一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用

摘要

本发明提供一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用，该培养基包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分不含维生素A的B27，1‑5×；N‑acetylcysteine，1‑10mM；L‑WRN细胞上清液，5％～30％；小鼠IGF 50‑500ng/ml；小鼠EGF，10‑100ng/ml；Y27632，5‑50μM；Nicotinamide，5‑50mM；前述的百分浓度表示体积浓度。采用本发明的培养基培养的小鼠胰腺类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征，并且小鼠胰腺类器官可以在体外长期扩增，大于5代。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用。

背景技术

如何准确地认识人类疾病是科学家一直深思的重大课题，临床上发生的很多疾病之所以没有得到有效的治疗，主要的原因就是因为缺乏对疾病的发生原因和机制的了解。目前，小鼠是医学研究中最重要的模型动物，小鼠的基因与人类相似度达95％，拥有人类相似的免疫系统及易于进行基因工程与细胞工程的改造，这些优点决定了小鼠模型在生物学及医学的科学研究中具有得天独厚的优势。然而，即便小鼠动物模型有诸多的优势，却依然存在建模流程繁杂、建模时间长、操作难度大、硬件要求高和建模成本高昂等特点。

类器官是由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或成体组织驻留的祖细胞体外培养形成的三维细胞团结构。类器官是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵利基成分、信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。同时，可将类器官移植体内进行功能评估。此外，也可从患者自身组织或诱导的多能干细胞产生类器官，可用于研究缺乏动物模型的罕见疾病。在再生医学中，类器官技术有望替代严重受损的器官，如1型糖尿病患者的胰腺。

糖尿病是由遗传因素和环境因素长期共同作用导致的一种慢性、全身性代谢疾病。全球有4.3亿的糖尿病患者，其中1/4在中国。胰岛β细胞功能失常导致的胰岛素分泌不足是1型糖尿病和2型糖尿病的共同特征之一，许多患者需要终生使用胰岛素进行治疗。近年来，胰岛移植作为新兴的糖尿病治疗方法取得了一定的成功。但目前胰岛移植仍存在移植物在宿主体内难以长期存活，患者不易获得胰岛素非依赖状态，平均脱离胰岛素的期限为15个月；免疫抑制问题等。

小鼠胰腺类器官恰好可用于糖尿病的研究，以及胰岛/胰腺移植和移植后遗症的研究，同时小鼠胰腺类器官也可用于胰腺癌、胰腺炎等疾病的研究，胰腺分泌功能的研究，胰腺类新药的研发等。自2009年以来，已经有多种不同组织分离培养的类器官，如肝脏、胰脏、肺、肠、胃和前列腺等，但在小鼠胰腺类器官大量培养方面仍未见有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用以解决上述问题。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种小鼠胰腺类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，1-5×；N-acetylcysteine，1-10mM；L-WRN细胞上清液，5％～30％；小鼠IGF 50-500ng/ml；小鼠EGF，10-100ng/ml；Y27632，5-50μM；Nicotinamide，5-50mM；SAR407899，5-50μM；维生素B3，5-50mM；氢化可的松，1-10uM；Primocin，50-250ug/ml；硫酸庆大霉素10-100μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

进一步地，所述基础培养基为无血清培养基。

优选地，所述无血清培养基为DMEM/F12(1:1)减血清培养基。

优选地，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，1-3×；N-acetylcysteine，1-10mM；L-WRN细胞上清液，10％～30％；小鼠IGF 100-200ng/ml；小鼠EGF，10-50ng/ml；Y27632，10-30μM；Nicotinamide，10-20mM；SAR407899，5-10μM；维生素B3，5-10mM；氢化可的松，2-6uM；Primocin，100-200ug/ml；硫酸庆大霉素10-50μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

进一步地，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。

第二个方面，本发明提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，包括以下步骤：

1)将小鼠胰腺进行预处理后消化并过滤，得到细胞团；

2)采用上述培养基重悬所述细胞团，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加入上述培养基，并于37℃、5％CO

进一步地，所述细胞团的直径为15～100μm。

第三个方面，本发明提供一种小鼠胰腺类器官，是采用上述培养方法获得。

本发明的有益效果是：

①本发明培养基含有小鼠胰腺类器官培养所需的最少组分，能够培养来源于小鼠胰腺正常组织的样本，培养的小鼠胰腺类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。

