陆地棉GhWRKY74蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种陆地棉GhWRKY74蛋白及其编码基因与应用。该基因的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明通过从感黄萎病棉花品种86‑1叶片中克隆获得与感黄萎病相关基因GhWRKY74基因，通过RT‑PCR证实了该基因在黄萎病菌胁迫下根、茎、叶中协同性表达，通过VIGS沉默该基因的表达，证实了可以提高感黄萎病陆地棉品种的抗大丽轮枝菌的能力，从而提高了陆地棉抗黄萎病的性能，为遗传改良感黄萎病陆地棉品种提供理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种陆地棉GhWRKY74蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

棉花是世界上重要的纤维作物和油料作物，在中国31个省份中就有24个省种植棉花，其中有近3亿人参与其生产，30％的总播种面积用于棉花种植。其中，黄萎病(Verticillium wilt)在生产上对棉花产量和纤维品质危害严重，由于黄萎病菌危害棉花的维管束，导致化学药剂很难防治，现如今最有效的防治途径是培育和种植抗病品种。在过去的研究中，陆地棉抗黄萎病的相关基因研究进展缓慢，且抗黄萎病的主效基因还未见报道。由于黄萎病菌的易变性，导致过去培育的抗病品种抗病性丧失，不能持久，美国、澳大利亚等国家先后培育出Acala、Sicala 1等一系列抗病品种，但这些品种在我国只能达到耐病水平，Kawchuk从番茄中已经克隆出了抗黄萎病基因Ve，但发现其只能介导对大丽轮枝菌1号小种的抗性，其抗性具有特异性。目前，大多数研究都致力于发掘抗病基因，而忽视了对感病基因(susceptibility gene,S gene)的研究。实际上，植物抗病性和感病性是一个对立面，而突变的感病基因也同样可以获得抗性。

S基因的定义是指在植物中能够促进病原侵染和有利于亲和互作的基因。当S基因发生突变时，植物不再支持病原物亲和互作，从而获得特异性抗性。根据植物-病原体相互作用过程的不同阶段，植物S基因按可分为如下几种类型：(1)允许寄主-病原物互作的基因，促进病原物识别与侵染；(2)编码免疫信号负调节的基因；(3)侵染后，满足病原物代谢或者结构需求，并增殖的基因。

WRKY转录因子(WRKY transcription factors)是一种植物特异性转录因子，在其C末端既含有锌指结构，又含有高度保守的WRKY结构域，以根据WRKY结构域的数量和锌指结构的特征对WRKY蛋白进行分类，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组。其中，Ⅰ组为C2H2型(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)，Ⅱ组与Ⅰ组相同，Ⅲ组为C2HC型(C-X7-C-X23-H-X1-C)。在过去的研究中都发现WRKY转录因子是一个庞大的家族，在水稻中鉴定出102个WRKY基因，它具有防御信号转递以及防止病菌入侵的作用。WRKY转录因子在寄主防御上可正向和负向调节，过去的绝大多数研究都集中于WRK基因参与的正向抗病反应，Wang等发现在拟南芥中AtWRKY53和AtWRKY70正向调节系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)；Deslandes等发现AtWRKY52包括核苷酸结合-富含Leu的重复类型R基因产物的结构特征和WRKY结构域，该结构域对青枯病(Ralstonia solanacearum)具有广泛的抗性；Yang等发现WRKY 1、WRKY 3和WRKY 5等11个WRKY基因在马铃薯对晚疫病菌侵染的抵抗反应中具有积极的调节作用；但是在二十一世纪以来，许多研究者开始转向WRKY-TF对病原菌侵染的负调节作用，Grunewald等发现WRKY23转录因子在线虫摄食位点建立的早期阶段表达，敲除WRKY23可降低胞囊线虫(Heterodera schachtii)的侵入；水稻OsWRKY76和OsWRKY45-1基因过表达植物表现出更高的敏感性，OsWRKY45-1的敲除植物表现出对水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae)的增强抗性；胡椒的CaWRKY58基因，定位于细胞核，感染青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的辣椒植株中,过度表达CaWRKY58的烟草植株，表现出比野生型植物更严重的病害症状。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)沉默的CaWRKY58辣椒植株对强毒青枯病菌菌株FJC100301表现出增强的抗性，表明CaWRKY58在辣椒对青枯病菌侵染的抗性中充当负调节因子的转录激活剂。最近的一项研究表明，陆地棉中的一个Ⅲ族WRKY转录因子GhWRKY70至少通过两种方式负调控大丽轮枝菌的侵染。而如何筛选更多的能够差异表达WRKY转录因子，以为培育抗棉花黄萎病品种提供候选基因，以及为改善现有棉花抗黄萎病不佳的状况具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种陆地棉GhWRKY74蛋白及其编码基因与应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过VIGS证实了其在抗黄萎病中的具有重要作用，在高感黄萎病品种的根、茎、叶中协同性表达，依据抗黄萎病性评价证实其具有降低黄萎病性的能力，沉默则可以提高优质高产感病棉花品种的抗黄萎病性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74，该基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

