一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法

摘要

本发明涉及植物组培快繁技术领域，具体涉及一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法，通过猫须草预处理培育、外植体的清洁、外植体的消毒、初代培养、继代培养、生根培养和组培苗练苗移栽等步骤完成。本发明采用多种光谱性杀菌剂对培育猫须草外植体的基质、移栽苗及生长空间进行全方位的消毒处理，避免了外植体所携带的病菌等干扰物质对组织培养的影响。以猫须草预培养获得的带腋芽茎段为外植体材料，筛选出适合无菌短枝快速繁殖的外植体消毒方法以及不同培养阶段的培养基配方，提高了猫须草快速繁殖的效率和产量。本发明技术具有周期短、成苗快、遗传性状稳定，培养过程简单，种苗生长一致等特点，可用于猫须草的大规模工厂化生产满足市场需求。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组培快繁技术领域，具体涉及一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法。

背景技术

猫须草(Clerodendranthus spicatus.(Thunb.)C.Y.Wu)是唇形科肾茶属多年生草本植物，茎直立，具四棱，花冠浅紫或白色，花、果期5～11月。猫须草广泛分布于热带与亚热带地区，我国主要分布于广东海南，广西南部，云南南部，台湾及福建地区；喜温暖湿润的气候，常生于林下潮湿处，土质以疏松肥沃的砂质壤土为佳，平地、缓坡地均能种植，对光照要求不严，可在全光照下栽培，有一定荫蔽条件生长更好。民间多用此草药治疗急慢性肾炎，膀胱炎，尿路结石，对风湿性关节炎也有良好的作用。现代研究显示，猫须草具有利尿、排石、抗菌、消炎、健肾、改善慢性肾功能衰竭和提高免疫力等七种医疗保健作用。猫须草作为一种具有巨大开发前景的植物，由于其具有重要的药理作用，市场需求日益扩大。然而，猫须草结果率低，种子寿命只有15d，发芽率仅为40％，野生药材资源日趋枯竭，传统生产繁殖方式难以满足市场需求。采用植物组织培养快繁技术，提供猫须草大规模种植所需健康种苗已经成为急需解决的问题。

近年来国内已有关于猫须草组织培养的研究，但通常是通过愈伤组织发生或丛生芽发生途径再生植株这一技术路线，对采用无菌短枝快繁技术进行猫须草离体快速繁殖的研究很少。无菌短枝快繁技术类似于微型扦插，指外植体携带的带腋芽茎段，在人工培养基和合适的条件下进行离体培养，使其长出新的枝条，再将其剪成带腋芽茎段，继代再生根成苗的繁殖方法。无菌短枝快繁技术成苗快，不经过愈伤组织诱导阶段，遗传性状稳定，培养过程简单，移裁容易成活，因此可能更适合大规模工厂化生产。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法。

本发明一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法，具体包括如下步骤：

步骤一，猫须草预处理培育：

S1：选取健壮无病虫害的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，在枝条离地面3～4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4％的咪酰胺或者浓度为0.2％的代森锰锌药液浸泡消毒1～2h；

S2：浸泡后移栽到，装有用50％水溶代森铵350倍液消毒过后的培育基质的花盆内，并移入可密闭塑料大棚中；

S3：移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌的混合液，或者单用浓度为0.4％的咪酰胺，或者单用浓度为0.2％的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次；当猫须草顶部新抽出幼嫩芽段时，将其从基部剪断，作为无菌短枝快速繁殖用的外植体；

步骤二，外植体的清洁：将通过猫须草预处理培育得到的外植体带回实验室，剪去叶片，清水冲洗一遍，剪成2～3cm带有一对腋芽的茎段，用洗洁精溶液浸泡5分钟，流水冲洗20min，控干水分后装入灭菌后的空瓶中，放入超净工作台，备用；

步骤三，外植体的消毒：在超净工作台中，将外植体转移至新的灭菌后的空瓶中，倒入75％酒精浸泡外植体10～20s，用灭菌水冲洗一次，用0.1％升汞溶液浸泡4～8min，期间不断摇动，用灭菌水冲洗6～8次，用灭菌纸吸干后接种；