②本发明培养基中细胞因子均为鼠源，且除小鼠表皮生长因子外细胞因子为鼠源细胞L-WRN细胞系分泌，更接近体内正常生长状态，有利于类器官的生长与形态结构维持。此外，使用L-WRN细胞上清代替细胞因子具有大规模生产方便，成本更低的优点。

③本发明培养基培养的小鼠胰腺类器官可以在体外长期扩增，大于5代。

④本发明培养基配合本发明培养方法可将直径为15-100um的小鼠胰腺细胞团培养成小鼠胰腺类器官。

⑤本发明培养基配合本发明培养方法，在小鼠胰腺细胞团数量仅有1000个时，仍可培养出小鼠胰腺类器官。

⑥本发明培养基配合本发明培养方法，操作简单，人员操作影响较少，稳定性高。

附图说明

图1为本发明实施例5小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图2为本发明实施例5小鼠胰腺类器官组织形态结构图。

图3为本发明实施例6小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图4为本发明实施例7小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图5为本发明实施例8小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图6为本发明实施例9小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图7为本发明实施例10小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图8为本发明对比例2小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

图9为本发明对比例6小鼠胰腺类器官光学显微镜下图片。

具体实施方式

本发明实施例采用的S-Reduce减血清DMEM/F12(1:1)培养基购自上海源培公司。

本发明实施例采用的不含维生素A的B27购自ThermoFisher公司。

本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma-Aldrich公司。

本发明实施例采用的L-WRN细胞上清液由购自ATCC的L-WRN细胞系培养得到。

本发明实施例采用的小鼠IGF购自PeproTech公司。

本发明实施例采用的小鼠EGF购自PeproTech公司。

本发明实施例采用的Y27632购自Sigma-Aldrich公司。

本发明实施例采用的Nicotinamide购自Sigma-Aldrich公司。

本发明实施例采用的SAR407899购自MedChemExpress公司。

本发明实施例采用的维生素B3购自Sigma-Aldrich公司。

本发明实施例采用的氢化可的松购自Sigma-Aldrich公司。

本发明实施例采用的Primocin购自Invivogen公司。

本发明实施例采用的硫酸庆大霉素购自上海生工公司。

此外，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，1×；N-acetylcysteine，2mM；L-WRN细胞上清液，15％；小鼠IGF 150ng/ml；小鼠EGF，20ng/ml；Y27632，20μM；Nicotinamide，15mM；SAR407899，8μM；维生素B3，7.5mM；氢化可的松，5uM；Primocin，150ug/ml；硫酸庆大霉素20μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

实施例2

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，2.5×；N-acetylcysteine，10mM；L-WRN细胞上清液，30％；小鼠IGF 100ng/ml；小鼠EGF，40ng/ml；Y27632，15μM；Nicotinamide，10mM；SAR407899，5μM；维生素B3，10mM；氢化可的松，2uM；Primocin，100ug/ml；硫酸庆大霉素40μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

实施例3

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，5×；N-acetylcysteine，5mM；L-WRN细胞上清液，7.5％；小鼠IGF 400ng/ml；小鼠EGF，80ng/ml；Y27632，7.5μM；Nicotinamide，40mM；SAR407899，40μM；维生素B3，40mM；氢化可的松，1.5uM；Primocin，50ug/ml；硫酸庆大霉素100μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

实施例4

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，2×；N-acetylcysteine，7.5mM；L-WRN细胞上清液，20％；小鼠IGF 75ng/ml；小鼠EGF，100ng/ml；Y27632，40μM；Nicotinamide，7.5mM；SAR407899，20μM；维生素B3，20mM；氢化可的松，10uM；Primocin，250ug/ml；硫酸庆大霉素10μg/mL；前述的百分浓度表示体积浓度。

实施例5

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，该培养方法包括以下步骤：

1)将新鲜的小鼠胰腺进行预处理，先用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎。

2)将组织块进行消化、过滤，获取直径15um-100um的细胞团，离心去除上清备用。

3)取适量实施例1的培养基重悬细胞，用预冷的枪头在冰上取适量Matrigel基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液。

4)用移液器将细胞-胶混合液滴到60mm培养皿中，形成30-50ul/滴的胶滴。

5)将接种胶滴后的培养皿放入CO

6)培养皿中加入3ml实施例1的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO

7)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到小鼠胰腺类器官，类器官平均直径在80～100μm，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图1所示。将培养得到的小鼠胰腺类器官按常规方法进行石蜡包埋并切片，然后按照常规HE染色流程进行染色，染色后在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。从组织结构图看出，小鼠胰腺类器官维持了原组织的形态结构。