优选的是，用于克隆所述GhWRKY74的引物如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：13所示。

本发明还提供一种由所述的陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，该蛋白质还包括如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有提高陆地棉抗黄萎病抗性的蛋白突变序列。

本发明还提供根据所述的一种陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74在抗黄萎病中应用，通过VIGS沉默GhWRKY74基因下调该基因表达，提高感黄萎病陆地棉品种的抗黄萎病抗性。

本发明还提供根据所述的一种由所述的陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74编码的蛋白质在抗黄萎病中应用，通过VIGS沉默GhWRKY74基因下调该基因表达，提高感黄萎病陆地棉品种的抗黄萎病抗性。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了一种陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74，该基因是根据陆地棉转录组测序结果，筛选得到的一个差异表达的GhWRKY74基因，其表达模式为下调表达，通过对该基因的克隆分析以及应用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对该基因进行功能验证，证实了该基因在陆地棉中抗黄萎病的作用，因此，该基因可为培育棉花等农作物抗黄萎病品种提供候选基因。

本发明还提供了一种陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74编码的蛋白质，通过从棉花叶片中克隆获得与陆地棉抗黄萎病相关的GhWRKY74基因，通过提取棉花感病品种根、茎、叶不同组织的RNA，通过RT-PCR证实了其在感黄萎病棉花品种根、茎、叶中均有表达，且在茎中的相对表达量是叶中的2.8倍、是根中的7.6倍。依据抗黄萎病性评价，证实其具有降低黄萎病性的能力，沉默则可以提高优质高产感病棉花品种的抗黄萎病抗性。这为经陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74应用到陆地棉和其他农作物的遗传育种当中提供了科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例4中不同处理的陆地棉抗病性差异比较图；通过病毒诱导的基因沉默来分析该基因的功能，棉花皱缩病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB由中国农业科学院植物保护研究所周雪平教授馈赠，WT和WT+V991分别为接菌前和接菌后的野生型感黄萎病陆地棉品种中植棉86-1；pCLCrV(A+B)和pCLCrV(A+B)+V991分别为接菌前和接菌后转入空载体的感黄萎病陆地棉品种中植棉86-1；pCLCrVA-GhWRKY74-pCLCrVB和pCLCrVA-GhWRKY74-pCLCrVB+V991分别为接菌前和接菌后沉默GhWRKY74基因的感黄萎病陆地棉品种中植棉86-1；

图2为GhWRKY74蛋白的生物信息分析结果；A为GhWRKY74蛋白的氨基酸组成；B为GhWRKY74与不同物种的WRKY74的系统发育树；

图3为GhWRKY74与拟南芥WRKY转录因子的氨基酸比对和系统发育分析；A为拟南芥Ⅱd类WRKY TFs与GhWRKY74的氨基酸序列比对；B为GhWRKY74与拟南芥WRKY TFs的系统发育分析；

