miR-10527-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及检测试剂盒

摘要

本发明涉及miR‑10527‑5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及检测试剂盒，本发明首次揭示了血浆外泌体miR‑10527‑5p与食管癌发生发展、淋巴结转移密切相关，在食管癌、淋巴结转移患者中显著降低且具有统计学意义。基于此，本发明将miR‑10527‑5p的检测试剂应用于制备食管癌的检测试剂盒，制备得到的食管癌检测试剂盒可以简便快捷、无创、特异性高的应用于食管癌早期诊断及预警淋巴结转移，同时可用于指导食管癌患者术前新辅助化疗，具有重要的临床意义及推广价值。

说明书

技术领域

本发明涉及miR-10527-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及检测试剂盒，属于医疗卫生技术领域。

背景技术

食管癌作为消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内位居所有恶性肿瘤的第8位，死亡率位居第6位。据2013年世界卫生组织统计，在全球范围内，每年约有442000例患者诊断为食管癌，约有440000例患者因食管癌而死亡。近年来，尽管食管癌诊疗技术得到明显提升，其预后仍然较差，5年总体生存率仅为20％左右。淋巴结转移作为食管癌患者预后的独立危险因素，是预后不佳的主要原因之一。研究表明，转移性淋巴结数目与食管癌患者不良预后密切相关。0，0-2，≥3个淋巴结阳性患者的5年生存率分别为59.8％，33.4％及9.4％。目前判断淋巴结转移的主要方法为影像学检查，而一些患者术前CT检查无明显肿大的淋巴结，术后病理却证实为淋巴结阳性。因此，目前迫切的需要一种较为敏感的标志物，为预测食管癌患者淋巴结转移提供线索和依据，进而指导术前新辅助化疗，以促进食管癌患者的个体化治疗，这对于改善患者预后，提高患者生存质量具有重要意义。

外泌体(exosomes)是细胞在生理或病理条件下释放到细胞外的直径在40-150nm的双层囊泡结构，由细胞膜内陷后通过一系列复杂的机制形成多囊泡小体，通过与细胞膜融合，释放外泌体至细胞外。外泌体可携带一系列生物活性物质，如脂质、蛋白质和核酸(microRNA，CicroRNA及LncRNA)等。研究表明多种肿瘤细胞如：食管癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胃癌细胞等均可分泌外泌体，并可通过不同分子机制影响肿瘤化疗耐药、肿瘤免疫、血管生成及迁移侵袭等过程，成为近年来肿瘤研究的热点。外泌体几乎在所有体液，如血液、尿液、唾液、母乳、精液、前列腺液、脑脊液、羊水和胸腔积液等中均有分布，且具有较高的组织特异性和稳定性，可用于肿瘤无创性检查。

microRNA是近几年来研究的热点，它是一类短链内源性非编码RNA，长约17-24个碱基，数量约占基因组的1％，其可通过与靶基因的3'-UTR区域完全或不完全配对，导致mRNA降解或抑制其翻译，进而调控细胞的分化、增殖、凋亡等病理生理过程，发挥其促癌或抑癌基因的作用。相对于游离miRNA而言，血浆外泌体中miRNA由于有外泌体双层脂膜的保护，可避免被RNA酶降解从而保持稳定性，进而更为有效地发挥远距离信号传递功能，为肿瘤远处转移提供条件。因此，发现特异性高的血浆外泌体microRNA，并应用于食管癌的早期诊断及淋巴结转移的判断，对食管癌的早期筛查、个体化治疗必将起到巨大的推动作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了miR-10527-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及检测试剂盒，本发明首次揭示了miR-10527-5p的表达水平在食管癌患者和伴有淋巴结转移的食管癌患者血浆外泌体中显著降低，以miR-10527-5p的检测试剂制备得到的食管癌检测试剂盒可以简便快捷、无创、特异性高的用于食管癌的早期诊断及预警淋巴结转移。

本发明技术方案如下：

miR-10527-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用。

根据本发明优选的，所述miR-10527-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述食管癌为食管鳞癌。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒用于检测血浆外泌体中的miR-10527-5p。

一种食管癌检测试剂盒，包括miR-10527-5p的逆转录反应试剂和miR-10527-5p的荧光定量PCR反应试剂。

根据本发明优选的，所述miR-10527-5p的荧光定量PCR反应试剂包括miR-10527-5p的正向引物和反向引物，所正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物为通用引物。

