包含参见序列表的淀粉酶变体的清洁组合物

摘要

本发明涉及包含α淀粉酶的变体的清洁组合物，和用包含此类组合物的含水的液体处理表面如织物的方法，尤其是在低的温度下。

说明书

本申请是申请日为2012年6月29日、发明名称为“包含参见序列表的淀粉酶变体的清洁组合物”的中国专利申请No.201280031460.X的分案申请。

本专利申请包含计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及包含α-淀粉酶的变体的清洁组合物，所α-淀粉酶的变体相对于其亲本淀粉酶具有改善的在冷水表面处理过程中的清洁性能。

背景技术

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，它们催化淀粉与其他直链和支链1,4-葡糖苷低聚-和多糖的水解。

所使用的第一细菌α-淀粉酶之一是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，也称为特妙淀粉酶，其已经被广泛的表征并且已经测定了这种酶的晶体结构。碱性淀粉酶如来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的α-淀粉酶在WO 95/26397中公开，它们构成一组在洗涤剂中使用的特殊α-淀粉酶。多种这些已知的细菌淀粉酶已经经修饰已改善它们在特定应用中的功能。

提高α-淀粉酶的热稳定性的方法已被很好地研究。Suzuki等人(1989)公开了嵌合的α-淀粉酶，在其中解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的特定区域被地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶的相应区域替换。构建上述嵌合的α-淀粉酶的目的是鉴定负责热稳定性的区域。此类区域被发现包括解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的氨基酸残基177-186和氨基酸残基255-270。Igarashi等人(1998)显示，通过从环(F178至A184)删除R179-G180(AmyS计数)两个氨基酸残基，能够提高AmyS-型淀粉酶的热稳定性。然而，Shiau等人(2003)显示，就玉米淀粉在高温度的水解而言，在相同的环中具有缺失的AmyS酶具有比亲本酶更低的特异性活性，否定了AmyS淀粉酶的主要优势之一。

出于环保原因，降低洗涤、盘碟洗涤和/或清洁过程中的温度已经越来越重要。然而，包括淀粉酶在内的大多数酶具有高于低温洗涤中通常使用的温度的最佳温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶，并且就含淀粉的污渍在衣物洗涤或盘碟洗涤过程中的去除而言，其使用已变得日益重要。因此，找到当温度降低时保持了它们的洗涤性能、去污效果和/或活性的α-淀粉酶是重要的。然而，无论当前的洗涤剂酶组合物的效率如何，有许多污渍难以被彻底地除去。低(例如，冷水)洗涤温度和更短的洗涤周期的使用的增加使这些问题更加复杂化。因此，希望拥有能够在低温下发挥作用并且同时保持或提高其他合乎期望的性能如特异性活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能的淀粉分解酶。

因此，提供包含能够在低温如5-35℃的温度下的洗涤、盘碟洗涤和/或清洁过程中使用的α-淀粉酶变体的清洁组合物，是本发明的一个目的。提供与亲本α-淀粉酶相比或与任何SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的α-淀粉酶相比，具有改善的在低温下的洗涤性能的α-淀粉酶变体，是本发明的另一个目的。

发明内容

在本发明的第一个方面，提供了清洁组合物，其包含：

(a)亲本α淀粉酶的变体，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地是替换、缺失或插入，并且其中所述变体与任何SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80％、或至少87％，但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α淀粉酶活性；

(b)和清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％。

本发明还提供了处理表面(优选织物)的方法，所述方法包括(i)形成含水的洗涤液体，所述洗涤液体包含水和清洁组合物，所述清洁组合物包含：

；并且

(a)亲本α淀粉酶的变体，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地是替换、缺失或插入，并且其中所述变体与任何SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80％、或至少87％，但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α淀粉酶活性；以及

(b)清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％；

(ii)优选在40℃或更低的温度，或更优选在30℃或更低的温度，最优选在20℃或更低的温度，用所述含水的洗涤液体处理所述表面；和(iii)冲洗所述表面。

根据本发明的另外的方面，提供了清洁组合物，所述清洁组合物包含：亲本α淀粉酶的变体，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地是替换、缺失或插入，并且其中所述变体与任何SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80％、或至少87％，但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α淀粉酶活性；和清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％。

本发明还提供了处理表面(优选织物)的方法，所述方法包括：

(i)形成包含水和此类清洁组合物的含水的洗涤液体，

(ii)优选在40℃或更低的温度下，或更优选在30℃或更低的温度下，最优选在20℃或更低的温度下，用所述含水的洗涤液体处理所述表面；以及

(iii)冲洗所述表面。

具体实施方式

本发明提供了清洁组合物，所述清洁组合物包含：

(a)亲本α淀粉酶的变体，所述变体包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地是替换、缺失或插入，并且其中所述变体与任何SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80％、或至少87％，但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α淀粉酶活性；并且

(b)清洁助剂，优选其量为0.01至99.9重量％。

α-淀粉酶活性：术语“α-淀粉酶活性”是指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶的活性，E.C.3.2.1.1，其构成一组酶，它们催化淀粉与其他直链和支链1,4-葡糖苷低聚糖和多糖的水解。

变体：术语“变体”是指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即替换、插入、和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。替换是指占据一个位置的氨基酸被不同的氨基酸的替代；缺失是指占据一个位置的氨基酸的移除；而插入是指在邻近占据一个位置的氨基酸处添加1-3个氨基酸。

突变体：术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。

野生型酶：术语“野生型”α-淀粉酶是指由天然存在的微生物例如天然存在的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。

亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”是指对其进行修改以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。

分离的变体：术语“分离的变体”是指经人工修改的变体。在一个方面，所述变体是至少1％纯的，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、和至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所测定的。

基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”是指按重量计包含至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、和至多0.5％的其他多肽物质的制剂，所述多肽物质是与其天然地或重组地相关联的。优选地，所述变体按所述制剂中存在的总多肽物质的重量计是至少92％纯的，例如，至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％、至少99.5％纯、和100％纯的。本发明的变体优选地为基本上纯的形式。这能够通过例如为人们所熟知的重组方法或经典的纯化方法制备变体来实现。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指处于其在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等之后最终形式的多肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性，这种相关性用参数“序列同一性”描述。

就本发明的目的而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)如EMBOSS软件包在Needle程序中执行的(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16 276-277)来确定，优选3.0.0或更新的版本。所用的任选参数是，为10的空位罚分，为0.5的空位延伸罚分，和EBLOSUM62(EMBOSS版的BLOSUM62)替换矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

(相同残基×100)/(序列长度-序列中的总空位数)。

就本发明的目的而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包在Needle程序中执行的(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，同上)Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)(优选3.0.0或更新的版本)来确定。所用的任选参数是10的空位罚分，0.5的空位延伸罚分，和EDNAFULL(EMBOSS版的NCBI NUC4.4)替换矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并且如下计算：

(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(序列长度-序列中的总空位数)。

片段：术语“片段”是指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端删除了一个或多个(若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。

亚序列：术语“亚序列”是指从成熟多肽编码序列的5′和/或3′端删除了一个或多个(若干个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。

等位变体：术语“等位变体”指占据相同染色体座位的基因的任何两个或更多个供选择的替代形式。等位变体天然来源于突变，并且可导致种群内的多态性。基因突变可为沉默突变(不改变编码的多肽)或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”是指经人工修改的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯、至少90％纯、和至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的、或它们的任何组合。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”指不含其他外来的或不期望的核苷酸并且其形式适用于遗传工程的多肽制备体系的多核苷酸制剂。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计包含至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、和至多0.5％的其他多核苷酸物质，所述其他多核苷酸物质是与该多核苷酸天然地或重组地相关联的。然而基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选地，所述基本上纯的多核苷酸按重量计是至少90％纯的，例如，至少92％纯、至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯、和99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地为基本上纯的形式。

编码序列：术语“编码序列”指多核苷酸，它直接确定其多肽产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，它通常起始于ATG起始密码子或供选择的起始密码子如GTG和TTG并终止于终止密码子如TAA、TAG、和TGA。编码序列可为DNA、cDNA、合成的、或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”是指能够通过逆转录从自真核细胞获得的成熟的、经拼接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初始RNA转录物是mRNA的前体，其在作为成熟的经拼接的mRNA出现之前，通过一系列步骤，包括拼接，被加工。

核酸构建体：术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，它是从天然存在的基因分离的，或者是以否则将不会天然地存在的方式经过修改以包含核酸的片段的，或者它是合成的。当所述核酸构建体包含本发明的编码序列的表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。

