技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及CAS作为三阴性乳腺癌标志物的应用、实验性验证CAS调控在抑制或治疗三阴性乳腺癌方面的应用及CAS调控在制备抑制三阴性乳腺癌药物方面的应用，本发明用于基础研究而非治疗目的。
背景技术
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，2018年全球癌症统计数据报告表明乳腺癌是发病率最高的女性癌症（24.2%），同时我国癌症中心在2018年发布的最新一期的癌症统计数据报告表明我国发病率最高的女性恶性肿瘤是乳腺癌（17.1%），说明乳腺癌是严重地威胁着女性的身体健康一大重要因素。
乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，根据免疫组化检测结果，可将乳腺癌分为Luminal A型（ER和/或PR阳性、Her-2阴性）、Luminal B型（ER和/或PR阳性、Her-2阳性）、Her-2阳性（ER和PR阴性、Her-2阳性）和Basal like型乳腺癌（ER阴性、PR阴性、Her-2阴性、CK5/6阳性、和/或Her-1阳性）、正常乳腺癌样型5个类型。其中我们经常听到的三阴性乳腺癌（ Triple Negative Breast Cancer：三阴性乳腺癌 ）免疫染色结果与Basal like 型相似，ER、PR和Her-2的表达均为阴性，三阴性乳腺癌和basal like 型乳腺癌的区别在于，basal like 型乳腺癌的确定主要通过基因芯片，而三阴性乳腺癌主要通过免疫组化染色确定，据文献报道约80%的三阴性乳腺癌是basal like 型，在一些情况下可以将二者等同起来。三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15%左右，高发于年轻女性，是乳腺癌中侵袭性最强的类型，患者肿瘤容易发生肺转移和脑转移，目前化疗是治疗三阴性乳腺癌的唯一手段，患者肿瘤容易复发。因此，寻找治疗三阴性乳腺癌的特异性靶标具有重要意义。
CAS 是一个核转运因子，负责将Importin-a从细胞核转运到细胞质中，在蛋白的核质运输中发挥着关键的作用。虽然有研究报道CAS与乳腺癌的发生具有一定的相关性，但是CAS在三阴性乳腺癌的具体作用机制仍不清楚。本研究发现CAS在三阴性乳腺癌患者中的表达显著高于非三阴性乳腺癌患者，且CAS在三阴性乳腺癌细胞的存活、迁移和侵袭以及肿瘤的生长中起着关键的作用。目前，仍未见到CAS作为三阴性乳腺癌标志物的报道。
发明内容
本发明基于以下发现：通过数据库挖掘分析发现CAS在三阴性乳腺癌组织中的表达显著高于非三阴性乳腺癌组织。
本发明的目的：针对现有技术中存在问题或不足，提供一种CAS作为三阴性乳腺癌标志物的应用、实验性验证CAS调控在抑制或治疗三阴性乳腺癌方面的应用及CAS调控在制备抑制三阴性乳腺癌药物方面的应用，为三阴性乳腺癌的筛查、诊断、预后评估、治疗提供新的方向，同时，为寻找三阴性乳腺癌发病机理提供新的研究方法。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种CAS作为三阴性乳腺癌标志物的应用。
进一步的，CAS作为标志物在三阴性乳腺癌肿瘤的筛查、诊断以及预后评估试剂中的应用。
优选的，所述试剂盒为含有定量CAS mRNA的试剂。
本发明的实施例还提供一种实验性验证CAS调控在抑制或治疗三阴性乳腺癌方面的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、构建敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型和敲减CAS的三阴性乳腺癌动物模型；
S2、通过细胞活力、细胞克隆实验、细胞迁移和侵袭实验、皮下荷瘤模型，并对敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型进行转录组测序，通过KEGG 通路富集得到显著改变的信号通路，研究 CAS调控三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。
具体的，所述步骤S1中，敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型，包括以下过程：利用慢病毒转染技术敲减三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的CAS基因构建而成的。
具体的，所述步骤S1中，敲减CAS的三阴性乳腺癌动物模型，包括以下过程：利用慢病毒构建敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞系，随后将细胞注射于裸鼠皮下构建而成的。
具体的，所述步骤S1中，构建的三阴性乳腺癌动物模型中所使用的动物可以采用裸鼠或其他具有免疫缺陷的小鼠品种。
本发明的实施例另外还提供CAS调控在制备抑制三阴性乳腺癌药物方面的应用，其特征在于：根据CAS调控三阴性乳腺癌发生发展的信号通路，研发制备对三阴性乳腺癌具有治疗效力的抗癌药物。
进一步的，所述CAS调控三阴性乳腺癌发生发展的信号通路通过利用慢病毒对三阴性乳腺癌细胞系中的CAS进行敲减，随后进行转录组测序，通过KEGG通路富集到一组敲减前后发生显著变化的信号通路的方法获得。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明的CAS作为三阴性乳腺癌标志物的应用，基于用生物信息数据库数据分析CAS在乳腺癌中的三阴性乳腺癌中显著高表达，从而发现三阴性乳腺癌标志物新的标志物，CAS作为三阴性乳腺癌标志物以及CAS在三阴性乳腺癌的筛查、诊断及预后评估中的应用。
（2）本发明的实验性验证CAS调控在抑制或治疗三阴性乳腺癌方面的应用利同时，利用慢病毒转染技术敲减MDA-MB-231细胞的CAS，建立敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型以及动物模型，通过细胞活力、细胞克隆实验、细胞迁移和侵袭实验、皮下荷瘤模型，同时进行转录组测序，研究 CAS调控三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用，为寻找三阴性乳腺癌发病机理提供新的研究方法。