根据本发明优选的，所述miR-10527-5p的逆转录反应采用加尾法进行。

根据本发明优选的，所述食管癌检测试剂盒还包括内参体系。

进一步优选的，所述内参体系为内参基因U6的实时荧光定量PCR检测体系，包括U6基因的正向引物和反向引物，所正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物为通用引物。

上述试剂盒中还包括用于加尾法逆转录和实时荧光定量PCR的酶液和缓冲液体系，均可为现有的市购产品。

上述试剂盒还可以包括血浆外泌体快速提取试剂、血浆外泌体RNA提取试剂，均可为现有的市购产品。

上述试剂盒可以用于食管癌的早期诊断，还可以用于预警食管癌患者的淋巴结转移，为食管癌患者的早期筛查与治疗提供指导。

本发明有益效果在于：

1、本发明首次揭示了血浆外泌体miR-10527-5p与食管癌发生发展、淋巴结转移密切相关，在食管癌、淋巴结转移患者中显著降低且具有统计学意义。基于此，本发明将miR-10527-5p的检测试剂应用于制备食管癌的检测试剂盒，制备得到的食管癌检测试剂盒可以简便快捷、无创、特异性高的应用于食管癌早期诊断及预警淋巴结转移。

2、本发明中血浆外泌体miR-10527-5p作为食管癌早期诊断及预警淋巴结转移的标志物，灵敏度高，特异性好。根据miR-10527-5p设计的试剂盒不仅可用于食管癌的早期筛查和淋巴结转移的判断，同时可用于指导食管癌患者术前新辅助化疗，具有重要的临床意义及推广价值。

附图说明

图1为血浆外泌体的透射电镜照片。

图2为Western Blot方法检测血浆外泌体标志物TSG101、CD63的表达图。

图3为miR-10527-5p在健康志愿者(Normal)与早期食管癌患者(ESCC)血浆外泌体中的表达水平图。

图4为血浆外泌体miR-10527-5p对早期食管癌诊断的ROC分析曲线图。

图5为miR-10527-5p在有(LNM)、无(NLNM)淋巴结转移的食管癌患者术前血浆外泌体中的表达水平图。

图6为血浆外泌体miR-10527-5p对预测食管癌患者有无淋巴结转移的ROC分析曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验步骤，若无特殊说明，均为本领域常规操作；实施例中的室温具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。

实施例1：筛选食管癌患者血浆外泌体microRNA标志物

1、血浆收集

(1)于手术前采集食管癌患者外周血约10mL，置于含EDTA抗凝剂的真空采血管中上下颠倒混匀；

(2)于1900g、4℃离心10min后收集上清；

(3)于3000g、4℃再次离心15min后小心吸取上清，得血浆，进行下一步操作，或保存至冻存管，液氮速冻后储存于-80℃冰箱备用。

2、血浆外泌体提取

(1)采用SBI公司的Exoquick试剂盒分离上述收集到的血浆中的外泌体，取500μL血浆，加入5μL凝血酶，轻弹底部混匀，室温孵育5min；

(2)10000rpm，离心5min后，将上清转移至EP管中，加入63μL Exoquick试剂，上下颠倒混匀后于4℃孵育30min；

(3)1500g，离心30min，底部白色沉淀即为外泌体，弃上清；

(4)1500g，离心5min后再次弃上清，加入PBS重悬，进行下一步操作，或-80℃冰箱保存。

3、外泌体鉴定

(1)透射电镜观察外泌体的形态及大小：将上述外泌体重悬液滴于孔径2nm的载样铜网上，室温静置1-2min，用滤纸小心从侧面吸干液体，滴加30μL的20g/L的磷钨酸室温复染5min，用滤纸小心从侧面吸干复染液，双蒸馏水洗涤铜网5次，室温晾干，透射电镜观察外泌体形态及大小并拍照，见图1，图中外泌体呈囊泡结构，标尺为100nm。