控制序列：术语“控制序列”是指编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的全部组件。每一控制序列可以是对编码所述变体的多核苷酸而言天然的或外源的，或对彼此而言天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最低限度，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有助于控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接的特异性限制性位点的目的，控制序列可具有接头。

可操作地连接：术语“可操作地连接”是指一种构型，控制序列在其中被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置上，使得所述控制序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括变体的产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

表达载体：术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，其包含编码变体多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至提供其表达的附加的核苷酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”是指对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括了由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。

淀粉去除过程：表述“淀粉去除过程”是关于淀粉在其中被去除(或转化)的任何类型的过程，例如在淀粉在其中被从织物上去除的洗涤过程中，例如织物洗涤如衣物洗涤。淀粉去除过程也能够是硬质表面清洁如盘碟洗涤，或者其能够是一般性的清洁过程如工业或公共设施清洁。该表述还包括其他淀粉去除过程或淀粉转化、乙醇生产、淀粉液化、织物退浆、纸和纸浆生产、啤酒制造和一般性洗涤剂。

改善的性能：术语“改善的性能”是指与变体相关联的与亲本相比改善的特性。此类改善的性能包括但不限于热活性、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、产物特异性、在预处理的生物质的存在下提高的稳定性或溶解度、在储存条件下改善的稳定性、和化学稳定性。

洗涤性能：在本发明的上下文中，术语“洗涤性能”作为在例如衣物洗涤或硬质表面清洁如盘碟洗涤期间，酶去除存在于待清洁的物体上的淀粉或包含淀粉的污渍的能力被使用。洗涤性能可通过计算在AMSA的描述中或下文的“方法”部分中的烧杯洗涤性能测试中所定义的所谓的强度值(Int)而被定量。

改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在本文中被定义为变体酶表现出淀粉酶变体的洗涤性能相对于亲本淀粉酶的洗涤性能、或相对于具有与所述变体相同的氨基酸序列但在所规定的位置中的一个或多个处不具有缺失的α-淀粉酶、或相对于具有SEQ ID NO4中显示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性的改变，例如，通过提高污渍的去除。术语“洗涤性能”包括一般性的清洁，例如，硬质表面清洁如在盘碟洗涤中，以及在织物上的洗涤性能如衣物洗涤，以及工业和公共设施清洁。

低温：“低温”是5-35℃的温度，优选5-30℃，更优选5-25℃，更优选5-20℃，最优选5-15℃，并且具体地为5-10℃。在一个优选的实施例中，“低温”是10-35℃的温度，优选10-30℃，更优选10-25℃，最优选10-20℃，并且具体地为10-15℃。

出于本发明的目的，SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽被用于确定其他α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。其他α-淀粉酶的氨基酸序列被与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6中公开的成熟多肽比对，并且基于上述比对，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)如在EMBOSS(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16 276-277)软件包的Needle程序(优选3.0.0或更新的版本)中执行的，确定了相对于SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽中任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。

其他α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基的鉴定能够通过使用“ClustalW”(Larkin等人，2007，Bioinformatics 23:2947-2948)对多个多肽序列的比对进行确认。

当其他的酶与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、或SEQ ID NO:6的成熟多肽不一致，使得常规的基于序列的比对未能检测到它们的关联时(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.295:613-615)，能够使用其他两两序列比对算法。使用利用了多肽家族的概率表现(谱)来检索数据库的检索程序能够获得基于序列的检索中的更高灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远缘同系物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，能够实现甚至更高的敏感性。例如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics 19:874-881)的程序利用多种来源的信息(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶解能)作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.313:903-919的方法能够被用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多种为此目的开发的工具来评估这类模型的精确性。

对于已知结构的蛋白质，已经有数种用于检索和生成其结构性比对的工具和资源。例如，蛋白质的SCOP超家族已经过了结构性比对，并且可以获取和下载那些比对。可以使用多种算法来比对两种或更多种的蛋白质结构，例如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins 33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering11:739-747)，并且还可以利用这些算法的执行在结构数据库中查询所关注的结构，以发现可能的结构性同源物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics 16:566-567)。

在对本发明的α-淀粉酶的变体的描述中，使用下列命名法以便于参考。使用了公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

在这类情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号上添加小写字母，来对插入氨基酸残基编号。如此，在上述例子中，序列将是：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

亲本α-淀粉酶可以是与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在一个方面，亲本与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:1的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:3的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:3的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:4的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:5的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:6的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:7的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:7的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:8的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:8的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:9的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:10的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:10的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:11的成熟多肽的等位变体。

亲本α-淀粉酶还可以是与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80％的序列同一性的多肽。

在另一方面，亲本与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少80％，例如，至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，其具有α-淀粉酶活性。在一个方面，所述亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:12的成熟多肽相差不超过十个氨基酸，例如，相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、和相差一个氨基酸。

亲本优选地包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包含SEQ ID NO:12的成熟多肽或由其组成。

在另一个实施例中，所述亲本是SEQ ID NO:12的成熟多肽的等位变体。

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12的氨基酸序列或它们的片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的亲本的DNA。具体地讲，此类探针可用于按照标准的Southern印迹法与受关注的属或菌种的基因组或cDNA杂交以鉴定并分离其中对应的基因。此类探针能够显著地比完整序列更短，但是长度应为至少14个，例如，至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。能够使用DNA和RNA探针。探针通常进行标记以检测对应的基因(例如用

可筛选从此类其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库，以获取与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离来自此类其他生物的基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可被转移并固定在Southern印迹中使用的硝化纤维或其他适合的载体材料上。

出于本发明的目的，杂交表示该多核苷酸在从低至非常高严格度的条件下与对应于编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12的多核苷酸或它们的亚序列的带标记的核苷酸探针杂交。与所述探针杂交的分子能够使用例如X射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段进行检测。

在一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12的多肽或它们的片段的多核苷酸。

就长度为至少100个核苷酸的长探针而言，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE，0.3％SDS，200微克/mL剪切变性鲑精DNA，以及25％甲酰胺(非常低和低严格条件)或35％甲酰胺(中和中-高严格条件)或50％甲酰胺(高和非常高严格条件)中预杂交和杂交，随后进行标准Southern印迹程序12至24小时(最适)。载体材料被最终洗涤三次，每次在45℃(非常低的严格度)、50℃(低严格度)、55℃(中等严格度)、60℃(中高严格度)、65℃(高严格度)、或70℃(非常高的严格度)用2X SSC、0.2％SDS进行15分钟。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格度条件根据预杂交和杂交来限定，进行预杂交和杂交的温度比按照Bolton和McCarthy(1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)计算的T

亲本可得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文所用，与给定来源相关的术语“得自”将指由多核苷酸编码的亲本由该来源或者由来自该来源的多核苷酸已被插入至其中的细胞产生。在一个方面，亲本被分泌到细胞外。

亲本可以是细菌的α-淀粉酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶；或革兰氏阴性细菌多肽如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。

在一个方面，所述亲本为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)α-淀粉酶。

在另一个方面，所述亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽痕亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。

在另一个方面，所述亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。

所述亲本可以是真菌的α-淀粉酶。例如，所述亲本可以是酵母α-淀粉酶例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yairowia)α-淀粉酶。例如，所述亲本可以是丝状真菌α-淀粉酶例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、栗疫菌(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、巨座壳属(Magnaporthe)、Melanocarpus、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)α-淀粉酶。

在另一个方面，所述亲本是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)α-淀粉酶。

在另一个方面，所述亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium cuImorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(hpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielaviaperuviana、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢霉壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)α-淀粉酶。

在另一方面，所述亲本是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)α-淀粉酶，例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6的α-淀粉酶。

应当理解的是，对于前述的种，本发明涵盖了完全和不完全阶段，和其它分类学的等同物，例如无性型，而无论它们已知的种名如何。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份。

公众能够从许多培养物保藏机构容易地取得这些种的菌株，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)、和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service PatentCulture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

也可以使用上述的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然物质(例如，土壤、堆肥、水等)中获得的DNA样品鉴定和获得亲本。用于从天然生境分离微生物和直接分离DNA的技术是本领域内为人们所熟知的。随后可通过相似地筛选另外的微生物或混合的DNA样品的基因组或cDNA文库来得到编码亲本的多核苷酸。一旦用探针检测到编码亲本的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上)。

亲本可以是杂交体多肽，一种多肽的部分在其中被融合到另一种多肽的部分的N末端或C末端。

亲本还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，一种多肽在其中被融合到另一种多肽的N末端或C末端。通过使编码一种多肽的多核苷酸与编码另外的多肽的多核苷酸融合，产生融合的多肽。用于制备融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，和使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白也可以使用内含肽技术构建，该技术中融合是翻译后创建的(Cooper等人，1993，EMBO J.12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science 266:776-779)。

