技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一组用于预测2019冠状病毒病免疫检查点风暴的标志物及应用和试剂盒的制备方法。
背景技术
随着2019冠状病毒病(COVID-19)在全球持续蔓延，相关疫情已经演变成为一场全球性的公共卫生危机。除呼吸困难、低氧血症、急性呼吸窘迫和细胞因子释放综合征外，进行性淋巴细胞减少(尤其是T细胞)是重症COVID-19的一个显著临床特征。最近，一些研究发现，在重症COVID-19病例中，T细胞缺失与T细胞上几种抑制性检查点分子表达增加存在相关性。在各种慢性病毒感染和肿瘤患者中抑制性检查点分子被证明是调控T细胞衰竭的关键因素。最近的研究进一步表明，抑制检查点分子在急性病毒感染(如埃博拉病毒或汉坦病毒感染)的病理生理学中发挥着关键作用。抑制检查点的可溶性亚型可通过膜结合蛋白的裂解或mRNA的选择性剪切产生，并竞争性地调节其膜结合蛋白的功能。因此，开发出能够预测COVID-19的免疫失衡和区分患者严重程度的可溶性检查点分子标志物具有重要意义。
重症病人的血浆中，巨噬细胞、中性粒细胞趋化因子、促炎细胞因子和抗炎细胞因子比普通流感病人要高。病毒侵犯人体后，体内免疫细胞迅速、大量释放细胞因子，产生“自杀式”效应，全身的炎症反应加强，造成疾病重症化发展。同时重症病例体内病毒特异性的T细胞过度活化后耗竭，免疫应答水平下降，从而机体的抗病毒能力降低。然而，目前并没有预测患者的免疫检查点风暴发生的生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴标志物及其应用、试剂盒和试剂盒的制备方法。
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴标志物，所述标志物包括BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上。
根据本发明所述的生物标志物，其中作为优选地，所述2019冠状病毒病(COVID-19)包括2019新型冠状病毒肺炎以及2019新型冠状病毒导致的其他脏器损伤型疾病。
本发明还提供了上述技术方案所述的标志物在制备用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴标志物的试剂盒，所述试剂盒中包括：分别包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球，生物素分别标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体，链霉亲和素标记的藻红蛋白。
本申请对试剂盒中各组分含量不做特别限定，本领域技术人员可以根据检测的实际情况进行组分含量的配比调整。进一步，优选地，本申请试剂盒的各组分相同体系下的用量关系如下：
羧基微球：0.4×10
捕获抗体：BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体各30～70μg；
检测抗体：BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体各0.6～1.4mg；
生物素：0.6～1.4mg；
链霉亲和素标记的藻红蛋白：本申请不作特别限定，本领域常规市售产品或采用本领域常规方法制备得到均可，用量可以参照市售产品说明书或本领域常规方式添加，本申请在此不做特别限定。
优选的，所述BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体的克隆号分别为6F7、110416、LH1、7H8L17、C9B7W、J116、MIH1、F38-2E2、10F3、18、4B4、O323、14D3。
优选的，所述BTLA、GITR、HVEM、IDO、PD-L1、CD28、CD80、和CD152检测抗体的克隆号分别为MIH26、DT5D3、eBioHVEM-122、2E2.6、10F.9G2、37407、MEM-233、WKH 203，所述LAG-3、PD-1、TIM-3、4-1BB、CD27的检测抗体为多克隆抗体。
优选的，所述编码微球包括羧基微球。
优选的，所述生物素包括N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。
本发明还提供上述任一所述试剂盒的制备方法，所述制备包括以下步骤：
制备包被捕获抗体的编码微球：将所述BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体分别与对应的编码微球偶联，分别得到包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球；
制备生物素标记的检测抗体：分别在BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体上连接生物素，得到分别被生物素标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体。
有益效果：
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴的血清学生物标志物，所述生物标志物为BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上。实验表明，对“免疫检查点风暴”发生风险高的COVID-19重症或危重症患者，其血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度均显著高于“免疫检查点风暴”发生风险低的COVID-19轻度或中度和无症状患者。
利用本发明提供的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的生物标志物或者其制备得到的试剂盒进行2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴的预测，具有检测快速、准确、费用低等优点，应用前景广阔。
附图说明
图1-13依次为检测血清中生物标志物BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的标准曲线示意图；
图14分别为液相芯片试剂盒检测到COVID-19无症状、轻度或中度和重症或危重症三组患者入院时血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的浓度的差异图(重症或危重症组各细胞因子的浓度均显著高于轻度或中度组和无症状组)；
图15分别为BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152对应COVID-19患者免疫检查点风暴的有效性预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，每个细胞因子对应的曲线下面积(AUC)和95％置信区间(95％CI)见图示。