步骤四，初代培养：在超净工作台中将消毒好的外植体用接种刀切掉外部边缘部分，用镊子将带有一对腋芽的无菌短枝茎段按极性接种于装有初代培养基的接种盘中，于培养室中培养15～30天；即可长成2～5cm的组培苗；初代培养选用MS基本培养基附加6-BA0.5～2.0mg/L、NAA0.1～1.0mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；

步骤五，继代培养：将步骤四中得到的初代培养组培苗再剪成带有一对腋芽的无菌短枝茎段，按极性接种于装有继代培养基的接种盘中，于培养室中培养15～30天；即可长成2～5cm的组培苗；继代培养基选用MS基本培养基附加TDZ 0.01～0.1mg/L、IBA0.1～1.0mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；

步骤六，生根培养：将步骤五中的继代培养组培苗从基部剪下，置于生根培养基中，于培养室中培养15～30天；即可根长度达4～6cm，根须为白色；生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加NAA 0.5～2.0mg/L、IBA 0.5～2.0mg/L、活性炭2～3g/L，蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；

步骤七，组培苗练苗移栽：待生根培养基质中的小苗长到3～5cm高，根条数达6～10条时，将其移到塑料大棚中，自然光下练苗7～10天；后将其从培养瓶中取出，洗净其底部培养基，置于多菌灵溶液中浸泡5～7min，移栽入已消毒培育基质中，长出猫须草新叶即表示移栽成活。

进一步的，所述步骤一中的S2所述的可密闭塑料大棚在移入前，用0.4％的咪酰胺和0.2％的代森锰锌消毒地面和四周。

进一步的，步骤二中的S3中当猫须草顶部新抽出幼嫩芽段生长至8～10cm时，于晴天下午两点钟将其从基部剪断，作为无菌短枝快速繁殖用的外植体；

进一步的，所述无菌短枝茎段每瓶接种1～2个，每个无菌短枝茎段带有一对腋芽。

进一步的，所述步骤四、步骤五和步骤六中培养条件，均为培养温度为23～28℃，光照强度为2000～2500lx。

进一步的，所述步骤一和步骤七中的培育基质由体积比为1：1：1的珍珠岩、细河沙和泥炭土组成，其消毒方式为：用50％水溶代森铵350倍液，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒。

进一步的，所述75％酒精和0.1％升汞在接种前一天配置；所述无菌水、无菌纸、接种盘、空瓶、镊子、接种刀在121℃下灭菌35min，所述培育基质的灭菌在121℃下灭菌18min。

相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在无菌短枝快速繁殖前对猫须草进行预处理培育，采用多种光谱性杀菌剂对培育猫须草外植体的基质、移栽苗及生长空间进行全方位的消毒处理，避免了外植体所携带的病菌等干扰物质对组织培养的影响。

(2)本发明以猫须草预培养获得的带腋芽茎段为外植体材料，筛选出适合无菌短枝快速繁殖的外植体消毒方法以及不同培养阶段的培养基配方，提高了猫须草快速繁殖的效率和产量。

(3)本发明所采用无菌短枝型快速繁殖技术具有周期短、成苗快、遗传性状稳定，培养过程简单，种苗生长一致等特点，可用于猫须草的大规模工厂化生产满足市场需求。

附图说明

图1为猫须草无菌短枝快速繁殖外植体材料；

图2为新抽出幼嫩芽段的猫须草无菌短枝快速繁殖外植体；

图3为猫须草无菌短枝在初代培养基中培养5天；

图4为猫须草无菌短枝在初代培养基中培养20天；

图5为猫须草无菌短枝在继代培养基中培养15天；

图6为猫须草无菌短枝在生根培养基中长出的白色根须；

图7为猫须草无菌短枝组培小苗移栽后。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法，具体包括如下步骤：

步骤一，猫须草预处理培育：

S1：选取健壮无病虫害的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，在枝条离地面3～4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4％的咪酰胺或者浓度为0.2％的代森锰锌药液浸泡消毒1.5h；