融合多肽还可包含两种多肽之间的切割位点。融合多肽被分泌时，所述位点被切割，释放了两种多肽。切割位点的例子包括但不限于下述公开的位点，Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology 13:498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology 9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry 25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology13:982-987；Carter等人，1989，Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240-248；和Stevens，2003，Drug Discovery World 4:35-48。

用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法可包括：(a)除在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12的成熟多肽的位置195、206、243的位置处的一个或多个改变之外，还任选地在对应于位置140、181、189、134、260、262、284、304、347、439、469、476和477的两个或更多个(若干个)位置处向亲本α-淀粉酶中引入改变，其中的编号是根据SEQ ID NO 1进行的，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收所述变体。

在一个方面，用于获得在本发明中有用的具有α-淀粉酶活性的变体的方法可包括：(a)除在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12的成熟多肽的位置195、206、243的位置处的一个或多个改变之外，还任选地在对应于W140、R181、W189、D134、E260、F262、W284、G304、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处向亲本α-淀粉酶中引入改变，其中的编号是根据SEQ ID NO1进行的，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收所述变体。

在一个实施例中，所引入的改变是替换。

在另一个实施例中，用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法可包括：(a)在对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12的成熟多肽的G304RKEQ、W140YF、W189EGT、D134E、E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY、F262GP、W284DHFYR、W347HFY、W439RG、G476EQRK、G477EQKMR的两个或更多个(若干个)位置处向亲本α-淀粉酶中引入替换，其中的编号是根据SEQ ID NO 1进行的，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收所述变体。

在一个优选的实施例中，所引入的替换是G304R、W140YF、W189EGT、D134E、E260GHIKNRTY、W284DFR、W439RG、G476EK、G477EKMR中的两个或更多个。在一个更优选的实施例中，所引入的替换是G304R、W140YF、E260GHIKNPRTY和G476EQRK。在一个甚至更优选的实施例中，用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法包括：(a)向亲本α-淀粉酶中引入任何SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12中的G304R、W140Y、E260G和G476K替换，其中的编号是根据SEQ ID NO 1进行的，并且所述变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收所述变体。

变体可以使用本领域中已知的任何诱变方法来制备，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等等。

定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点制造一个或多个(若干个)突变的技术。

定点诱变能在体外通过PCR完成，所述PCR涉及包含期望诱变的寡核苷酸引物的使用。定点诱变也能在体外通过盒诱变进行，所述盒诱变涉及限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的一个位点上裂解以及随后连接在多核苷酸中包含突变的寡核苷酸。通常消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，使得质粒的粘性末端和插入序列彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

定点诱变也可通过本领域已知的方法在体内完成。参见，例如，美国专利申请公布2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

本发明能够使用任何定点诱变程序。有许多可利用的商品化试剂盒能够用于制备变体。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码受关注的多肽。基因合成能够利用许多技术进行，例如Tian等人(2004，Nature 432:1050-1054)描述的基于多元微芯片的技术，以及在其中寡核苷酸基于可光编程的微流体芯片被合成和组装的类似的技术。

能使用已知的诱变、重组、和/或改组方法制造并测试单个或多个氨基酸替换、去除、和/或插入，随后进行有关的筛选程序，例如那些由以下文献公开的程序：Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。能够使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利5,223,409；WO 92/06204)和区域定点诱变(Derbyshire等人，1986，Gene 46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以和高通量的、自动的筛选方法联合，以检测宿主细胞表达的克隆的、诱变处理的多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许多肽中单个氨基酸残基重要性的快速确定。

半合成基因构建通过组合使用合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组来完成。半合成构建的典型是利用合成的多核苷酸片段的方法与PCR技术的组合。因此可从头合成限定的基因区域，然而其他区域可使用位点特异性诱变引物进行扩增，而其他区域可经过易错PCR或非易错PCR进行扩增。然后多核苷酸亚序列可以被改组。

在本发明中有用的亲本α淀粉酶的变体包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地为替换、插入或缺失(优选为替换)并且所述变体具有α-淀粉酶活性。如此，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的α-淀粉酶相比，具有改善的在低温下的洗涤性能的变体。

在一个实施例中，所述变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。

在本发明中有用的变体是分离的α淀粉酶的变体，其包含在对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处的改变，其中每一改变独立地是替换、缺失或插入，并且其中所述变体与任何SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的成熟多肽具有至少80％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α淀粉酶活性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:9的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述变体与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。

在一个方面，本发明的变体中的改变的数量是1-20，例如，1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

在一个方面，变体在对应于位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个或更多个(若干个)位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于任何位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的两个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于任何位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的三个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于任何位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的四个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于任何位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的五个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于任何位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的六个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于位置G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、和G477的每一位置处包含改变。上述位置对应于SEQ IDNO:1的位置。所述改变优选是替换。

在一个实施例中，所述变体在选自G304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476和G477的两个、三个或四个位置处包含替换，任选地还在选自对应于位置N195、V206和Y243的一个、两个或三个位置处包含替换。

在一个优选的实施例中，所述变体包含在选自G304、W140、E260和G476的两个、三个或四个位置处的替换。

在本发明的一个方面，所述变体包含选自G304RKEQ、W140YF、W189EGT、D134E、E260ADCQLMFPSWVGHIKNRTY、F262GP、W284DHFYR、W347HFY、W439RG、G476EQRK、G477EQKMR的两个或更多个(若干个)替换。

优选地，根据本发明的变体包含选自G304R、W140YF、E260GHIKNPRTY和G476EQRK的两个、三个或四个位置处的替换。在一个更优选的实施例中，所述两个、三个或四个位置处的替换选自G304R、W140Y、E260G和G476K。

在一个实施例中，所述变体还包含选自T51IL、S52Q、N54K、G109A、E194D、N195F、V206Y、Y243F、G109A、G273DV、G337N、K72R、R181H、S303G和Y100I的一个或多个替换。在一个优选的实施例中，所述一个或多个还包含的替换选自N195F、V206Y、Y243F。优选地，所述变体包含这些替换中的两个或三个。如此，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的α-淀粉酶相比，具有改善的在低温下的洗涤性能以及改善的对Ca

在另一个方面，在本发明中有用的变体包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:12的成熟多肽的两个或更多个(若干个)替换，所述替换选自D134E、E260G、E260H、E260I、E260K、E260N、E260R、E260T、G109A、G273D、G273V、G337N、G476E、G477E、G477M、G477R、K72R、R181H、S303G、W140F、W140Y、W189E、W189G、W189T、W284D、和Y100I。

所述变体还可包含在一个或多个(若干个)其他位置处的改变。例如，所述变体可包含在对应于位置N195F+V206Y+Y243F和/或G182*+D183*或D183*+G184*的位置处的改变。

在另一个方面，本发明涉及在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置的选自下列的位置处包含替换的变体：

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D134E+G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G

T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R、和

N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。

在另一个方面，本发明涉及由对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置的选自下列的位置处的替换组成的变体：

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D134E+G476E,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G

G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G

T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K

W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R、和

N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。

在又一方面，适合的变体在对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置的选自下列的位置处包含改变：

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D183*+G184*+D134E+G476E,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G

D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

D183*+G184*+T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G

D183*+G184*+T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

D183*+G184*+T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R、和

D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。

在另一方面，适合的变体由对应于SEQ ID NO:1的多肽的位置的选自下列的位置处的改变组成：

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G477E,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260T+W284D,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+W284D,

D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260K+W284D,

D183*+G184*+D134E+G476E,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E,

D183*+G184*+W140Y+W189G+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+S303G,

D183*+G184*+W140Y+W189T+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D,

D183*+G184*+Y100I+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G337N,

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

D183*+G184*+G109A+W140Y+E194D+N195F+V206Y+Y243F+E260G

D183*+G184*+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

D183*+G184*+T51I+Y100I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G

D183*+G184*+T51I+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W439R

D183*+G184*+T51I+S52Q+N54K+G109A+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G476E

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+G304R+G476K

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284R+G477K

D183*+G184*+W140Y+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284F+G477R、和