图4为qRT-PCR技术检测目的基因的表达量；pCLCrV(A+B)为含空载体的棉株；pCLCrVA-GhWRKY74-pCLCrVB为含沉默GhWRKY74基因的载体的棉株；

图5为RT-PCR验证感黄萎病棉花品种根、茎、叶中的相对表达量；

图6为基因GhWRKY74的cDNA序列全长的电泳检测图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1克隆陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74

克隆陆地棉感黄萎病相关基因GhWRKY74包括以下步骤：

1.RNA的提取

使用RNAprep Pure植物多酚多糖总RNA提取试剂盒分别提取棉花品种86-1叶片样品RNA。

2.cDNA的合成

2.1中间片段cDNA的合成

中间片段cDNA的合成使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录cDNA。

2.2 3’端的cDNA的合成

3’端的cDNA的合成体系如下表1所示：

表1

按上述体系混匀，离心后，置PCR仪上42℃60min，70℃15min，反应结束后冰上冷却，置于-20℃保存。

2.3 5’端的cDNA的合成

5’RACE的cDNA的合成体系如下：

第一步：加入表2所示试剂

表2

混匀，短暂离心后置于冰上。

第二步：加入表3所示试剂

表3

充分混匀后，将这11μL产物放置在PCR仪中，设置反应的程序：72℃3min,42℃2min。结束后，冷却1min后备用。

第三步：加入表4所示试剂

表4

混匀，短暂离心。

第四步：加入表5所示试剂

表5

用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心。置于PCR仪中，设置程序：42℃90min,70℃10min。用适量Tricine-EDTA Buffer稀释反应所得cDNA后，-20℃保存。

3.引物设计

RACE引物(表6)均由primer 5.0设计而成，GSP、UPM引物试剂盒自带，设计的引物送往生工合成。

表6 RACE引物

4.GhWRKY74全长克隆

4.1目的基因中间片段克隆

根据已知的cDNA片段，设计中间片段引物，按照下述体系(表7)混匀进行PCR扩增。

表7

PCR程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。

4.2目的基因3’末端克隆

3’RACE采用巢式PCR法扩增，

3’RACE的第一轮PCR扩增体系(表8)：

表8

按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s,72℃2min,20个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物。之后把第一轮PCR扩增产物稀释50倍，进行第二轮PCR扩增。

3’RACE的第二轮PCR扩增体系(表9)：

表9

按上述体系混匀，短暂离心后，进行PCR扩增。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.3目的基因5’末端克隆

用适量Tricine-EDTA Buffer稀释反应所得5’RACE cDNA后，进性5’RACE的PCR扩增，PCR体系如下：

step 1:加入表10所示试剂

表10

轻轻混匀，短暂离心后，置于冰上。

step 2:加入表11所示试剂

表11

按照上述程序配好体系后，轻轻混匀，短暂离心，按照以下程序进行PCR的扩增。

PCR程序(见表12)：

表12

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，观察条带情况，若出现弥散条带或者无条带，进行以下操作：

(1)本次模板为此前PCR扩增产物50倍稀释产物(Tricine-EDTA buffer)

(2)引物采用UPMS和5’IGhWRKY74,各1μL，采用上述中的PCR体系，并设置反应程序为：94℃3s，65℃30s,72℃1min，20个循环；4℃保存。

反应结束后，进行凝胶琼脂糖电泳分析，之后胶回收、连接和转化，挑取阳性克隆送生工测序。

4.4GhWRKY74全长克隆

将中间片段、3’RACE片段和5’RACE片段通过DNAman拼接，设计GhWRKY74全长引物qGhWRKY74-F、qGhWRKY74-R(表6)，进行全长PCR扩增。选取5’合成的cDNA，用Tricine-EDTABuffer稀释5倍作为模板。