（3）本发明的CAS调控在制备抑制三阴性乳腺癌药物方面的应用，通过所获得的CAS调控三阴性乳腺癌发生发展的信号通路，为研发制备对三阴性乳腺癌具有治疗效力的抗癌药物，提供新的方向。
附图说明
图1为本发明中CAS在非三阴性乳腺癌和三阴性乳腺癌表达统计结果图；
图2为本发明中细胞活力实验结果图；
图3为本发明中细胞迁移和细胞侵袭实验结果图，其中图3A、3B分别为细胞迁移结果图和统计图，图3C、3D分别为细胞侵袭结果图和统计图。
图4为本发明中裸鼠荷瘤动物模型实验结果图，其中图4A为肿瘤图片（左）以及肿瘤在裸鼠皮下的肿瘤图片（右），图4B为肿瘤的生长曲线图，图4C为肿瘤重量统计图。
图5为本发明中转录组测序的KEGG通路富集结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
CAS mRNA在三阴性乳腺癌的表达显著高于非三阴性乳腺癌组织
本发明通过数据库挖掘分析发现CAS mRNA在三阴性乳腺癌的表达显著高于非三阴性乳腺癌组织，如图1所示，具体的实验步骤如下：从UCSC Xena数据库中下载乳腺癌数据集，然后从对数据进行整理，统计CAS基因在三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌中的表达量，用Graph prism 8.0进行结果的统计分析。
构建敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型及动物模型
在本发明中，构建敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型及动物模型利用慢病毒介导的CAS基因沉默技术建立敲减CAS的三阴性乳腺癌系MDA-MB-231的细胞模型和动物模型。
本发明中，构建敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型系MDA-MB-231细胞模型，具体构建方法分别如下所示：将三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231以2×10
本发明中，构建敲减CAS的三阴性乳腺癌动物模型系MDA-MB-231裸鼠皮下荷瘤动物模型，具体构建方法如下所示：将乳腺癌细胞MDA-MB-231以1×10
细胞活力实验、细胞迁移和侵袭实验的方法
1、细胞活力实验，包括如下步骤：
（1-1）上述的细胞模型以2000个细胞/孔的密度，接种于培养板中，于37℃、5% CO
（1-2）酶标仪检测OD值，比较细胞的活力情况，此后每隔一天检测细胞活力直到完成细胞活力实验。
实验结果如图2所示，敲减CAS的实验组相对于空白对照组而言，敲减CAS 的实验组的三阴性乳腺癌细胞的活力明显小于空白对照组，可以看出，敲减CAS显著抑制三阴性乳腺癌细胞的活力。
2、细胞迁移和侵袭实验，包括以下步骤：
（2-1）将上述的细胞模型用无血清培养基重悬后以一定细胞数量接种于Corning CellCulture Insert (Transparent PET Membrane 24 Well 8.0 um pore size)/CorningMatrigel Matrix 的Transwell中，24孔板下室添加含10%FBS的培养基；
（2-2）放置于37℃、5% CO
实验结果如图3所示，细胞迁移和侵袭实验结果图，数据表明敲减CAS 显著削弱三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。从图3A、3B的细胞迁移结果图和统计图，可以看出，实验组相对于空白对照组而言，敲减CAS 后的实验组三阴性乳腺癌细胞的迁移能力明显削弱；从图3C、3D的细胞侵袭结果图和统计图，可以看出，实验组相对于空白对照组而言，敲减CAS 后的实验组三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力明显削弱。
敲减CAS的乳腺癌皮下瘤动物模型的构建
敲减CAS的乳腺癌皮下瘤动物模型的构建方法，包括如下步骤：将乳腺癌细胞MDA-MB-231以1×10
结果如图4的裸鼠荷瘤动物模型实验结果图所示，可见，图4A为肿瘤图片（左）以及肿瘤在裸鼠皮下的肿瘤图片（右），从图4A左侧图可见，空白对照组相对于敲减CAS的乳腺癌皮下瘤动物模型的实验组，实验组所取出肿瘤体积明显小于空白对照组所取出的肿瘤体积；从图4B的肿瘤的生长曲线图，可以看出敲减CAS的实验组的肿瘤生长速度显著低于空白对照组；从图4C的肿瘤重量统计图，可以看出实验组所取出肿瘤重量明显小于空白对照组所取出的肿瘤重量。
敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞模型的转录组测序 （RNA-seq）后的KEGG富集通路
KEGG富集通路的获得方法，包括如下步骤：收集敲减CAS 后6天的对照组细胞系MDA-MB-231-LV-U6和实验组细胞系MDA-MB-231-shCAS，保存于TRIZOL 置于-80度冰箱，提总RNA进行质量检测，选取260/280在1.8-2.0之间且琼脂糖凝胶电泳检测28S:18S至少大于1.8的样本，外送至测序公司，由测序公司进行构建文库、上机测序等步骤，测序完成后将获取的测序数据发回，进行解读及后续分析。
结果如图5所示，分析转录组测序数据显示：敲减CAS后，存在较多发生显著变化的信号通路，其中，显著性较高的包括：Lysosome、Prostate cancer、Dorso-ventral axisformation、Focal adhesion和TNF signaling pathway等。
本发明发现敲减CAS的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力显著减弱；在敲减CAS的三阴性乳腺癌小鼠皮下荷瘤模型中，敲减CAS慢病毒干扰会抑制三阴性乳腺肿瘤的生长。同时，通过对敲减CAS的三阴性乳腺癌乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞模型进行转录组测序，通过KEGG 通路富集得到显著改变的信号通路；从而，可以研发制备对三阴性乳腺癌具有治疗效力的抗癌药物，为研发三阴性乳腺癌的抗癌药物提供新的方向。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