D183*+G184*+N195F+V206Y+Y243F+E260G+W284D。

亲本中的必需氨基酸可根据本领域已知的方法进行鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244:1081-1085)。在后一种技术中，单个丙氨酸突变被引入分子中的每一残基，并且针对α-淀粉酶活性测试所得到的突变型分子，以鉴定对该分子的活性至关重要的氨基酸残基。亦参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。α-淀粉酶的活性位点或其他生物学相互作用也能通过结构的物理分析进行测定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记技术，连同推定接触位点氨基酸突变技术一起所测定的。参见，例如，de Vos等人，1992，Science 255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份还能够从与所述亲本相关的多肽的身份的分析中推断。

本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。所述组合物优选地富集此类变体。术语“富集的”指示所述组合物的α-淀粉酶活性已经被提高了，例如具有1.1的浓缩因子。

所述组合物可包含变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。作为另外一种选择，所述组合物可包含多种酶活性，例如氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳醣苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。可生产附加的酶，例如通过属于以下属的微生物：曲霉属(Aspergillus)，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)；镰孢霉属(Fusarium)，例如杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium cuImorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、或镶片镰孢(Fusarium venenatum)；腐质霉属(Humicola)，例如特异腐质霉(Humicola insolens)或疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)；或木霉属(Trichoderma)，例如哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)。

所述组合物可根据本领域已知的方法制备，并且可为液体形式或干燥组合物形式。例如，所述组合物可以是粒状或微粒状形式。所述变体可以根据本领域中已知的方法被稳定化。

本发明优选涉及用于毛发护理、汽车护理、盘碟洗涤、织物调理(包括软化)、衣物洗涤剂、衣物洗涤和漂洗添加剂和/或护理、硬质表面清洁和/或处理、以及其他用于消费者或机构清洁使用的产品和/或涉及和/或使用受权利要求书保护的组合物的方法。根据本发明，上述α-淀粉酶的变体通常可为清洁组合物(如固体、液体、凝胶和/或单位剂量的洗涤剂组合物)的组分，例如衣物洗涤剂组合物或盘碟洗涤剂组合物。尤其优选的是液体衣物洗涤剂组合物。

此类清洁组合物包含清洁/洗涤剂助剂，优选为组分的混合物。通常所述清洁助剂在所述组合物中以0.001至99.9重量％，更典型地0.01至80重量％的清洁助剂的量存在。合适的清洁助剂包括：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白催化剂、着色剂、漂白增强剂、螯合剂、染料转移剂、沉积助剂、分散剂、附加酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、光学增白剂、光活化剂、荧光剂、织物调色剂、织物调理剂、预成形过酸、聚合分散剂、粘土污垢移除/抗再沉积剂、填料盐、水溶助长剂、增白剂、抑泡剂、结构增弹剂、织物软化剂、水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、防缩水剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗晦暗剂、抗腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、染料、香料和pH控制剂、胶囊、聚合物。例如，这些可包括：漂白组分如亚胺漂白增强剂；过氧化氢源如过碳酸盐和/或过硼酸盐，尤其是用材料如碳酸盐和/或硫酸盐、硅酸盐、硼硅酸盐和它们的任何混合物涂覆过的过碳酸盐；预成形过酸，包括胶囊形式的预成形过酸；过渡金属催化剂；抑泡剂或抑泡系统如基于硅氧烷的抑泡剂和/或基于脂肪酸的抑泡剂；织物软化剂如粘土、硅氧烷和/或季铵化合物；絮凝剂如聚环氧乙烷；染料转移抑制剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚4-乙烯基吡啶N-氧化物和/或乙烯基吡咯烷酮和乙烯基咪唑的共聚物；织物完整组分如由咪唑和表氯醇缩合的低聚产物；污垢分散剂和污垢抗再沉积助剂如烷氧基化的聚胺和乙氧基化的乙烯亚胺聚合物；抗再沉积组分如聚酯；羧酸酯聚合物如马来酸聚合物或马来酸和丙烯酸共聚物；香料如香料微胶囊、淀粉胶囊包封物、香料喷雾；皂环；美学颗粒；染料；填料如硫酸钠，但是优选的是所述组合物基本上不含填料；硅酸盐如硅酸钠，包括1.6R和2.0R硅酸钠、或偏硅酸钠；二羧酸和二醇的共聚酯；纤维素聚合物，如甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟乙氧基纤维素，或其他的烷基或烷基烷氧基纤维素；溶剂，如1,2-丙二醇，单乙醇胺；二甘醇、乙醇、以及它们的任何混合物；水溶助长剂如异丙苯磺酸钠、二甲苯磺酸钠、甲苯磺酸钠、以及任何混合物；有机酸如柠檬酸；以及它们的任何组合。

在另一个优选的方面所述组合物包含一种或多种表面活性剂，其可为非离子的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子和/或两性和/或半极性非离子和/或它们的混合物。所述表面活性剂通常含量为按重量计占所述组合物的0.1％至60％或0.5至50重量％或1至40重量％。

当包含于其中时，所述清洁组合物将通常包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸盐、α烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、脂肪醇乙氧基硫酸酯、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基丁二酸或皂。

当包含于其中时，所述清洁剂通常将包含约0.2％至约40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物、乙氧基化壬基苯酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述清洁组合物可包含一种或多种其他酶如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶如另一种α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽淀粉酶、CGT酶和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(例如MANNAWAY

所选择酶的特性通常将与所选择的洗涤剂相容，(即最适pH，与其他酶或非酶成分相容等)，并且所述酶将以有效量存在。

蛋白酶：适宜的蛋白酶包括金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶，包括中性或碱性微生物丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)。适用的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些蛋白酶。在一个方面，此类适宜的蛋白酶可源自微生物。适宜的蛋白酶包括化学上或基因上改性的上述适宜蛋白酶的突变体。在一个方面，适宜的蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶和/或胰蛋白酶型蛋白酶。适宜中性或碱性蛋白酶的例子包括：

(a)枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)，包括来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，如US6,312,936B1、US 5,679,630、US 4,760,025、US 7,262,042和WO09/021867中所述的迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)的那些。

(b)胰蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型蛋白酶，例如胰蛋白酶(例如源自猪或牛)，包括WO 89/06270中所述的镰孢霉属(Fusarium)蛋白酶，以及WO 05/052161和WO 05/052146中所述的来源于纤维单胞菌属(cellulomonas)的胰凝乳蛋白酶。

(c)金属蛋白酶，包括WO 07/044993A2中所述的来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的那些。

优选的蛋白酶包括来源于吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)或迟缓芽孢杆菌(Bacillus Lentus)的那些。

适宜的可商购获得的蛋白酶包括以商品名

脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌源或真菌源的那些。包括化学改性的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶例子包括来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热丝孢菌属(Thermomyces))的脂肪酶，例如EP 258 068和EP 305 216中所述的来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))的脂肪酶，或如WO 96/13580中所述的来自特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO 95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)的假单胞菌属脂肪酶；芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小茅孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的芽孢杆菌属脂肪酶。

所述脂肪酶可为“第一循环脂肪酶”，如美国专利公开6,939,702 B1和美国专利申请2009/0217464中所述。在一个方面，所述脂肪酶为第一洗涤脂肪酶，优选包含T231R和N233R突变的疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的野生型脂肪酶变体。野生型序列是Swissprot登录号Swiss-Prot O59952(来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)))的269个(氨基酸23–291)。优选的脂肪酶将包括以商品名

纤维素酶：适用的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学改性的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉菌属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757、WO09/148983、US 7,141,403B2和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉(Humicolainsolens)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。

在一个方面，优选的酶包括源自微生物的内葡聚糖酶，其表现出内-β-1,4-葡聚糖酶活性(E.C.3.2.1.4)，优选地选自：

(a)芽孢杆菌属(Bacillus)成员内源性的细菌多肽，其具有与US 7,141,403B2中氨基酸序列SEQ ID NO:2有至少90％、94％、97％和甚至99％的同一性的序列；

(b)对木葡聚糖和无定形纤维素底物都具有酶活性的糖基水解酶，其中所述糖基水解酶选自GH家族5、12、44或74；

(c)具有与WO09/148983中氨基酸序列SEQ ID NO:3有至少90％、94％、97％和甚至99％的同一性的序列的糖基水解酶；

(d)以及它们的混合物。

适宜的内切葡聚糖酶以商品名

其他可商购获得的纤维素酶包括

过氧化物酶/氧化酶：适用的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌起源的酶。包括化学改性的或蛋白工程化的突变体。可用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体，如WO93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中所述的那些。

可商购获得的过氧化物酶包括

其它酶：其它优选的酶包括以商品名

可通过加入包含一种或多种酶的单个添加剂或通过加入包含所有这些酶的混合添加剂将洗涤剂酶加入洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂，即，单个添加剂或混合添加剂，配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂制剂是颗粒，具体地讲无粉尘颗粒，液体，具体地讲稳定液体，或混悬液。