具体实施方式
本发明提供了一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴的血清学生物标志物，所述血清学生物标志物包括BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上。本发明经实验发现，患者血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度与免疫检查点风暴发生有关，单独使用患者血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度(阈值分别为：759.495pg/mL，15.265pg/mL，20.645pg/mL，79.540pg/mL，148.595pg/mL，42.465pg/mL，7.030pg/mL，999.280pg/mL，358.420pg/mL，158.780pg/mL，34.620pg/mL，470.330pg/mL，218.025pg/mL)，能预测免疫检查点风暴的风险程度。因此，基于以BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152为血清学生物标志物预测COVID-19免疫检查点风暴的效果具有准确率高、实施较为方便、成本较低的优点，具有广阔的应用前景。
本发明还提供了上述技术方案所述的血清学生物标志物在制备用于预测COVID-19免疫检查点风暴的试剂盒中的应用。在本发明中，所述应用包括以上述生物标志物为基础制备得到的任意具有特异性检测上述生物标志物功能的试剂盒。
本发明还提供了一种用于预测COVID-19免疫检查点风暴的试剂盒，所述试剂盒中包括：分别包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体的编码微球，生物素分别标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体，链霉亲和素标记的藻红蛋白。在本发明中，所述BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体的克隆号分别优选为本领域技术人员在现有技术中能够获得或都可用到的，例如：6F7、110416、LH1、7H8L17、C9B7W、J116、MIH1、F38-2E2、10F3、18、4B4、O323、14D3。所述优选BTLA、GITR、HVEM、IDO、、PD-L1、CD28、CD80、和CD152检测抗体的克隆号分别为MIH26、DT5D3、eBioHVEM-122、2E2.6、10F.9G2、37407、MEM-233、WKH 203，所述LAG-3、PD-1、TIM-3、4-1BB、CD27的检测抗体为多克隆抗体。在本发明中，所述编码微球优选为羧基微球。在本发明中，所述生物素优选为N-羧琥珀酰亚氨活化生物素。在本发明中，所述试剂盒先利用分别包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体的编码微球捕获待测样品中的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152，然后利用生物素分别标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体和链霉亲和素标记的藻红蛋白对捕获得到的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152分别进行定量。在本发明中，所述编码微球是指使用不同荧光比例的微球进行数据编码，利用荧光编码的微球共价交联特异性单克隆抗体，通过激光扫描荧光编码来识别单个微球。
本发明基于液相芯片技术，开发出可以对血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152生物标志物进行快速检测的试剂盒，即液相芯片试剂盒。该试剂盒具有无副作用、敏感度高、检测快速、重复性好等优点。该液相芯片试剂盒的制备方法简单可靠、稳定性好。
在本发明具体实施方式中，所述试剂盒的制备方法，优选包括如下步骤：
(1)将分别包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体与编码微球偶联，得到包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球；
(2)在BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体上分别连接生物素，得到生物素分别标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体；
所述步骤(1)和(2)之间不存在先后顺序的关系。
本发明将BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体与编码微球偶联，得到分别包被有BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的捕获抗体的编码微球。在本发明中，所述偶联的方法优选包括如下步骤：
a.取羧基微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液15～25s，使微球混合均匀；
b.取震荡后的羧基微球0.4×10
c.移走上清，加入dH
d.加入40～60mg/mL的N羟基硫代琥珀酰亚胺8～12μL，用漩涡振荡器轻轻地振荡；
e.加入40～60mg/mL的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺8～12μL，用漩涡振荡器轻轻振荡；
f.室温孵育15～25min，每隔8～12min用漩涡振荡器轻振，≥8000g离心1.5～3min，沉淀活化的羧基微球；
g.移走上清，加入40～60mmol/L，pH值4.8～5.2的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，漩涡振荡器振荡15～25s，重悬活化的羧基微球，≥8000g离心1.5～3min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2～3次，用40～60mmol/L，pH值4.8～5.2的MES洗涤2～3次，加入40～60mmol/L，pH值4.8～5.2的MES，用漩涡振荡器振荡15～25s，在混匀的微球中分别加入30～70μg的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体，用40～60mmol/L，pH值4.8～5.2的MES定容至400～600μL，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育1.5～3h，≥8000g离心1.5～3min，沉淀偶联好的微球；