反应体系如表13所示：

表13

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。琼脂凝胶电泳分析扩增产物，进行胶回收，加A尾，体系如下表14所示：

表14

反应条件：72℃30min。

将全长PCR反应液连接到T1 simple载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送生工测序。

经鉴定，结果如图6所示：基因GhWRKY74的cDNA序列全长为1786bp，5’端UTR(非翻译区)291bp，3’端UTR区514bp，开放阅读框(ORF)995bp，共编码326aa，序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2GhWRKY74蛋白的生物信息分析

通过在线工具ProtParam的预测，蛋白的分子量为36.82626kDa，等电点为9.80，分子式C

应用SignalP 4.0预测该蛋白无信号肽；TMHMM Server v.2.0预测该蛋白无跨膜螺旋区；CDD预测蛋白具有锌指结构域和WRKY结构域。

通过多序列比对及应用MEGA软件，采用BoostStrap设为1000构建GhWRKY74的系统发育树(如图2B所示)，表明GhWRKY74与木本棉(Gossypium arboreum)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)蛋白相似度最高，亲缘关系最近；与可可(Theobroma cacao)、哥伦比亚锦葵(Herrania umbratica)、榴莲(Durio zibethinus)构成了进化树的一支。

用MEGA5.0中的最大似然法构建了系统发育树。通过构建GhWRKY74与拟南芥WRKY家族成员的系统发育树(如图3所示)，表明GhWRKY74属于Ⅱd组WRKY成员,含有一个WRKY结构域和C2H2模式(CX(4-5)CX(22-23)HXH)的锌指结构，有一个核定位信号KRRK。

实施例3 GhWRKY74在棉花感病品种86-1不同组织中的表达量分析

3.1实验方法：

待陆地棉86-1培养至2片真叶展开时，分别取棉花根部、茎部和叶部，充分清洗和表面消毒，液氮冷冻处理后保存于-80℃超低温冰箱中。

使用RNAprep Pure植物多酚多糖总RNA提取试剂盒分别提取各个不同棉花组织样品RNA,使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录cDNA，反转录后测定GhWRKY74基因在不同组织中的表达量。(试剂盒均购于北京天根)

3.2实验结果：

通过提取棉花感病品种根、茎、叶不同组织的RNA，通过RT-PCR证实了其在感黄萎病棉花品种根、茎、叶中均有表达，且在茎中的相对表达量是叶中的2.8倍、是根中的7.6倍(如图5所示)

实施例4大丽轮枝菌胁迫下沉默感黄萎病陆地棉品种86-1，其黄萎病抗病性状态

4.1实验方法：

根据引物VIGS-GhWRKY74-F、VIGS-GhWRKY74-R(表16)克隆目的基因，反应体系如下表15所示：

表15

PCR程序：94℃3min；94℃30s，55.8℃30s，72℃1min,35个循环；72℃10min；4℃保存。

表16 VIGS引物

琼脂凝胶电泳分析扩增产物并回收目的片段，与VIGS沉默载体pCLCrVA载体同时用SpeⅠ和PacⅠ双酶切，回收之后用T4连接酶连接并转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切验证后，将鉴定正确的GhWRKY74沉默载体转化农杆菌EHA105，经菌落PCR鉴定后，转化成功的农杆菌菌液加入甘油在-80℃条件下保存。

棉花种植：将上述棉种用浓硫酸脱绒处理后，均挑选饱满大小一致的种子进行后续试验，用70％乙醇浸泡种子5min进行表面灭菌，而后用3％的过氧化氢浸泡种子2h，最后用无菌水冲洗干净。灭菌完的种子(每盆8粒种子，子叶长出后定苗，每盆留苗3株)点种于花盆中(营养土：蛭石＝2:1)，放置于温度24℃，16h光照，8h黑暗，相对湿度为70％的温室生长。

待棉花感病品种陆地棉86-1的棉苗子叶展开时，取含有VIGS沉默载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期,6000×g离心5min，收集菌体，再用乙酰丁香酮溶液(10mmoL/L2-吗啉乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES),200μmoL/L乙酰丁香酮(acetosyringone，As),10mmol/L MgCl