S2：浸泡后移栽到，装有用50％水溶代森铵350倍液消毒过后的培育基质的花盆内，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，并移入可密闭塑料大棚中；可密闭塑料大棚在移入前，用0.4％的咪酰胺和0.2％的代森锰锌消毒地面和四周；

S3：移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌的混合液，或者单用浓度为0.4％的咪酰胺，或者单用浓度为0.2％的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次；当猫须草顶部新抽出幼嫩芽段生长至8～10cm时，于晴天下午2点钟将其从基部剪断，带回实验室作为无菌短枝快速繁殖用的外植体；

步骤二，外植体的清洁：将通过猫须草预处理培育得到的外植体带回实验室，用剪刀剪去叶片，清水冲洗一遍，剪成2～3cm带有一对腋芽的茎段(附图1和2所示)，用洗洁精溶液浸泡5分钟，流水冲洗20min，控干水分后装入灭菌后的空瓶中，放入超净工作台，备用；

步骤三，外植体的消毒：在超净工作台中，用镊子将外植体转移至新的灭菌后的空瓶中，倒入75％酒精浸泡外植体20s，用灭菌水冲洗一次，用0.1％升汞溶液浸泡8min，期间不断摇动，用灭菌水冲洗7次，用灭菌纸吸干后接种；

步骤四，初代培养：在超净工作台中将消毒好的外植体用接种刀切掉外部边缘褐变部分，用镊子将带有一对腋芽的无菌短枝茎段按极性接种于装有初代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段(如附图3所示)；初代培养选用MS基本培养基附加6-BA1.0mg/L、NAA1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养20天，20天后即可长成2～5cm的组培苗(如附图4所示)；

步骤五，继代培养：将步骤四中得到的初代培养组培苗再剪成带有一对腋芽的无菌短枝茎段，按极性接种于装有继代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段；继代培养基选用MS基本培养基附加TDZ 0.05mg/L、IBA0.2mg/L、蔗糖20g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养15天，15天即可长成2～5cm的组培苗(如附图5所示)；

步骤六，生根培养：将步骤五中的继代培养组培苗从基部剪下，置于生根培养基中，每瓶接入一棵无菌短枝组培苗；生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加NAA 1.0mg/L、IBA 1.0mg/L、活性炭2.5g/L，蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养25天，根长度达4～6cm，根须为白色，生根率达98％以上(如附图6所示)；

步骤七，组培苗练苗移栽：待生根培养基质中的小苗长到3～5cm高时，组培苗根条数达6～10条时，将其移到塑料大棚中，自然光下练苗7天；后将其从培养瓶中取出，洗净其底部培养基，置于多菌灵溶液中浸泡5min，移栽入用50％水溶代森铵350倍液已消毒培育基质中，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，长出猫须草新叶即表示移栽成活(详见附图7)，培育基质由体积比为1：1：1的珍珠岩、细河沙和泥炭土组成。

其中，75％酒精和0.1％升汞在接种前一天配置；无菌水、无菌纸、接种盘、空瓶、镊子、接种刀在121℃下灭菌35min，所述培育基质的灭菌在121℃下灭菌18min。

实施例2

本发明一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法，具体包括如下步骤：

步骤一，猫须草预处理培育：

S1：选取健壮无病虫害的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，在枝条离地面3～4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4％的咪酰胺或者浓度为0.2％的代森锰锌药液浸泡消毒1h；

S2：浸泡后移栽到，装有用50％水溶代森铵350倍液消毒过后的培育基质的花盆内，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，并移入可密闭塑料大棚中；可密闭塑料大棚在移入前，用0.4％的咪酰胺和0.2％的代森锰锌消毒地面和四周；

S3：移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌的混合液，或者单用浓度为0.4％的咪酰胺，或者单用浓度为0.2％的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次；当猫须草顶部新抽出幼嫩芽段生长至8～10cm时，于晴天下午2点钟将其从基部剪断，带回实验室作为无菌短枝快速繁殖用的外植体；