h.移走上清，加入PBS-TBN 200～400μL，漩涡振荡器振荡25～35s；于室温置于摇床上孵育25～35min，≥8000g离心1.5～3min，沉淀偶联好的微球；
i.移走上清，加入PBS-TBN 0.8～1.2mL，漩涡振荡器振荡25～35s，≥8000g离心1.5～3min，沉淀偶联好的微球；重复该步骤l～2次，用PBS-TBN洗涤2～3次；
j.加入PBS-TBN 0.8～1.2mL，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体与微球的偶联体；
k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2～3×10
本发明在BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体上连接生物素，得到生物素分别标记BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152中的一种或两种以上的检测抗体。在本发明中，所述连接的方法优选包括如下步骤：
①分别将0.6～1.4mg的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体用0.08～0.12mol/L，pH值7.8～8.2的碳酸氢钠缓冲液稀释到0.6～1.4mg/mL，终体积为0.8～1.2mL；
②交互用0.08～0.12mol/L，pH值7.8～8.2的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析；
③用0.8～1.2mL二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素0.6～1.4mg；
④分别向0.8～1.2mL的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体溶液中加入0.8～1.2g/L的NHSB溶液100～150μL；在室温下持续搅拌，保温2～4h；
⑤加入0.8～1.2mol/L的NH
本发明对所述链霉亲和素标记的藻红蛋白的来源不作特别限定，本领域常规市售产品或采用本领域常规方法制备得到均可。
在本发明中，将所述标记物用于COVID-19免疫检查点风暴判断的方法，优选包括以下步骤：
(1)测量受试者的血清样品中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152标志物的含量；
(2)利用步骤(1)中的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的测量值，对COVID-19免疫检查点风暴的发生风险进行判断。
在本发明中，所述2019冠状病毒病(COVID-19)，包括2019新型冠状病毒肺炎以及2019新型冠状病毒导致的其他脏器损伤型疾病；在重症COVID-19病例中，T细胞缺失与T细胞上几种抑制性检查点分子表达增加存在相关性，本发明提供的方法能应用于2019冠状病毒病(COVID-19)患者。在COVID-19患者中，免疫检查点风暴风险高的患者，血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度显著高于风险低的患者；单独使用患者血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度(阈值分别为：759.495pg/mL，15.265pg/mL，20.645pg/mL，79.540pg/mL，148.595pg/mL，42.465pg/mL，7.030pg/mL，999.280pg/mL，358.420pg/mL，158.780pg/mL，34.620pg/mL，470.330pg/mL，218.025pg/mL)，能预测免疫检查点风暴的风险程度。在本发明中，所述基线浓度指用药前采集患者的血浆中的生物标志物的浓度。
下面结合实施例对本发明提供的一组用于预测2019冠状病毒病(COVID-19)免疫检查点风暴的血清学生物标志物及其应用和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用于BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152生物标志物检测的液相芯片试剂盒的制备。
1，试剂盒组成
(1)13-plex包被微球：含有分别包被了BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体的编码微球；
(2)13-plex生物素标记检测抗体：用生物素分别标记的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体；
(3)链亲和素藻红蛋白。
其中，捕获抗体BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的克隆号分别为6F7、110416、LH1、7H8L17、C9B7W、J116、MIH1、F38-2E2、10F3、18、4B4、O323、14D3；BTLA、GITR、HVEM、IDO、、PD-L1、CD28、CD80、和CD152检测抗体的克隆号分别为MIH26、DT5D3、eBioHVEM-122、2E2.6、10F.9G2、37407、MEM-233、WKH 203，所述LAG-3、PD-1、TIM-3、4-1BB、CD27的检测抗体为多克隆抗体。。
2，试剂盒的制备方法
包括以下步骤：
(1)相应捕获抗体包被相应微球
a.取羧基微球用漩涡振荡器振荡微球悬液20s，使微球混合均匀；
b.取羧基微球1.1×10
c.移走上清，加入dH
d.加入50mg/mL的N羟基硫代琥珀酰亚胺10μL，用漩涡振荡器轻轻地振荡；
e.加入50mg/mL的1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺10μL，用漩涡振荡器轻轻振荡；
f.室温孵育20min，每隔10min用漩涡振荡器轻振，≥8000g离心2min，沉淀活化的羧基微球；
g.移走上清，加入50mmol/L，pH值5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)，漩涡振荡器振荡20s，重悬活化的羧基微球，≥8000g离心2min，沉淀洗涤后的羧基微球；重复该步骤2次，用50mmol/L，pH值5.0的MES洗涤2次，加入50mmol/L，pH值5.0的MES，用漩涡振荡器振荡20s，在混匀的微球中分别加入55μg BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体，用50mmol/L，pH值5.0的MES定容至500μL，用漩涡振荡器混匀；于室温置于摇床上孵育2h，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；
