一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用

摘要

本发明涉及一种定量测定血浆中PEGylated‑IL‑2(1A)的方法及应用，属于化学分析技术领域。本发明的方法包括标准品在血浆中配制、离心后取上清并且加入0.1%BAS后抽真空浓缩，再复溶后进行液相馏分收集RP‑HPLC实验操作。在紫外检测器出口处，分別收集样品。收集后的样品在37℃条件进行酶切3小时，然后加入0.1%甲酸终止反应进行LC‑MS/MS样品分析。该方法实现了高效、快速、准确、灵敏的使用LC‑MS‑MS定量测定体内PEGylated‑IL‑2(1A)。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用，属于化学分析技术领域。

背景技术

IL-2(Interleukin-2 )是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，促进Th0和CTL的增殖，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。在临床上主要用于肾癌、恶性黑色素瘤、结肠癌等。也可以与LAK、手术、放疗、化疗相结合用于小脑星形细胞瘤、舌癌、喉癌、鼻咽癌、肝癌、肺癌和胃癌手术转移的患者，以及癌性胸腹水等等。IL-2(1A)的检测和控制关系到药品的安全性和实效性，IL-2(1A)的不良反应与血浆分布时相半衰期为6～13分钟,β清除时相半衰期为30～120分钟。所以通过PEGylated对IL-2修饰来延长体内循环时间，降低免疫原性，提高稳定性，从而达到更好的效果，减少不良反应。目前，建立高效、快速、准确、灵敏的PEGylated-IL2浓度检测方法十分必要。

目前没有关于PEGylated-IL-2在血浆中检测方法的(LC-MS/MS)报道，使用LBA(ligand binding assay) 或者ELISA(酶联免疫吸附)测定PEG化生物药PK或者TK样品是常用方法，但是，用LC/MS/MS 测定PEG化生物药PK或者TK样品越来越广泛被应用到生物药研发中去。主要原因是LBA或者ELISA，这二种方法前者需要特殊试剂，有內源性干扰物质，后者方法建立时间长，受內源性抗体的干扰，非特异性结合与交叉免疫等等。而LC-MS/MS质谱与液相方法的建立、样品前处理与方法学论证，耗时较短。另外，使用同位素标记的肽段或者蛋白质作为内标，可以有效校正分析过程中的偏差和基质效应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法及应用，填补空白。

本发明通过以下技术方案解决技术问题： 本发明首先提出一种定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法，其特点是使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。

该方法中需先将血浆中PEGylated-IL-2(1A)样品经过样品前处理，再使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。其中，所述样品前处理包括蛋白沉淀、RP-HPLC收集样品、真空浓缩后酶切，使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)。所述蛋白沉淀步骤中加入甲酸水与异丙醇进行酸沉淀。

进一步地，上述方法中所述样品前处理，包含如下步骤，

第一步、样品蛋白沉淀，将已知浓度的样品/标准品加入甲酸水与异丙醇进行酸沉淀；

第二步、将浓缩至干的样品放置平衡至室温，将经过蛋白沉淀的样品/标准品浓缩、干燥制得样品/标准品的粗品；

第三步、 RP-HPLC进行样品收集，将样品/标准品的粗品加入100 μL 0.1%FA水溶液复溶、离心、取上清进行RP-HPLC检测收集；

第四步、酶切，将第三步收集的各样品，各取400 μL至0.5 mL螺口管中，每支样品管中加入1%BSA溶液3 μL，混合均匀后，瞬离，45℃，真空浓缩至干，加入酶，进行酶切作用。