步骤二，外植体的清洁：将通过猫须草预处理培育得到的外植体带回实验室，用剪刀剪去叶片，清水冲洗一遍，剪成2～3cm带有一对腋芽的茎段(附图1和2所示)，用洗洁精溶液浸泡5分钟，流水冲洗20min，控干水分后装入灭菌后的空瓶中，放入超净工作台，备用；

步骤三，外植体的消毒：在超净工作台中，用镊子将外植体转移至新的灭菌后的空瓶中，倒入75％酒精浸泡外植体10s，用灭菌水冲洗一次，用0.1％升汞溶液浸泡5min，期间不断摇动，用灭菌水冲洗7次，用灭菌纸吸干后接种；

步骤四，初代培养：在超净工作台中将消毒好的外植体用接种刀切掉外部边缘褐变部分，用镊子将带有一对腋芽的无菌短枝茎段按极性接种于装有初代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段(如附图3所示)；初代培养选用MS基本培养基附加6-BA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养20天，20天后即可长成2～5cm的组培苗(如附图4所示)；

步骤五，继代培养：将步骤四中得到的初代培养组培苗再剪成带有一对腋芽的无菌短枝茎段，按极性接种于装有继代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段；继代培养基选用MS基本培养基附加TDZ 0.01mg/L、IBA0.1mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养15天，15天即可长成2～5cm的组培苗(如附图5所示)；

步骤六，生根培养：将步骤五中的继代培养组培苗从基部剪下，置于生根培养基中，每瓶接入一棵无菌短枝组培苗；生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加NAA 2.0mg/L、IBA 2.0mg/L、活性炭3g/L，蔗糖25g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完在温度为23～25℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养25天，根长度达4～6cm，根须为白色，生根率达98％以上(如附图6所示)；

步骤七，组培苗练苗移栽：待生根培养基质中的小苗长到3～5cm高时，组培苗根条数达6～10条时，将其移到塑料大棚中，自然光下练苗7天；后将其从培养瓶中取出，洗净其底部培养基，置于多菌灵溶液中浸泡5min，移栽入用50％水溶代森铵350倍液已消毒培育基质中，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，长出猫须草新叶即表示移栽成活(详见附图7)，培育基质由体积比为1：1：1的珍珠岩、细河沙和泥炭土组成。

其中，75％酒精和0.1％升汞在接种前一天配置；无菌水、无菌纸、接种盘、空瓶、镊子、接种刀在121℃下灭菌35min，所述培育基质的灭菌在121℃下灭菌18min。

实施例3

本发明一种猫须草无菌短枝快速繁殖的方法，具体包括如下步骤：

步骤一，猫须草预处理培育：

S1：选取健壮无病虫害的猫须草，小心挖起，抖掉根部的土壤并用清水冲洗，在枝条离地面3～4cm处修剪及剪去老叶保留叶柄，将修剪好的枝条用浓度为0.4％的咪酰胺或者浓度为0.2％的代森锰锌药液浸泡消毒2h；

S2：浸泡后移栽到，装有用50％水溶代森铵350倍液消毒过后的培育基质的花盆内，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，并移入可密闭塑料大棚中；可密闭塑料大棚在移入前，用0.4％的咪酰胺和0.2％的代森锰锌消毒地面和四周；

S3：移栽苗定植后，每隔7天交替使用浓度为0.4％的咪酰胺和浓度为0.2％的代森锰锌的混合液，或者单用浓度为0.4％的咪酰胺，或者单用浓度为0.2％的代森锰锌药液喷洒苗植株、地面以及塑料大棚四周一次；当猫须草顶部新抽出幼嫩芽段生长至8～10cm时，于晴天下午2点钟将其从基部剪断，带回实验室作为无菌短枝快速繁殖用的外植体；

步骤二，外植体的清洁：将通过猫须草预处理培育得到的外植体带回实验室，用剪刀剪去叶片，清水冲洗一遍，剪成2～3cm带有一对腋芽的茎段(附图1和2所示)，用洗洁精溶液浸泡5分钟，流水冲洗20min，控干水分后装入灭菌后的空瓶中，放入超净工作台，备用；