可如例如US 4,106,991和4,661,452所公开的那样制备无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡质涂层材料的例子为聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其具有1000至20000平均摩尔量；乙氧基化的壬基酚具有16个至50个环氧乙烷单元；乙氧基化的脂肪醇，其中所述醇包含12个至20个碳原子并且其中有15个至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸、和脂肪酸甘油一酯和甘油二酯和甘油三酯。在GB 1483591中给出了适用于流化床技术应用的成膜涂层材料的例子。例如液体酶制备可根据已建立的方法，通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定。可根据EP 238,216中公开的方法制备保护的酶。

所述组合物可包含织物调色剂(有时被称为上色剂、上蓝剂或增白剂)。调色剂通常为织物提供蓝色或紫色色调。调色剂能够被单独地或组合地使用，以产生特定的调色色调和/或对不同的织物类型上色。这可通过例如将红色和蓝绿色染料混合以产生蓝色或紫色色调来提供。调色剂可以选自任何已知的化学类染料，包括但不限于吖啶，蒽醌类(包括多环醌类化合物)，吖嗪，偶氮(例如，单偶氮，双偶氮，三偶氮，四偶氮，多偶氮)，包括预金属化的偶氮，苯并二呋喃(benzodifurane)及苯并二呋喃酮，类胡萝卜素，香豆素，花菁，二氮杂半花菁，二苯基甲烷，甲瓒，半花菁，靛蓝，甲烷，萘酰亚胺，萘醌，硝基及亚硝基，恶嗪，酞菁，吡唑类，二苯乙烯，苯乙烯基，三芳基甲烷，三苯基甲烷，氧杂蒽以及它们的混合物。

适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物、以及有机和无机颜料。适宜的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自落入染料索引(CI)直接的、基本的、反应的或水解反应的、溶剂或分散染料分类的染料的小分子染料，例如被分类为蓝、紫、红、绿或黑的，并且单独地或组合地提供了所需的色调。在另一方面，合适的小分子染料包括选自染料索引(Society of Dyers and Colourists，Bradford，UK)的下列编号的小分子染料：直接紫染料如9、35、48、51、66、和99，直接蓝染料如1、71、80和279，酸性红染料如17、73、52、88和150，酸性紫染料如15、17、24、43、49和50，酸性蓝染料如15、17、25、29、40、45、75、80、83、90和113，酸性黑染料如1，碱性紫染料如1、3、4、10和35，碱性蓝染料如3、16、22、47、66、75和159，分散或溶剂染料如EP1794275或EP1794276中所描述的那些，或如US 7,208,459B2中所公开的染料，以及它们的混合物。在另一方面，合适的小分子染料包括选自染料索引的下列编号的小分子染料：酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或它们的混合物。

合适的聚合物染料包括选自含有共价结合的(有时也称为共轭)色原体(染料-聚合物共轭物)的聚合物的聚合物染料，例如具有共聚合到聚合物主链的色原体的聚合物，以及它们的混合物。聚合物染料包括WO2011/98355、WO2011/47987、US2012/090102、WO2010/145887、WO2006/055787和WO2010/142503中所描述的那些。

在另一方面，合适的聚合物染料包括选自下列的聚合物染料：以商品名

优选的调色染料包括见于WO 08/87497A1、WO2011/011799和WO2012/054835中的增白剂。用于本发明中的优选的调色剂可以是这些参考文献中所公开的优选的染料，包括选自WO2011/011799的表5中的实例1-42的那些。其他优选的染料公开于US 8138222中。

适宜的染料粘土共轭物包括选自下列的染料粘土共轭物：包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土粘土、以及它们的混合物。在另一方面，合适的染料粘土共轭物包括选自由下列组成的组的粘土共轭物：一种阳离子/碱性染料，其选自由C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性褐1至23、CI碱性黑1至11组成的组，以及一种粘土，其选自由蒙脱石粘土、锂蒙脱石粘土、滑石粉粘土、以及它们的混合物组成的组。在另一方面，合适的染料粘土共轭物包括选自由下列组成的组的染料粘土共轭物：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，蒙脱石碱性绿G1C.I.42040共轭物，蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫V3C.I.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，皂石碱性蓝B9C.I.52015共轭物，皂石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，皂石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，皂石碱性红R1 C.I.45160共轭物，皂石C.I.碱性黑2共轭物，以及它们的混合物。

适宜的颜料包括选自下列的颜料：黄烷士酮、蓝蒽酮、包含1个至4个氯原子的氯化蓝蒽酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺酯，其中所述酰亚胺基团可为未替换的或被C1至C3的烷基或苯基或杂环基替换，并且其中苯基和杂环基可另外带有不提供水中溶解度的替换基、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二嗪颜料、每个分子可包含最多2个氯原子的铜酞菁、多氯铜酞菁或每个分子包含最多14个溴原子的多溴铜酞菁、以及它们的混合物。

在另一方面，合适的颜料包括选自下列的颜料：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)以及它们的混合物。助洗剂-所述清洁组合物还可包含助洗剂，如基于碳酸盐、碳酸氢盐或硅酸盐的助洗剂，其可以是沸石，如沸石A，沸石MAP(最高铝类型P)。在衣物洗涤中可用的沸石优选具有下式：Na

包封物-所述组合物可包含包封物。在一个方面，包封物包含芯，具有内表面和外表面的外壳，所述外壳包封所述芯。

在所述包封物的一个方面，所述芯可包含选自由下列组成的组的材料，香料；增白剂；染料；驱虫剂；硅氧烷；蜡；风味剂；维生素；织物软化剂；皮肤护理剂，在一个方面，石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感觉物质(sensate)、以及它们的混合物；并且所述外壳可包含选自由下列组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面所述氨基塑料可包含聚脲、聚氨酯、和/或聚脲氨酯，在一个方面所述聚脲可包括聚甲醛脲和/或三聚氰胺甲醛树脂；聚烯烃；多糖，在一个方面所述多糖可包括藻酸盐和/或脱乙酰壳多糖；明胶；紫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物；水不溶性无机物；硅氧烷；以及它们的混合物。

在所述包封物的一个方面，所述芯可包含香料。此类包封物是香料微胶囊。

在所述包封物的一个方面，所述外壳可包含三聚氰胺甲醛树脂和/或交联的三聚氰胺甲醛树脂。

在一个方面，公开了可包含芯材料和外壳的适合的包封物，所述外壳至少部分地围绕所述芯材料。至少75％，85％或甚至90％的所述包封物具有约0.2MPa至约10MPa，约0.4MPa至约5MPa，约0.6MPa至约3.5MPa，或甚至约0.7MPa至约3MPa的破裂强度；以及0％至约30％，0％至约20％，或甚至0％至约5％的有益剂渗漏度。

在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约1微米至约80微米，约5微米至60微米，约10微米至约50微米，或甚至约15微米至约40微米的粒度。

在一个方面，至少75％、85％或甚至90％的所述包封物可具有约30nm至约250nm，约80nm至约180nm，或甚至约100nm至约160nm的颗粒壁厚。

在一个方面中，所述包封物的芯材料可包含物质，所述物质选自：香料原料和/或任选的物质，所述任选的物质选自：植物油(包括纯植物油和/或混合的植物油)，包括蓖麻子油、椰油、棉籽油、葡萄油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油，以及它们的混合物；植物油酯、酯，包括己二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸苄基丁基酯、已二酸辛基苄基酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯，以及它们的混合物；直链或支链烃，包括那些沸点大于约80℃的直链或支链烃；部分氢化的三联苯、邻苯二甲酸二烷基酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化萘(包括二丙基萘)、石油溶剂油(包括煤油、矿物油)，以及它们的混合物；芳族溶剂，包括苯、甲苯，以及它们的混合物；硅油；以及它们的混合物。

在一个方面，所述包封物的壁材料可包含适合的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适宜的胺包括三聚氰胺、脲、苯胍胺、甘脲，以及它们的混合物。适宜的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺，以及它们的混合物。适宜的脲包括二羟甲基脲、甲基化二羟甲基脲、脲-间苯二酚，以及它们的混合物。

在一个方面，适合的甲醛清除剂可与所述包封物使用，例如，加入胶囊悬浮液中和/或在所述包封物被加入到消费品中之前、期间或之后加入此类消费品中。

适合的胶囊能够按照USPA 2008/0305982 A1和/或USPA2009/0247449 A1的教导制得。作为另外一种选择，适合的胶囊可购自Appleton，Wisconsin USA的Appleton PapersInc.。