采用蘸根法接种大丽轮枝菌V991(孢子浓度10

4.2实验结果

通过qRT-PCR技术检测目的基因的表达量，结果所示(如图4所示)，与接种空载体pCLCrV(A+B)的棉株相比，沉默GhWRKY74植株的目的基因的表达量显著降低(p<0.05),沉默效率约为53％，表明VIGS技术成功沉默了该基因。

在含营养土蛭石培养花盆中生长的野生型和转基因植株根系均能良好生长。在棉花苗生长20天后，用落叶型强致病力病菌V991孢子悬浮液(浓度10

结果表明：沉默GhWRKY74基因可以显著提高植株抗病性，从而增强其黄萎病抗性(如图1所示)。

发病率和病情指数见表17，把感病品种中植棉86-1的GhWRKY74沉默，黄萎病病情指数仅仅54.6±1.5，极显著低于空载的病情指数94.1±2.1和野生型的病情指数92.3±3.2。表1中大写字母代表1％水平的显著差异。

表17不同处理的感黄萎病陆地棉品种中植棉86-1黄萎病病情指数比较

可见，将基因GhWRKY74采用VIGS沉默后，在黄萎病菌胁迫下，感黄萎病品种的抗病性提高了；而野生型感黄萎病品种和转空载体的感黄萎病棉花品种在黄萎病菌胁迫下，仍然高度感病。证实了GhWRKY74基因具有降低黄萎病性的能力，沉默GhWRKY74基因则可以提高感病棉花品种的抗黄萎病的抗性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 陆地棉GhWRKY74蛋白及其编码基因与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagtttttg tttgtttgtt tgtttttatt tcatacccag ttttttttta tccctctttt 60