实施例6

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，是采用实施例2的培养基，该培养方法同实施例5。培养9天后可得到小鼠胰腺类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图3所示。

实施例7

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，是采用实施例3的培养基，该培养方法同实施例5。培养8天后可得到小鼠胰腺类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图4所示。

实施例8

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，是采用实施例4的培养基，该培养方法同实施例5。培养4天后可得到小鼠胰腺类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图5所示。

实施例9

按照实施例5得到原代小鼠胰腺类器官后，对其进行传代培养，传代培养操作如下：

1、用移液器吸出培养皿中的培养液，取1-2ml凝胶消化液消化含类器官的胶滴(用移液器反复吹打，将胶滴吹散，可提高消化效率)，放入培养箱，37℃消化10min；

2、加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液，1000rpm，离心3min；

3、弃去上清液，加入200μl实施例2的培养基重悬类器官，加入250μlMatrigel基质胶混匀，滴至新的35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补2-4ml实施例2的培养基，37℃培养箱静置培养。

传代培养6天后得到第二代小鼠胰腺类器官，按照此方法连续传代，培养40天后，得到第6代小鼠胰腺类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图6所示，类器官结构形态良好，经过6代以后的小鼠胰腺类器官仍然可以维持原组织的形态结构。

实施例10

本实施例提供一种小鼠胰腺类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，该培养方法同实施例5，在步骤(2)得到细胞团后进行计数，取1000个细胞团用于步骤(3)与Matrigel基质胶混合培养。培养10天后可得到小鼠胰腺类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图7所示，说明即便在小鼠胰腺细胞团数量仅有1000个时，仍可培养出小鼠胰腺类器官。

对比例1：

将实施例1中基础培养基S-Reduce减血清DMEM/F12(1:1)换成DMEM培养基，其他条件一样同实施例1，按照实施例5进行小鼠胰腺类器官培养。结果在步骤(7)培养6天后，在普通光学显微镜下随机挑选中间区域5个视野进行类器官数量与尺寸大小测定。实施例5的类器官在数量与平均尺寸上显著优于对比例1，这说明采用S-Reduce减血清DMEM/F12(1:1)作为基础培养基较比采用DMEM更适宜小鼠胰腺类器官的生长。

对比例2：

将实施例1中采用细胞因子(R-spondin-1，100ng/ml；Noggin，200ng/ml；Wnt-3a，100ng/ml)替代L-WRN细胞上清，其他成分同实施例1，然后使用上述培养基按照实施例5进行小鼠胰腺类器官培养，结果在步骤(7)培养6天后在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图8所示，实施例5和对比例1的结果差异明显，实施例5得到的类器官直径较大，整体发育较快，对比例1也能获得类器官，但生长略慢于实施例5。此外，使用L-WRN细胞上清可大大降低培养基成本。

对比例3

本对比例提供的培养基中不添加L-WRN细胞上清，其他同实施例1。

使用上述培养基按照实施例5方法进行小鼠胰腺类器官培养。结果在步骤(7)培养2天后，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明L-WRN细胞上清对小鼠胰腺类器官形态结构的维持是不可或缺的。

对比例4

本对比例提供的培养基中不添加小鼠IGF，其他同实施例1。

使用上述培养基按照实施例5方法进行小鼠胰腺类器官培养。结果在步骤(7)培养2天后，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明L-WRN细胞上清对小鼠胰腺类器官形态结构的维持是不可或缺的。

对比例5：

本对比例提供的培养基中不添加SAR407899，其他同实施例1。

使用上述培养基按照实施例5方法进行小鼠胰腺类器官培养。结果在步骤(7)培养6天后，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明SAR407899对小鼠胰腺类器官形态结构的维持是不可或缺的。

对比例6

本对比例提供的培养基中不添加小鼠EGF，其他同实施例1。

使用上述培养基按照实施例5方法进行小鼠胰腺类器官培养。结果在步骤(7)培养6天后，培养结果如图9所示，小鼠胰腺类器官生长缓慢，数量稀少。这说明小鼠EGF对小鼠胰腺类器官生长是不可或缺的。

综上，本发明的培养基含有小鼠胰腺类器官培养所需的最少组分，能够培养来源于小鼠胰腺正常组织的样本，培养的小鼠胰腺类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。此外，本发明培养基培养的小鼠胰腺类器官可以在体外长期扩增，大于5代。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。