此外，用于制备前述包封物的材料可得自Solutia Inc.(St Louis，MissouriU.S.A.)、Cytec Industries(West Paterson，New Jersey U.S.A.)、sigma-Aldrich(St.Louis，Missouri U.S.A.)、CP Kelco Corp.(San Diego，California，USA)；BASF AG(Ludwigshafen，Germany)；Rhodia Corp.(Cranbury，New Jersey，USA)；Hercules Corp.(Wilmington，Delaware，USA)；Agrium Inc.(Calgary，Alberta，Canada)，ISP(New JerseyU.S.A.)，Akzo Nobel(Chicago，IL，USA)；Stroever Shellac Bremen(Bremen，Germany)；Dow Chemical Company(Midland，MI，USA)；Bayer AG(Leverkusen，Germany)；Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，Missouri，USA)。

在一个方面，所述组合物可包含酶稳定剂，所述酶稳定剂选自：(a)无机盐，所述无机盐选自：钙盐、镁盐、以及它们的混合物；(b)碳水化合物，所述碳水化合物选自：低聚糖、多糖、以及它们的混合物；(c)高效可逆蛋白酶抑制剂，所述高效可逆蛋白酶抑制剂选自：苯基硼酸及其衍生物；以及(d)它们的混合物。

在另一个实施例中，所述组合物包括：(1)可逆蛋白酶抑制剂如包含硼的化合物；(2)1-2丙二醇；(3)甲酸钙和/或甲酸钠；以及(4)它们的任何组合。

在一个方面，所述组合物可包含结构剂，所述结构剂选自：甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、以及它们的混合物。

消费品可包含一种或多种聚合物。例子为羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物以及两亲性聚合物。

优选地，所述两亲性清洁聚合物是具有下列通式结构的化合物：二((C

本发明的两亲性烷氧基化的油脂清洁聚合物是指任何具有平衡的亲水性和疏水性的烷氧基化的聚合物，这使得它们从织物和表面移除油脂颗粒。本发明两亲性烷氧基化的油脂清洁聚合物具体的实施例包括芯结构和多个连接到那个芯结构的烷氧基化物基团。这些可包括烷氧基化的聚亚烷基亚胺，优选地具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。

所述芯结构可包括聚亚烷基亚胺结构，其以密集的形式包含式(I)、(II)、(III)和(IV)的重复单元：

其中#在每种情况下，表示介于式(I)、(II)、(III)或(IV)的两个邻近重复单元的氮原子和基团A

所述芯结构可或者包含聚链烷醇胺结构，所述聚链烷醇胺结构为至少一种选自式(I.a)和/或(I.b)N-(羟烷基)胺的化合物的缩合产物，

其中A独立地选自C

连接到所述芯结构多个亚烷氧基基团独立地选自式(V)的亚烷氧基单元

其中*在每种情况下，表示键合到式(I)、(II)或(IV)的重复单元的氮原子上的半个键；在每种情况下，A

两亲性烷氧基化的油脂清洁聚合物具体的实施例可选自具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段的烷氧基化的聚亚烷基亚胺，乙氧基化度和丙氧基化度不会超过或低于具体的限定值。根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺的具体实施例具有约0.6的最小聚乙烯嵌段对聚丙烯嵌段的比率(n/p)和约1.5(x+2y+1)

根据本发明的烷氧基化聚亚烷基亚胺具有一条主链，所述主链由伯胺、仲胺和叔胺氮原子组成，其通过亚烷基A互相连接并且是无规排列的。伯氨基部分，其是聚亚烷基亚胺主链的主要链和侧链的起始点或终结点并且其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元替换，其分别被称为式(I)或(IV)的重复单元。仲氨基部分，其剩余的氢原子随后被亚烷氧基单元替换，其被称为式(II)的重复单元。叔氨基部分，其使主要链和侧链分叉，其被称为式(III)的重复单元。

由于在聚亚烷基亚胺主链的形成中会发生环化，在主链中还可能存在少量的环状氨基部分。当然，包含环状氨基部分的此类聚亚烷基亚胺以与由非环状伯氨基和仲氨基部分组成的那些相同的方式烷氧基化。

由氮原子和基团A

(x+2y+1)的和对应于存在于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中的亚烷基亚胺单元的总数，并因此直接与所述聚亚烷基亚胺主链的分子量相关。然而，在本说明书中给出的值涉及所述混合物中存在的所有聚亚烷基亚胺的平均数。(x+2y+2)的和对应于存在于一条单独的聚亚烷基亚胺主链中的氨基的总数。

连接氨基氮原子的基团A

聚亚烷基亚胺主链中伯胺基和仲胺基的氢原子可被式(V)的亚烷氧基单元替换。

在该式中，所述变量优选具有以下所给出的一种含义：

在每种情况下，A

式(V)的亚烷氧基单元优选是非随机序列的烷氧基化物嵌段。通过非随机序列是指首先添加[-A

这些式(V)的亚烷氧基单元的基本部分由亚乙氧基单元-[CH

如果需要的话，所述聚亚烷基亚胺主链的这种初始改性可使烷氧基化过程中反应混合物的粘度降低。然而，所述改性通常不会影响烷氧基化聚亚烷基亚胺的性能特性，因此不构成优选的标准。

基于织物和家居护理产品的重量计，两亲性的烷氧基化的油脂清洁聚合物以约0.05％至10％范围的水平存在于本发明的织物和家居护理产品中，所述产品包括但不限于洗涤剂。织物和家居护理产品的实施例可包含按重量计约0.1％至约5％。更具体地讲，所述实施例可包含约0.25至约2.5％的油脂清洁聚合物。

羧酸盐聚合物-本发明的消费品也可包括一种或多种羧酸酯聚合物，如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一个方面，所述羧酸酯聚合物为聚丙烯酸酯均聚物，其分子量为4,000Da至9,000Da，或6,000Da至9,000Da。

去污性聚合物-本发明的消费品也可包括一种或多种去污性聚合物，其具有由下列结构(I)，(II)or(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR

(II)-[(OCHR

(III)-[(OCHR

其中：

a、b和c为1至200；

d、e和f为1至50；

Ar为1,4-替换的亚苯基；

sAr为在5位用SO

Me为Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、一烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或

四烷基铵，其中烷基为C

R

R

至9个碳原子的环烷基，或C

适宜的去污性聚合物为聚酯去污性聚合物如Repel-o-tex聚合物，包括由Rhodia提供的Repel-o-tex SF，SF-2和SRP6。其他适宜的去污性聚合物包括Texcare聚合物，包括由Clariant提供的Texcare SRA100，SRA300，SRN100，SRN170，SRN240，SRN300和SRN325。其他适宜的去污性聚合物为Marloquest聚合物，如Sasol提供的Marloquest SL。

纤维素聚合物-本发明的消费品也包含一种或多种纤维素聚合物，其包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一个方面，所述纤维素聚合物选自包含羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及它们的混合物的组。在一个方面，所述羧甲基纤维素的羧甲基替换度为0.5至0.9并且分子量为100,000Da至300,000Da。

所述洗涤剂可包含漂白体系，其可包含H

螯合剂-本文的消费品可包含螯合剂。合适的螯合剂包括铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。当使用螯合剂时，所述主题消费品可包含按所述主题消费品重量计约0.005％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。适合的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五醋酸)、HEDP(羟基乙烷二磷酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、1,2-乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚胺二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的混合物。

本发明的酶的变体可使用常规稳定剂和/或蛋白酶抑制剂进行稳定，如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、盐如氯化钠和氯化钾、乳酸、甲酸、硼酸、或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸、或肽醛如二-、三-或四肽醛或醛类似物(任一形式的B1-B0-R，其中R为H、CH3、CX3、CHX2、或CH2X(X＝卤素)、B0是单个氨基酸残基(优选具有任选替换的脂族或芳族侧链)；并且B1由一个或多个氨基酸残基组成(优选一个、两个或三个)，任选地包含N-末端保护基团，或如WO09118375、WO98/13459所述)或蛋白类型的蛋白酶抑制剂如RASI、BASI、WASI(稻、大麦和小麦的双官能的α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或CI2或SSI。所述组合物可如例如WO 92/19709和WO 92/19708或US6472364所述进行配制。在一些实施例中，本文使用的酶通过在提供此类离子给所述酶的成品组合物中存在的水溶性来源锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))进行稳定。