步骤三，外植体的消毒：在超净工作台中，用镊子将外植体转移至新的灭菌后的空瓶中，倒入75％酒精浸泡外植体20s，用灭菌水冲洗一次，用0.1％升汞溶液浸泡8min，期间不断摇动，用灭菌水冲洗8次，用灭菌纸吸干后接种；

步骤四，初代培养：在超净工作台中将消毒好的外植体用接种刀切掉外部边缘褐变部分，用镊子将带有一对腋芽的无菌短枝茎段按极性接种于装有初代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段(如附图3所示)；初代培养选用MS基本培养基附加6-BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖25g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为25～28℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养20天，20天后即可长成2～5cm的组培苗(如附图4所示)；步骤五，继代培养：将步骤四中得到的初代培养组培苗再剪成带有一对腋芽的无菌短枝茎段，按极性接种于装有继代培养基的接种盘中，每瓶接种1～2个无菌短枝茎段；继代培养基选用MS基本培养基附加TDZ 0.1mg/L、IBA1.0mg/L、蔗糖25g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完后在温度为25～28℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养15天，15天即可长成2～5cm的组培苗(如附图5所示)；

步骤六，生根培养：将步骤五中的继代培养组培苗从基部剪下，置于生根培养基中，每瓶接入一棵无菌短枝组培苗；生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加NAA 0.5mg/L、IBA 0.5mg/L、活性炭2g/L，蔗糖30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0；接种完在温度为25～28℃，光照强度为2000～2500lx的条件下于培养室中培养25天，根长度达4～6cm，根须为白色，生根率达95％以上(如附图6所示)；

步骤七，组培苗练苗移栽：待生根培养基质中的小苗长到3～5cm高时，组培苗根条数达6～10条时，将其移到塑料大棚中，自然光下练苗10天；后将其从培养瓶中取出，洗净其底部培养基，置于多菌灵溶液中浸泡7min，移栽入用50％水溶代森铵350倍液已消毒培育基质中，按每平方米培育基质用3公斤稀释液均匀喷洒，长出猫须草新叶即表示移栽成活(详见附图7)，培育基质由体积比为1：1：1的珍珠岩、细河沙和泥炭土组成。

其中，75％酒精和0.1％升汞在接种前一天配置；无菌水、无菌纸、接种盘、空瓶、镊子、接种刀在121℃下灭菌35min，所述培育基质的灭菌在121℃下灭菌18min。

对比例1

对比例1与实施例1的区别在于采用的外植体消毒方法不同，具体如下：在超净工作台中，将外植体转移至新的灭好菌的空瓶中，倒入75％酒精浸泡外植体10s，用灭菌水冲洗一次，用0.1％升汞溶液浸泡10min，期间不断摇动，用灭菌水冲洗7次，用灭菌纸吸干后接种。

表1不同消毒方法下的萌芽率和污染率

由表1可以看出升汞消毒时间为4～6min较合适，而当升汞消毒时间达8min时，外植体的萌芽率明显下降。

对比例2

对比例2与实施例1的区别在于初代培培养基的配方不同，具体为MS基本培养基附加6-BA1.0 mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0。

对比例3

对比例3与实施例1、实施例2的区别在于初代培培养基的配方不同，具体为MS基本培养基附加6-BA 2.0mg/L、NAA1.0 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0(详见表2)。

表2不同初代培养基下组培苗的生长情况

由表2可以看出，当初代培养基中添加6-BA 1.0mg/L、NAA0.5mg/L、或6-BA 1.0mg/L、NAA 0.5mg/L，培养20天后每个无菌短枝可成2～4棵组培苗，每棵苗茎长可达2～5cm。

对比例4

对比例4与实施例1的区别在于生根培养基的配方不同，具体为1/2MS基本培养基附加NAA1.5mg/L、IBA 1.5mg/L、活性炭3g/L、蔗糖20g/L、琼脂7g/L；调节pH至5.8～6.0。

表3不同生根培养基下组培苗的生根情况

由表3可以看出，当生根培养基中添加IBA1.0 mg/L、NAA 1.0mg/L或IBA1.0 mg/L、NAA 1.0mg/L时，生根率可达95％以上。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。