(2)Western blot方法检测外泌体标志物TSG101、CD63的表达：加入50μLRIPA裂解液重悬外泌体沉淀，冰上裂解30min，每5min震荡一次；采用BCA法测定外泌体蛋白浓度。配置10％SDS-PAGE分离胶，每孔上样量为50μg总蛋白。湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温封闭1h后TBST洗3次，加入TSG101(Abcam，1:1000)，CD63(Abcam，USA1:1000)一抗，4℃孵育过夜；TBST洗3次，加入相应的HRP标记的2抗(1:5000)，室温孵育1h，增强化学发光法显影(ECL)。结果如图2所示，所提取的食管癌患者血浆外泌体中均可见CD63及TSG101表达。

4、血浆外泌体miRNA测序

基于术后病理进行TNM分期，送检有、无淋巴结转移食管癌患者血浆外泌体各10例，由北京诺禾致源公司进行血浆外泌体测序；

(1)由测序公司负责血浆外泌体的质控，经检测，分别有5例有淋巴结转移、5例无淋巴结转移的食管癌患者血浆外泌体≥20ng，质控合格，可用于建库；

(2)构建外泌体miRNA测序文库，基于Illumina Hiseq2500测序平台进行测序；

(3)测序完成，进行生物信息学分析；

(4)测序结果表明，miR-10527-5p在有淋巴结转移的食管癌患者血浆外泌体中的表达水平较无淋巴结转移的患者明显下调，差异具有统计学意义。

实施例2：利用miR-10527-5p的检测试剂检测食管癌的方法

1、血浆外泌体提取：采用Exoquick试剂盒分离提取血浆中的外泌体

(1)取500μL血浆，加入5μL凝血酶，轻弹底部混匀，室温孵育5min；

(2)于10000rpm，离心5min后，将上清转移至EP管中，加入63μL Exoquick试剂，上下颠倒混匀后于4℃孵育30min；

(3)于1500g，离心30min，底部可见白色沉淀即为外泌体，弃上清；

(4)于1500g，离心5min后弃上清，加入1mL Buffer MZ重悬，进行下一步操作，或-80℃冰箱保存。

2、血浆外泌体总RNA提取：采用TIANGEN公司的RNA提取试剂盒提取血浆外泌体中总RNA

(1)将含有1mLBuffer MZ的外泌体样本震荡混匀30sec，室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；

(2)室温12000rpm离心10min，取上清，转入新的RNase-Free的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈震荡15sec后，室温放置5min；

(3)室温12000rpm离心15min，样品分为3层：分别为黄色的有机相，中间相和无色的水相，RNA主要在水相中，小心将水相转移至新管中；

(4)量取转移液的体积，缓慢加入1.5倍转移液体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRspin中，室温12000rpm离心30sec，弃废液，保留吸附柱；

(5)向miRspin柱中加入500μL去蛋白MRD，室温静置2min，室温12000rpm离心30sec，弃废液；

(6)向miRspin柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，室温12000rpm离心30sec，弃废液；重复漂洗一遍；

(7)将miRspin柱放入2mL收集管中，室温12000rpm，离心1min，弃废液，将miRspin柱置于超净台通风片刻，以充分晾干；

(8)将miRspin柱放入新的RNase-Free 1.5mLEP管中，加入30μL DEPC水，室温放置2min以充分溶解，室温12000rpm离心2min；

(9)使用“Nanodrop”机器测定RNA浓度，打开取样臂，吸取1.5μLDEPC水清洗并用无尘纸擦干测量基座，吸取1.5μLDEPC水作为空白样品调零，吸取1.5μL待测样品测定样品RNA浓度，单位为ng/μL；浓度测定后进行下一步操作，或冻存于-80℃冰箱备用。

3、逆转录获得cDNA：取100ng总RNA、10μL 2×miRNA RT Reaction Buffer、2μLmiRNA RT Enzyme mix，DEPC水补齐至20μL，震荡混匀并离心，42℃孵育1h，95℃孵育5min，逆转录获得cDNA，合成的cDNA直接用于荧光定量PCR检测或储存于-20℃备用。

上述逆转录是采用加尾法获得用于qPCR的cDNA，2×miRNA RT Reaction Buffer和miRNA RT Enzyme mix来自miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211，天根生化科技有限公司)。

4、实时荧光定量PCR：

根据miR-10527-5p的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)设计qPCR引物，其中：

miR-10527-5p的正向引物的序列为：5'-AAAGCAAATGTTGGGTGAACGGC-3'(SEQ IDNO.2)，

miR-10527-5p的反向引物为通用引物，购自天根生化科技有限公司；

以U6基因作为内参基因进行qPCR，其中：

U6基因的核苷酸序列为：5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTT-3'；

U6基因的正向引物的序列为：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'(SEQ ID NO.3)，