样品前处理的所述第一步中，所述血浆样品由6 μl标准品工作液、6μl内标工作液和96 μl血浆配制而成，将标准品（含血浆样品）、30% FA、含0.1%FA的异丙醇溶液按体积比65:15:210的比例混合，将混合后的样品涡流震荡3 min后，4000 g离心15 min。所述第二步中取190 μL第一步中的上清液至0.5 mL螺口管中，加入11 μL 0.1%BSA溶液，涡流混匀后瞬离，放置于真空浓缩仪中，45℃，浓缩至干（大约需要2小时）。所述第三步中，将浓缩至干的样品放置平衡至室温，再加入100 μL 0.1%FA水溶液，涡流震荡使样品完全复溶，复溶后13000 g离心20 min后取上清进行RP-HPLC检测收集。在紫外检测器出口处进行样品收集，在3-7min处的样品峰IL-2(1A)的出峰位置，色谱条件为分析柱Imtakt（品牌）Intrada WP-RP（名称）3µm，2×150mm（规格）流动相： A为5%甲酸+5%乙腈+90%水；B为5%甲酸乙腈；R0为50%甲醇水；流速为0.5mL/min，柱温为50℃,进样体积为20μL，进样器温度为8℃，检测波长315nm，分析时间25min。所述第四步中，胰蛋白酶溶解的方法是，取一支胰蛋白酶，平衡至室温后，12000 g离心5 min清除容器壁上的粉末，按标示量100 μg/支加入100 μL的50 mMHAc溶解，使其浓度为1.0 mg/mL。5 μL/支分装，冻存与-80℃，使用有效期1年；0.25 mg/mL胰蛋白酶制备方法是，取10 μL 1.0 mg/mL胰蛋白酶，加入30 uL 50 mM HAc即得。向浓缩至干并平衡至室温的样品中加入50 μL 100 mM Tris，0.5M Urea，pH8.0溶液溶解样品，涡流震荡后，加入0.5 mg Trypsin酶即2 μL 0.25 mg/mL Trypsin酶，涡旋震荡混匀后瞬离，将样品放置在37℃条件下酶切作用5 h，酶切结束后加入1%甲酸终止反应（约0.52 μL），进样分析。

所述使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)中，色谱条件为分析柱3.5μm2.1*100mm 的Waters Symmetry300TMC18，流动相： A为0.1甲酸水；B为0.1%甲酸乙腈；R0为50%甲醇水；R1为NA；R2为NA；R3为NA，流速0.5mL/min，柱温NA℃，进样体积5 μL，进样器温度5℃，分析时间10min，t

所述使用LC-MS-MS定量测定PEGylated-IL-2(1A)中，质谱条件是正离子模式；离子对为化合物名称IL-2(1A)344.2→120.2；DP=48.45V；CE=23.32V；Dwell Time=100ms；化合物名称Il-2-(1A)-N15)347.4→121.1；DP=46.23V；CE=22.64V；Dwell ；源参数为离子源：ESI；GS1=50 psig；GS2=50 psig；CAD=7 psig；CUR =20 psig；TEM =500 ℃；IS=5500 V；EP=10 V；CXP=12 V。

基于上述方法，本发明进一步提供所述定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法在IL-2(1A)药物监测中的应用。

基于上述方法，本发明再进一步提供所述定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法在IL-2(1A)工艺开发中的应用。

基于上述方法，本发明更进一步提供所述定量测定血浆中PEGylated-IL-2(1A)的方法在IL-2(1A)生产的应用。

样品的制备在LC-MS/MS定量中占有相当重要的位置。为了获得良好的灵敏度与正确度，采取有效的样品制备是十分重要的。本发明为解决上述问题，提出了：包括标准品在血浆中配制、离心后取上清并且加入0.1% BAS后抽真空浓缩，再复溶后进行液相馏分收集RP-HPLC实验操作。在紫外检测器出口处，分別收集样品。收集后的样品在37℃条件进行酶切3小时，然后加入0.1%甲酸终止反应进行LC-MS/MS样品分析。本发明的有益效果体现在以下几点：

1）LBA方法是经典测定蛋白药物在血浆中浓度方法。但是，随着科技快速发展；用LC-MS/MS来测定蛋白药物在研发中越来越广泛运用。主要是LBA方法开法需要特殊试剂，而LC-MS/MS方法不需要，并且可以快速开发。