h.移走上清，加入PBS-TBN 300μL，漩涡振荡器振荡30s；于室温置于摇床上孵育30min，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；
i.移走上清，加入PBS-TBN 1mL，漩涡振荡器振荡30s，≥8000g离心2min，沉淀偶联好的微球；重复该步骤l次，用PBS-TBN洗涤2次；
j.加入PBS-TBN 1mL，重悬偶联好且经过洗涤的微球，即得BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152捕获抗体与微球的偶联体；
k.用细胞计数器计数微球的数量，浓度为2.5×10
(2)相应检测抗体的生物素化
l.分别将1mg的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，终体积为1mL；
m.交互用0.1mol/L，pH值8.0的碳酸氢钠缓冲液对蛋白质充分透析；
n.用1mL二甲基亚砜溶解N-羟琥珀酰亚氨活化生物素1mg；
o.分别向1mL的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152检测抗体溶液中加入1g/L的NHSB溶液120μL；在室温下持续搅拌，保温2-4h；
p.加入1mol/L NH
实施例2
BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152液相芯片试剂盒在预测COVID-19免疫检查点风暴中的应用。
1，实验目的
证明BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的入院时基线浓度在发生免疫检查点风暴的COVID-19患者中高。
2，实验对象
1)在知情同意及满足纳入条件的前提下，选择入组病例，记录个人基本信息。COVID-19患者队列来自于首都医科大学附属北京地坛医院109例COVID患者，包括5例无症状患者、60例轻度或中度患者和44例重度或危重度患者。
2)抽取患者入院时未治疗前血浆，标本至于-80℃冰箱中保存。
3，试剂准备
采用实施例1中制备的试剂盒。
(1)Beads：将所需Beads(微球)超声30秒，涡旋1min，然后各取出60μL加入MixingBottle，剩余体积用Bead Diluent补足3mL，充分混匀，2～8℃贮存一个月。
(2)Quality Control：用250μL蒸馏水分别溶解对照1和2(即常规市售重组蛋白)，颠倒多次使其充分混匀，静止5-10min，然后分别移入两个试管中，-20℃贮存一个月。
(3)Standard：用250μL蒸馏水溶解Standard，颠倒多次使其充分混匀，静止5～10min，然后移入试管中，标记为Antigen standard vial。然后另取7个试管，分别标记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7。在S2，S3，S4，S5，S6，S7中分别加入150μL Assay缓冲液。将Antigenstandard vial管中液体转移200μL至S1中。将S1中液体取出50μL转移至S2中，轻柔吹打混合10次。将S2中液体取出50μL转移至S3中，轻柔吹打混合10次。将S3中液体取出50μL转移至S4中，轻柔吹打混合10次。将S4中液体取出50μL转移至S5中，轻柔吹打混合10次。将S5中液体取出50μL转移至S6中，轻柔吹打混合10次。将S6中液体取出50μL转移至S7中，轻柔吹打混合10次，-20℃贮存一个月。
(4)Wash Buffer：将10×WB放置室温，使其中盐分充分溶解，30mL WB+270mL蒸馏水将其配成1×(1倍)，4℃保存一个月。
(5)Serum Matrix：向SM中加入1ml蒸馏水使其充分溶解，静止10min，然后移入试管里，-20℃贮存一个月。
4，实验流程：
①向96孔板中每孔加入200μL Wash Buffer，室温摇十分钟润洗，然后直接倒掉，充分擦干。
②分别加入25μL；
@Serum Matrix到Background、Standard和Control；
@Assay Buffer到样品孔；
@Assay Buffer到Background；
@Standard和Control到各自位置；
@样品到对应样品孔；
@Beads到每个孔，4℃避光过夜振荡孵育。
③洗板机洗2遍。
④每孔加25μL检测抗体，室温避光摇1h。
⑤每孔加25μL SAPE，室温避光摇30min。
⑥洗板机洗2遍，最后每孔加150μL鞘液上机(Luminex系统)检测。
5，实验结果：
用液相芯片试剂盒来检测COVID-19无症状、轻度或中度和重度或危重症三组患者血清中的BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度。此13种血清生物标志物的浓度是根据机器读取的荧光值及对应的标准曲线计算得来，13种血清生物标志物的标准曲线见图1至图13及表1。各标准曲线中的截断值(Cut-Off)都是30％Bias(表示暂不显示)。表1中，Fit，表示符合度，Cut-off：30％Bias代表暂时不展示；LLOQ：代表最低值；ULOQ：代表最高值。
表1 13种血清生物标志物的标准曲线参数
实验结果表明，在COVID-19患者中，免疫检查点风暴(重度或危重症)风险高的患者，血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度显著高于风险低的患者，具体结果如图14所示；利用患者血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152的基线浓度进行免疫检查点风暴预测的受试者工作特征曲线(ROC曲线)见图15，曲线下面积(AUC)和95％置信区间(95％CI)见图示。
实验结果表明，对COVID-19患者入院时血清中BTLA、GITR、HVEM、IDO、LAG-3、PD-1、PD-L1、TIM-3、CD28、CD80、4-1BB、CD27和CD152基线浓度的检测，可实现对患者免疫检查点风暴风险的准确预测，预测准确率分别为79.7％、76.2％、64.7％、84.9％、79.2％、78.0％、74.6％、80.8％、68.9％、76.4％、84.9％、83.6％、61.9％。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