所述组合物可也可包含其他常规洗涤剂成分如织物调理剂，包括粘土、泡沫增强剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬垢剂、抗垢再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、有机溶剂如乙醇或香料。此外，所述洗涤剂可包含预污点清除剂或增强剂，将它们加入洗涤过程以提高总清洁水平，一些这些添加剂也可用作在洗涤步骤之前施用于织物的预处理剂。

当前预期在洗涤剂组合物中可加入任何酶，具体地讲本发明的酶，其加入的量对应于每升洗涤液体0.001-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液体0.005-5mg酶蛋白，更优选每升洗涤液体0.01-1mg酶蛋白，以及具体地讲每升洗涤液体0.1-1mg酶蛋白。然而，本发明的组合物包含至少0.0001至约0.1重量％的纯酶蛋白，例如约0.0001％至约0.01％，约0.001％至约0.01％或约0.001％至约0.01％的纯酶蛋白。然而，当使用配制的酶时，所述洗涤剂组合物包含约0.02％至约20重量％的酶，例如或约0.05％至约15重量％，或约0.05至约20％，或约0.05％至约5％，或约0.05％至约3％的酶。

可将用于本发明的α-淀粉酶的变体附加地加入公开于WO 97/07202中的洗涤剂制剂中，所述文献并入本文以供参考。

本发明的洗涤剂组合物可为任何常规形式，例如棒、片剂、粉末、颗粒、糊剂、凝胶或液体。所述组合物可为粉末形式的多功能“重垢型”洗涤剂、糊剂形式的多功能重垢型液体型、精细织物液体、手洗餐具洗涤剂、轻垢型餐具洗涤剂、高泡型机洗餐具洗涤剂、多种片剂、盘碟洗涤颗粒、盘碟洗涤液、漂洗助剂型。组合物也可为单位剂量的包装，包括本领域已知的那些包装和水溶性的、水不溶性的和/或水可渗透的那些包装。液体洗涤剂可为含水的，通常包含至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或为不含水的或包含大于0.5g/L洗涤剂组合物的溶液。

可例如将本发明的组合物配成手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，其包括适用于预处理脏污织物的衣物洗涤添加剂组合物和漂洗附加织物的软化剂组合物，或可将其配成一般用于家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或其被配制为用于手洗或机洗盘碟洗涤操作。所述洗涤剂可为粉末或颗粒形式，或它可为液体、凝胶或糊剂形式，或为单位剂量产品如片剂或小袋形式，包括多隔室小袋，或所述洗涤剂可为片材形式。

可通过使用G7-pNP底物的方法测定α-淀粉酶活性。G7-pNP是4,6-亚乙基(G

来自这个试剂盒的G7-pNP底物包含22mM的4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH7.0)。

α-葡糖苷酶试剂包含52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl

底物工作溶液通过混合1mL的α-葡糖苷酶试剂与0.2mL的G7-PNP底物制成。这种底物工作溶液在使用前现配现用。

稀释缓冲液：50mM MOPS、0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C

待分析的淀粉酶样品被稀释在稀释缓冲液中，以确保被稀释的样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板并添加80μl的底物工作溶液进行了测定。混合所述溶液并在室温下预孵育1分钟，并且在5分钟内每隔20秒测量OD 405nm的吸光度。

时间依赖性吸光度曲线的比降(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(每mg酶活性)在给定设置条件下直接成比例。淀粉酶样品将被稀释至其中比降低于每分钟0.4个吸光度单位的水平。

为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动化机械应力测定(AMSA)进行了实验。使用AMSA测试，能够检测大量小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的狭槽，并且还具有一个紧压衣物洗涤样品的封盖，待洗涤的织物对着所有的狭槽开口。在洗涤期间，剧烈振荡板、测试溶液、纺织物和封盖以使测试溶液接触织物并以规律的定期振荡方式施加机械应力。进一步的描述参见WO02/42740，尤其是第23-24页的段落“Special method embodiments(具体方法实施例)”。

制备了测试溶液，其包含水(10°dH)、洗涤剂例如如下文所述的5.1g/L欧洲液体洗涤剂、以及本发明的酶例如浓度为0、0.8和/或1.2mg酶蛋白/L的酶。加入用淀粉沾污的织物(例如CS-28，得自Center For Testmaterials BV，P.O.Box 120，3133KT，Vlaardingen，TheNetherlands)并在20℃洗涤20分钟。在流动自来水下充分冲洗并在暗处干燥后，随后测量沾污织物的光照强度或反射率值，将其作为洗涤性能的量度。用0mg酶蛋白/L进行的测试用作空白对照以获得Δ衰减值。优选在洗涤步骤中施加机械作用，例如以振荡、旋转或搅拌洗涤溶液和织物的形式。

AMSA洗涤性能实验在下文指定的实验条件下进行：

淀粉酶稀释缓冲液：淀粉酶被稀释在超纯水(MilliQ水)中，其中含有低浓度的钙(0.1mM)以使淀粉酶在储存期间稳定化，以及0.01％Triton X-100以减少容器和移液器吸附酶蛋白的风险。

通过添加CaCl

根据经洗涤的织物颜色的亮度测量了洗涤性能。也能将亮度表示成当用白光照亮时样本反射的光的强度。当样本有污渍时，反射光的强度低于清洁样本的反射光强度。因此可使用反射光的强度测量洗涤性能。

使用专业的平面扫描仪(Kodak iQsmart，Kodak，Midtager 29，DK-2605

为了从扫描图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化成红色、绿色和蓝色(RGB)值。通过将RGB值加到一起作为向量计算强度值(Int)，然后获得所得向量的长度：

不同变体的AMSA衣物洗涤测试的结果显示在表3中。在上述结果中的指数是100。亲本α-淀粉酶的性能结果被指定为100的值，而将变体的结果与该值进行比较。

通过如“方法”部分所描述的AMSA测试方法测试了变体和对应的亲本α-淀粉酶的洗涤性能。按照(变体的性能减空白的性能)除以(亲本的性能减空白的性能)乘以100给出了结果，其中所述空白是通过在相同条件但不存在α-淀粉酶情况下的洗涤而获得的性能。最终，计算了在0.8–1.2Mg/L两个浓度的相对性能的平均值。

结果显示在表3中。

Tergo-To-Meter(TOM)是能够被用于同时测试12种不同的洗涤条件的中等规模型号的洗涤系统。TOM基本上就是具有多至12个浸入其中的开放的金属烧杯的大型温控水浴。每一烧杯构成了一个小的顶部加载式洗衣机，并且在实验过程中，它们中的每一个将含有特定洗涤剂/酶体系的溶液以及带污渍和不带污渍的织物，所述洗涤剂/酶体系的性能在所述织物上被测试。通过旋转在每一烧杯内搅拌液体的搅拌臂实现机械应力。由于TOM烧杯没有盖子，有可能在TOM实验过程中取出样品，并在洗涤过程中针对在线信息进行分析。

TOM型洗涤系统主要被用于美国或拉美/亚太洗涤条件下的洗涤剂和酶的中等规模测试。在TOM实验中，诸如压载物对污渍的比率和织物对洗涤液体的比率的参数能够被改变。因此，TOM提供了小规模实验如AMSA和微洗涤与在顶部加载式洗衣机中的更加耗时的完整规模实验之间的联系。

通过添加CaCl

Terg-O-Tometer中的水浴中的温度和旋转(rpm)按照下文的设置被设定。当温度按照设置被调节时(容差为+/－0.5℃)，洗涤溶液按照下文描述的量被添加至TOM烧杯中。

在烧杯中以120rpm搅拌。2件稻米淀粉样品(CS-28)和污渍压载物被添加至每一烧杯，并按照下文所述的时间进行洗涤。在冷自来水中清洗样品5分钟。样品被置于黑暗中干燥过夜。

不同变体的TOM洗涤测试的结果显示在表3中。在上述结果中的指数是100。亲本α-淀粉酶(SEQ ID NO:7)的性能结果被指定为100的值，而将变体的结果与该值进行比较。

洗涤性能被测量为以反射值表示的经洗涤的织物颜色的亮度。反射值的测量使用Macbeth 7000Color Eye分光光度计进行。测量了每种干的样品。由于存在来自背景的干扰的风险，在反射值的测量过程中，样品被置于4层织物顶部。在460nm测量了反射值。没有包括UV滤光器。计算了样品的反射值结果的平均值。

如上文所述测试了被测试的变体和对应的亲本α-淀粉酶(SEQ ID NO:7)的洗涤性能。按照(变体的性能减空白的性能)除以(亲本的性能减空白的性能)乘以100给出了结果；其中所述空白是通过在相同条件下但不存在α-淀粉酶的洗涤获得的性能。

