, Hydroxyarginine; 脯氨酸, Proline; 同型脯氨酸, Homoproline; 羟基脯氨酸, Hydroxyproline; 赖氨酸, Lysine; 5-羟基赖氨酸, Hydroxylysine; 鸟氨酸, Ornithine; 瓜氨酸, Citrulline; 甲硫氨酸,Methionine; 半胱氨酸, Cystine; 同型半胱氨酸, Homocysteine; 苏氨酸, Threonine;丝氨酸, Serine; 肌氨酸, Sarcosine; 牛磺酸, Taurine; 乙醇胺, Ethanolamine; 磷酸乙醇胺, Phosphoethanolamine; α氨基已二酸, α-aminoadipic acid; γ-氨基丁酸,γ-aminobutyric acid; 2氨基正丁酸, 2-aminobutyric acid; 3氨基异丁酸, 3-aminoisobutyric acid; 胱硫醚, Cystathionine; 鹅肌肽, Anserine; 精氨基琥珀酸,Argininosuccinic acid。

统计分析方法同表1。

3.2 筛选与PCOS发生密切相关的氨基酸标记物

通过多元统计分析方法筛选与PCOS发生密切相关的氨基酸。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）是一种新型多元统计方法，由Johan Tryggde等人于2002年首次提出，OPLS-DA最大的特点是可以滤除自变量中与分类变量无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，从而使模型变得简单和易于解释，提高了模型的解析能力和有效性。我们利用OPLS-DA方法建立了氨基酸谱与PCOS疾病分组关系之间的模型，通过得分图可以看出该模型可以将PCOS和对照组很好的区分开（图2A），并且模型验证结果显示其预测能力较好（图2B）。结合模型系数和VIP值分析，取主成分与代谢物的相关系数>0.5（即VIP>1）为显著自变量的标准，筛选与PCOS发病密切相关的一组氨基酸标记物（图2C）。

3.3 建立基于氨基酸标记物的PCOS诊断模型

利用3.2多元统计分析筛选出的PCOS氨基酸标记物（缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、精氨酸、瓜氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、肌氨酸、 γ氨基丁酸）建立预测PCOS是否发生的模型。首先，应用二分类Logist回归分析，将上述氨基酸标记物纳入模型变量分析，计算受试者发生PCOS的预测概率。Logist回归分析模型系数的综合检验

表3：基于5种氨基酸标记物的PCOS发生的Logisit回归分析

根据上述回归结果可以写出每个受试者根据这5种氨基酸水平预测PCOS是否发生的危险得分Logit(P):

Logit(P)= -15.126 + 0.069*Tyrosine level + 0.067*Asparagine level+0.236*Citrulline level+ 0.025*Threonine level+0.362*Sarcosine level

并可以按照以下公式计算得到每一个受试者发生PCOS的预测概率：

至此，我们可以根据受试者的真实患病情况和预测概率，评估根据上述5种氨基酸水平预测个体是否发生PCOS的准确性。利用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）来判定这组氨基酸对PCOS疾病发生的诊断能力，分析表明该组氨基酸诊断试验的ROC曲线下面积是 0.975 (0.961-0.990)，其灵敏度95.4%、准确性91.3%，并与目前临床常用的PCOS内分泌诊断指标AMH、雄激素(总睾酮T、雄烯二酮A)、LH/FSH、及以上内分泌指标联合预测概率(AMH+T+A+LH/FSH) 进行比较，结果显示5种氨基酸建立的模型诊断的曲线下面积、灵敏度、准确性均明显高于以上临床常规使用诊断指标（图3，表4）。

表4：ROC曲线分析数据

由于肥胖是PCOS患者最常见的代谢问题，我们根据是否合并肥胖将PCOS和对照组进行亚型分组。按照BMI≥25 kg/m2为界值，将对照组和PCOS组进一步分成对照体重正常组（Control-N），对照合并肥胖组（Control-OB），PCOS体重正常组（PCOS-N），PCOS合并肥胖组（PCOS-OB），各亚组临床检测指标见表5，氨基酸水平见表6。

表5：PCOS和对照组按照是否合并肥胖代谢亚型分组临床检测指标

注释：英文及缩写、统计分析方法同表1。

表6：PCOS和对照组按照是否合并肥胖代谢亚型分组氨基酸水平（单位μmol/L）

注释：氨基酸英文及统计分析同表2。

1. 代谢亚型分析1：肥胖对照vs.肥胖PCOS

选择BMI≥25 kg/m2的肥胖人群为研究对象，将前面筛选出的5种氨基酸纳入Logist回归分析，分析方法选择进入，计算受试者发生PCOS的预测概率。Logist回归分析模型系数的综合检验

表7：基于5种氨基酸标记物的肥胖人群发生PCOS的Logisit回归分析

根据上述回归结果可以写出每个受试者根据这5种氨基酸水平预测PCOS是否发生的危险得分Logit(P):

Logit(P)= -19.908 + 0.118*Tyrosine level + 0.014*Asparagine level+0.308*Citrulline level+ 0.048*Threonine level+0.391*Sarcosine level

同样计算得到每一个体重正常受试者发生PCOS的预测概率：

根据体重正常受试者的真实患病情况和预测概率，评估根据上述5种氨基酸水平预测体重正常个体是否发生PCOS的准确性。ROC曲线分析表明该组氨基酸诊断试验的ROC曲线下面积是 0.981(0.964-0.999)，其灵敏度94.5%、准确性93.2%，同样均明显高于临床PCOS常规诊断的一系列内分泌指标（图4，表8）。

表8：肥胖人群ROC曲线分析数据

2. 代谢亚型分析2：体重正常对照vs.体重正常PCOS

选择BMI<25 kg/m

表9：基于5种氨基酸标记物的正常体重人群发生PCOS的Logisit回归分析

根据上述回归结果可以写出每个体重正常受试者根据这5种氨基酸水平预测PCOS是否发生的危险得分Logit(P):

Logit(P)= -14.550 + 0.053*Tyrosine level + 0.108*Asparagine level+0.231*Citrulline level+0.019*Threonine level+0.338*Sarcosine level

同样计算得到每一个体重正常受试者发生PCOS的预测概率：

根据体重正常受试者的真实患病情况和预测概率，评估根据上述5种氨基酸水平预测体重正常个体是否发生PCOS的准确性。ROC曲线分析表明该组氨基酸诊断试验的ROC曲线下面积是 0.976(0.956-0.996)，其灵敏度94.9%、准确性92.2%，同样均明显高于临床PCOS常规诊断的一系列内分泌指标（图5，表10）。

表10：正常体重人群ROC曲线分析数据

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。