U6基因的反向引物为通用引物，购自天根生化科技有限公司；

miR-10527-5p和U6基因qPCR的具体反应体系见表1，反应条件见表2。

实时荧光定量PCR中使用的2×miRcute Plus miRNA Premix(SYBR&ROX)和通用引物来自miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(FP411，天根生化科技有限公司)

表1.qPCR的反应体系

表2.qPCR的反应条件

5、统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析，绘制散点图，并采用独立样本的t检验进行统计学分析。同时，通过构建受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristics,ROC曲线)来评价敏感性、特异性。P＜0.05时，认为结果在统计学上有显著性差异。

实施例3：miR-10527-5p的检测试剂在食管癌检测中的应用

1、纳入对象：纳入山东大学第二医院于2019年8月至2020年6月收治的食管癌患者60名作为实验组，根据术后病理进行TNM分期，其中30例为早期无淋巴结转移的食管癌患者(T1N0M0)，30例为伴有淋巴结转移的食管癌患者；健康志愿者30名作为对照组。所纳入的食管癌患者术前均未接受新辅助放化疗。

2、血浆收集：于手术前及术后7天分别采集食管癌患者外周血2-3mL，置于含EDTA抗凝剂的真空采血管中上下颠倒混匀，于1900g、4℃离心10min后收集上清，于3000g、4℃再次离心15min后小心吸取上清，得血浆，按照实施例2的方法进行血浆外泌体中miR-10527-5p的检测。

3、血浆外泌体miR-10527-5p在健康志愿者与早期食管癌患者中的表达水平差异

应用所述miR-10527-5p的检测试剂按照实施例2的方法对健康志愿者和早期食管癌患者术前的血浆外泌体的miR-10527-5p水平进行定量检测，以确定血浆外泌体miR-10527-5p在健康志愿者与早期食管癌患者中的表达水平差异，并判断血浆外泌体miR-10527-5p能否作为食管癌早期诊断的标志物。

使用GraphPad Prism 8.0.2软件对检测结果进行统计学分析，ΔCT＝CT

同时，通过构建受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics,ROC曲线)来评价血浆外泌体miR-10527-5p用于早期食管癌诊断的敏感性、特异性。结果如图4所示，ROC曲线分析显示，AUC为0.874，灵敏度为83.08％，特异性为76.67％。结果表明，血浆外泌体miR-10527-5p可作为食管癌早期诊断的标志物，基于所述血浆外泌体miR-10527-5p的检测试剂制备的检测试剂盒对食管癌早期诊断具有较高的灵敏度及特异性，可用于食管癌早期诊断。

4、血浆外泌体miR-10527-5p在有、无淋巴结转移食管癌患者中的表达水平差异

应用所述miR-10527-5p的检测试剂按照实施例2的方法对有、无淋巴结转移食管癌患者术前的血浆外泌体miR-10527-5p水平进行定量检测，以确定血浆外泌体miR-10527-5p在有、无淋巴结转移食管癌患者中的表达水平差异，并判断血浆外泌体miR-10527-5p能否作为预测食管癌患者淋巴结转移的标志物。

使用GraphPad Prism 8.0.2软件对检测结果进行统计学分析，ΔCT＝CT

同时，通过构建受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics,ROC曲线)来评价血浆外泌体miR-10527-5p用于预警淋巴结转移的敏感性、特异性。结果如图6所示，ROC曲线分析显示，AUC为0.787，灵敏度为70.08％，特异性为81.00％。实验结果表明，血浆外泌体miR-10527-5p可作为预测食管癌患者淋巴结转移的标志物，基于所述血浆外泌体miR-10527-5p的检测试剂制备的检测试剂盒对食管癌淋巴结转移的预测具有较高的灵敏度及特异性，可用于预警食管癌患者有无淋巴结转移。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> miR-10527-5p的检测试剂在制备食管癌检测试剂盒中的应用及检测试剂盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aaagcaaaug uugggugaac ggc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaagcaaatg ttgggtgaac ggc 23

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcgcttcgg cagcaca 17