2）测定的方法中用了同位素内标以后(IS) ，与LBA方法相比较；提高灵敏度与正确度高，可以满足常规分析的需要。

3）比较LBA与 ELISA方法；LC-MS/MS方法通过样品的前处理；清除了抗体药物抗体(ADA) 干扰而产生测定浓度不正确性与假阳性。

4）适合PEG化修饰IL-2在大鼠血浆浓度测定。同时，方法微调整后也适用于其它种属基质: 食蟹猴或者人血浆。

5) 这个方法也适合其它PEG化修饰后蛋白药。

该方法实现了高效、快速、准确、灵敏的使用LC-MS-MS定量测定体内PEGylated-IL-2(1A)。

附图说明

图1为本发明IL-2(1A)在大鼠血浆中典型标准曲线图。

图2为本发明对照品IL-2(1A)在RP-HPLC典型液相图。

图3为本发明IL-2(1A)在RP-HPLC典型液相图。

图4为本发明内标IL-2(N15) (1A) 同位素标记典型质谱图。

图5为本发明大鼠血浆IL-2(1A)典型质谱图。

图6为本发明空白大鼠血浆IL-2(1A)的典型色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，具体数值为典型值，而非以任何方式限制本发明的范围。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程、方法和试剂是本领域中公知的常规方法和产品。

名词解释：

IL-2(1A): 除非特殊指明，本文中IL-2(1A) 是PEG-IL-2经过样品处理酶切后肽段，PEG-IL-2中 PEG 只是修饰了IL-2，本发明的方法不需要释放PEG，没有干拢，实施例中直接测定IL-2

Trypsin 酶：胰蛋白酶

FA: 甲酸

IPA: 异丙醇

NaOH: 氢氧化钠

BSA: Bovine Serum Albumin , 牛血清蛋白

Tris: 三(羟甲基) 氨基曱烷

Urea: 尿素

HAc: 醋酸

Ai：内标峰面积；

As：样品峰面积；

BQL：低于定量下限；

CAD：喷撞气

CUR：气帘气

CV：变异系数；

CXP：碰撞室射出电压

DP：去簇电压；

Dwell：离子驻留时间；

CE：碰撞能量；

EP：射入电压；

ESI：电喷雾离子化；

GS1：喷雾气；

GS2：辅助加热气；

IS：离子化电压；

LC-MS/MS （HPLC-MS/MS）：高效液相色谱-质谱联用；

LLOQ：Lower Limit of Quantification，定量下限；

ULOQ：定量上限；

ME：基质效应；

NA或N/A：不适用；

R2：决定系数；

RE/Bias：Relative Error，相对误差；

RSD (CV)：相对标准差，或变异系数；

SD/S.D.：标准差；

TEM：离子源加热温度。

实施例1

如图1-6所示，一种定量测定血浆中IL-2(1A)的方法，包括以下步骤：

S1：样品液相馏分收集前处理

浆样品配制（含内标）：6 μl标准品工作液+6 μl内标工作液+96 μl血浆

将标准品（含血浆样品）、30% FA、含0.1%FA的异丙醇溶液按表1比例混合；

表1

将混和后的样品涡流震荡3 min后，4000 g离心15 min，离心结束后，取180 μL上清至0.5 mL螺口管中，加入10 μL 0.1%BSA溶液，涡流混匀后瞬离，放至于真空浓缩仪中，45℃，浓缩至干（大约需要2h）。

将浓缩至干的样品放置平衡至室温后，加入100 μL 0.1%FA水溶液，涡流震荡使样品完全复溶，复溶后13000 g离心20 min后取上清进行RP-HPLC检测收集。