洗涤性能测试结果清楚地展示了，在所测试的温度，变体的性能相对于它们各自的亲本分子(SEQ ID NO 7)是改善的。

在该实验中，基于液体洗涤剂配方2A制备了四种测试组合物。从配方2A制备了基础洗涤剂，其不包含酶并且最终为pH 8.2。

三种淀粉酶敏感的污渍；PCS-28稻米淀粉、CS-128陈旧稻米淀粉和CS-26玉米淀粉，5cm×5cm(由Centre For Test materials，Netherlands提供)被粘附到20cm×20cm白色针织棉(由Warwick Equest，Durham，United Kingdom提供)。两种淀粉酶敏感的污渍；墨西哥辣肉酱和Heinz意大利面，直径2.5cm，被粘附到20cm×20cm白色针织棉(由WarwickEquest，Durham，United Kingdom提供)。对每一测试制剂使用了八个平行测定(4种不同的机器各2个平行测定)。

所述方法涉及使用西欧Hotpoint洗衣机，型号为Aquarius WF541。如上文所述的测试制剂被用于洗涤淀粉酶敏感的污渍，添加了如上文所述的混合的带污渍的和清洁的压载物。

包含6g/L的测试制剂、13L 10°克拉克硬度的水、加上测试织物&压载物的洗衣机在15℃以快速棉制品洗涤程序洗涤，进行了1小时15分钟。洗涤后，将测试织物在室内挂绳晾干。

洗涤过程被重复了另外的3个洗涤周期。

然后，测量了污渍去除指数(SRI)(如通过比较未洗涤的与经洗涤的L*a*b*值所测量的)，以对洗涤剂组合物的去污性能进行定量。

还通过计算(实例C、D、E、F或G的性能减比较实例A的性能)除以(比较实例B的性能减比较实例A的性能)乘以100，测量了性能指数。

通过比较用实例A(不存在酶)与实例B(包含Natalase)、C、D、E、F&G(分别包含变体3、4、5、6&7)的组合物洗涤的样品，显然淀粉酶的添加提高了去污性能。

通过比较用实例B(包含Natalase)与实例C、D、E、F&G(分别包含变体3、4、5、6&7)的组合物洗涤的样品，按照实例A作为参照(不存在酶)，显然本发明的变体3、4、5、6&7能够实现比

在本实验中，基于液体洗涤剂配方3A制备了四种测试组合物。从配方3A制备了基础洗涤剂，其不包含酶并且最终为pH 8.2。

三种淀粉酶敏感的污渍；PCS-28稻米淀粉、PS-28稻米淀粉和CS-29木薯淀粉，5cm×5cm(由Centre For Test materials，Netherlands提供)被粘附到20cm×20cm白色针织棉(由Warwick Equest，Durham，United Kingdom提供)。一种淀粉酶敏感的污渍；Heinz意大利面，直径2.5cm，被粘附到20cm×20cm白色针织棉(由Warwick Equest，Durham，UnitedKingdom提供)。一种淀粉酶敏感的污渍；肉汁，直径2.5cm，被粘附到25cm×24cm白色针织棉(由Accurate Product Development，Fairfield，Ohio，USA提供)。对每一测试制剂使用了八个平行测定(4种不同的机器各2个平行测定)。

所述方法涉及使用北美Kenmore洗衣机，600系列型号。如上文所述的测试制剂被用于洗涤淀粉酶敏感的污渍，添加了如上文所述的混合的带污渍的和清洁的压载物。

包含0.78g/L测试制剂、64L 6°克拉克水硬度的水、加上测试织物&压载物的洗衣机在15℃以12分钟的超洗涤带一次漂洗进行洗涤。洗涤后，将测试织物在室内挂绳晾干。洗涤过程被重复了另外的3个洗涤周期。

然后，测量了污渍去除指数(如通过比较未洗涤的与经洗涤的L*a*b*值所测量的)，以对洗涤剂组合物的去污性能进行定量。

还通过计算(实例C、D、E或F的性能减比较实例A的性能)除以(比较实例B的性能减比较实例A的性能)乘以100，测量了性能指数。

通过比较用实例A的组合物(不存在酶)与实例B(包含Natalase)、C、D、E和F(分别包含变体5、6、7和8)洗涤的样品，显然淀粉酶的添加提高了去污性能。

通过比较用实例B的组合物(包含Natalase)与实例C、D、E和F(分别包含变体5、6、7和8)洗涤的样品，按照实例A作为参照(不存在酶)，显然本发明的变体5、6、7和8能够实现比

如本文所描述和要求保护的发明不受本文所公开的特定方面的范围的限制，因为这些方面旨在作为本发明的多个方面的示例。任何等同的方面旨在处于在本发明的范围内。实际上，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。此类修改形式也旨在位于所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，包括定义的本公开将控制。

本发明包括一种清洁和/或处理部位，特别是表面或织物的方法。在一个方面，公开了包括如下步骤的此类方法：任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物，使所述表面或织物与本说明书中公开的任何消费品接触，然后任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物。

如本文所用，洗涤包括但不限于刷洗和机械搅拌。此类表面或织物的干燥可通过家庭或工业环境中采用的任何普通方法而实现。此类方法包括但不限于在电磁辐射(包括日光、红外线、紫外线和微波辐射)的存在或不存在下、在介于5个和0.01个大气压之间的压力下、在环境温度或高温下的强迫通风或静止空气干燥。在一个方面，所述干燥可通过使用熨斗而在高于环境温度的温度下实现，其中，例如，所述织物可与所述熨斗直接接触相对短或甚至是延长的时间，并且其中可以施加超出由于重力而通常存在的之外的压力。在另一方面，所述干燥可通过使用烘干机而在高于环境温度的温度下实现。用于干燥织物的设备是众所周知的，其通常被称为烘干机。除衣物之外，此类设备还被用于干燥许多其他物品，包括毛巾、床单、枕套、尿布等等，在世界上的许多国家，此类设备已作为基本上替换晾衣绳用于干燥织物用途的标准便利设备而被接受。如今所使用的大多数烘干机都利用热空气，当织物在烘干机内翻滚时，热空气经过织物之上和/或穿过织物。空气可以，例如，通过气火焰电子地、或甚至通过微波辐射被加热。此类空气可被加热至约15℃至约400℃，约25℃至约200℃，约35℃至约100℃，或甚至约40℃至约85℃，并在烘干机内被用于干燥表面和/或织物。正如本领域的技术人员所认可的那样，本发明的清洁组合物理想地适用于洗衣用途。因此，本发明包括一种用于洗涤织物的方法。所述方法包括以下步骤：将待洗涤的织物与所述清洁衣物洗涤溶液接触，所述清洁衣物洗涤溶液包含申请人的清洁组合物、清洁助剂或它们的混合物的至少一个实施例。织物可包括大多数可在正常的消费者或机构使用条件下洗涤的任何织物。所述溶液优选具有约8至约10.5的pH。所述组合物可以约500ppm至约15,000ppm浓度的溶液使用。水温典型地为约5℃至约90℃。水与织物的比率通常为约1:1至约30:1。

颗粒状衣物洗涤组合物设计用于手洗或顶部加载的洗衣机。

颗粒状衣物洗涤组合物设计用于前端加载的自动洗衣机。

具有C

C

AE3S是C

AE7是C

AE9是C

HSAS是如US 6,020,303和US 6,060,443所公开的具有约16-17的碳链长度的中间支化伯烷基硫酸盐聚丙烯酸酯MW 4500是由BASF提供的羧甲基纤维素是由CP Kelco，Arnhem，Netherlands提供的

荧光增白剂1是

TAED是四乙酰基乙二胺

S-ACMC是结合了C.I.活性蓝19的羧甲基纤维素，产品名AZO-CM-CELLULOSE

去污剂是

丙烯酸/马来酸共聚物的分子量为70,000，丙烯酸根与马来酸根的比率为70:30

EDDS是乙二胺-N,N′-二琥珀酸的钠盐，(S,S)异构体抑泡剂附聚物是由DowCorning，Midland，Michigan，USA提供的HSAS是中间支化的烷基硫酸盐

下文中提供了本发明的多隔室的单位剂量衣物洗涤剂配方。在这些实例中，单位剂量具有三个隔室，但类似的组合物能够以两个、四个或五个隔室被制得。用于包封所述隔室的膜是聚乙烯醇。

多隔室配方

本文所公开的尺寸和数值不应被理解为严格限于所述确切数值。相反，除非另外指明，每个上述尺寸旨在表示所述值以及该值附近的函数等效范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。