ttgtcaatga aaacggccaa tatttcgtat gtgttgtttt taatttcaat cttgtttact 120

tttgcttcaa aagttttcag ttttgagaaa tgcccaattt ccaaggcttg gtcttggttc 180

accttttggt gtttaatcat ttaaaatctg acatcatttg aaacatatga aacgttttgc 240

tactttggtt tttaaggtgt ttttaggaat ctgggtttga tttgtttttt gatgttttta 300

agtatggaga aggttgaaga agcaaacaag gcagctattg agagttgtaa tagagttctt 360

agtcttttgt ctttaccaaa ggatcaactt cagtacagca acttaatgat gaaaactagt 420

gaagctgtgt ttaagttcaa aaaagttgtg tctcttctca acaatgattt gagtcattca 480

agggtaagaa aatccaagat gtttagatca agttcgcctc aaaatatttt cctagaaagt 540

cccaattgta gaacaatttt atctccaaaa cctcttcaag tatacccttc taacctgttc 600

caaaaaccac cccttgaagt taaaccatca caagatttca gctttgttca tcttcagcag 660

cagcagcaac agatgcagca aaggctgcaa tttcaacaac aacaacaaca aatgaaatat 720

catgcagata tggtgtttgg taagagtaac agtggtataa accttaaatt tgatggatct 780

agttgcacac caaccatgtc atcagctgga tcatttgtgt catctttgag cctggatggt 840

agtgttgcaa acttggatgg gaattccttc catttaattg gcatgccaca ccattttggt 900

catatctctc aacattcaag aaagaggtgt tcaggtaaag gacaagatgg tagtatgaaa 960

tgcggtacct ctggtaaatg ccattgttca aagaggagga aactcaggat caaaaggtct 1020

attaaagtgc ctgctattag taacaaagtt gctgatattc ctcctgatga atattcatgg 1080

aggaaatatg gccaaaagcc aattaaaggt tctccacacc ctaggggata ctataagtgt 1140

agcagtgtga gagggtgccc agcaaggaag catgttgaga gatgtttgga agacccttcg 1200

atgttgatcg tcacgtacga aggcgagcat aaccattcaa ggttactctc aacacaccct 1260

gcgcatacat gaaaatgcct tctttcatct tcaaaaaaac caaaccttcc tgttgttaaa 1320

atccgtaaaa acaaaagccg gtttgcttct taaatgtgaa atagatagct attgtacatt 1380

gttgatccgt tgcatcgaca atggagccgt atttgagaat ctgtattggc ccttagtgaa 1440

aacaccgtcc atactatgag taggggaagt ggggttagtg tgcatcaaca tacctaatat 1500

ggggtttcaa actaaattta agctggtaga ttaacattgt tcttatatat atatatataa 1560

agagagagag agagaatagg aattgtgaac ttttttgaac tttgaatttg tgtaacccta 1620

tgtttcatct taatgttttt ggatttgtaa ggttgattgt atgtatgatt tgtggtgaca 1680

ttgtagaagg aaaactacaa aggttatcca aaatcatgta acatgaaatt cagcagtgcc 1740

aaaagaacta tgctgctatg aattgatttc ctaattttct taagtt 1786

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Leu Ser Met Glu Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Ala Ala Ile

1 5 10 15

Glu Ser Cys Asn Arg Val Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Lys Asp Gln

20 25 30

Leu Gln Tyr Ser Asn Leu Met Met Lys Thr Ser Glu Ala Val Phe Lys

35 40 45

Phe Lys Lys Val Val Ser Leu Leu Asn Asn Asp Leu Ser His Ser Arg

50 55 60

Val Arg Lys Ser Lys Met Phe Arg Ser Ser Ser Pro Gln Asn Ile Phe

65 70 75 80

Leu Glu Ser Pro Asn Cys Arg Thr Ile Leu Ser Pro Lys Pro Leu Gln

85 90 95

Val Tyr Pro Ser Asn Leu Phe Gln Lys Pro Pro Leu Glu Val Lys Pro

100 105 110

Ser Gln Asp Phe Ser Phe Val His Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Met

115 120 125

Gln Gln Arg Leu Gln Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Met Lys Tyr His

130 135 140

Ala Asp Met Val Phe Gly Lys Ser Asn Ser Gly Ile Asn Leu Lys Phe

145 150 155 160

Asp Gly Ser Ser Cys Thr Pro Thr Met Ser Ser Ala Gly Ser Phe Val

165 170 175

Ser Ser Leu Ser Leu Asp Gly Ser Val Ala Asn Leu Asp Gly Asn Ser

180 185 190

Phe His Leu Ile Gly Met Pro His His Phe Gly His Ile Ser Gln His

195 200 205

Ser Arg Lys Arg Cys Ser Gly Lys Gly Gln Asp Gly Ser Met Lys Cys

210 215 220

Gly Thr Ser Gly Lys Cys His Cys Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Ile

225 230 235 240

Lys Arg Ser Ile Lys Val Pro Ala Ile Ser Asn Lys Val Ala Asp Ile

245 250 255

Pro Pro Asp Glu Tyr Ser Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys

260 265 270

Gly Ser Pro His Pro Arg Gly Tyr Tyr Lys Cys Ser Ser Val Arg Gly

275 280 285

Cys Pro Ala Arg Lys His Val Glu Arg Cys Leu Glu Asp Pro Ser Met

290 295 300

Leu Ile Val Thr Tyr Glu Gly Glu His Asn His Ser Arg Leu Leu Ser

305 310 315 320

Thr His Pro Ala His Thr

325

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtttttaa gtatggagaa ggttg 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcatgtatgc gcagggtg 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtttggga atatgcagat cgga 24

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgataatgcc cttatggagg atag 24

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gattacgcca agctttcaag gggtggtttt tggaacagg 39

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gattacgcca agctttgttt gcttcttcaa ccttctccat ac 42

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaagtttttg tttgtttgtt tgtttttatt 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacttaagaa aattaggaaa tcaattcata gc 32