供试品及内标对照品液相馏分收集RP-HPLC实验操作

色谱条件

分析柱：Imtakt（品牌）Intrada WP-RP（名称）3µm，2×150mm（规格）

流动相： A：5%甲酸+5%乙腈+90%水；B：5%甲酸乙腈；R0：

表2

流速：

分析时间：

样品收集

在紫外检测器出口处进行样品收集， IL-2(1A)在3-7 min的出峰位置收集。

供试品及内标对照品酶切实验操作

胰蛋白酶溶解

取一支胰蛋白酶，平衡至室温后，10000 g离心3 min清除容器壁上的粉末，按标示量100 μg/支加入100 μL的50 mM HAc溶解，使其浓度为1.0 mg/mL。5 μL/支分装，冻存与-80℃，使用有效期：1年。

0.25 mg/mL胰蛋白酶制备：取10 μL 1.0 mg/mL胰蛋白酶，加入30 uL 50 mM HAc即得。

酶切

将收集的各个样品，各取400 μL至0.5 mL螺口管中，每支样品管中加入1%BSA溶液2 μL，混合均匀后，瞬离，45℃，真空浓缩至干（约2个小时）。

向浓缩至干并平衡至室温的样品中加入50 μL 100 mM Tris，0.5M Urea，pH8.0溶液溶解样品，涡流震荡后，加入0.5 mg Trypsin酶即2 μL 0.25 mg/mL Trypsin酶，涡旋震荡混匀后瞬离，将样品放置在37℃条件下酶切作用5 h，酶切结束后加入1%甲酸终止反应（约0.52 μL）进样分析。

PEG释放

NA

进样分析

色谱条件

分析柱：

流动相： A：

表3

流速：

分析时间：10min t

质谱参数

离子模式：■正离子模式；□负离子模式

离子对：

(化合物名称：

(化合物名称：

源参数：（离子源：■ESI；□APCI）

GS1=

IS=

制备工作液

标曲样品制备

1.空白基质处理

以血浆：30%甲酸水=6:1的比例制备血浆基质。

2．标曲质控制备

2.1工作液制备

工作液浓度（IL-2(1A)）:10 μg/mL

2.2血浆样品制备（标曲、质控）

表 4 IL-2(1A) 在大鼠血浆中标准曲线

表 5 IL-1(2A) 在大鼠血浆中质控

可以根据基质体积适当修改比例，保证最后样品能取出70 μL即可(提前算好所需制备基质体积)。

2.3内标工作液浓度选取（N15-1A）：1 μg/mL

2.4样品处理

70 μL血浆样品（标曲、质控、未知样品）+10μL2.3配置的内标工作液+200 μL含0.1%FA的异丙醇沉淀。

本实施例采用以下方法进行结果验证：

根据中国药典对本方法进行方法学验证，内容包括标准曲线、精密度和准确度、稳定性、提取回收率、基质效应，包括以下步骤：

1）精密度和准确度

标准曲线

以IL-2(1A)在大鼠血浆中理论浓度为横坐标IL-2(1A)与内标峰面积比值为纵坐标，以加权最小二乘法[权重系数（1/C

精密度和准确度（含灵敏度）

制备20.00、40.00、80.00和160.00ng/mL在大鼠血浆中质控样品，连续7天，每天一个分析批，计算准确度、批间、批内精密度。结果表明所述5个浓度的准确度均为86%～114%，其中LLOQ在80%～120%之间；精密度CV小于15%，其中LLOQ小于20%，如表6的IL-2(1A)的精密度和准确度表所示。

表6

2）稳定性

如表7的IL-2(1A)在大鼠血浆的稳定性所示。

表7

3) 定量下线 (LLOQ)

如表8 IL-2(1A)在定量下线20ng/mL (LLOQ) 大鼠血浆10个批次测定，

表8

4) 提取回收率

表9为IL-2(1A)的提取回收率，在20、和160ng/mL二个浓度考察提取回收率，结果表明IL-2(1A)的预消化(酶切)，酶切，post-digestion与Overall digestion efficiency提取如下：

表9

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。