一株伊比利亚单孢囊菌及其应用

摘要

本发明属于微生物及其天然产物的应用技术领域，具体涉及一株伊比利亚单孢囊菌及其应用。本发明通过生物发酵方法，利用伊比利亚单孢囊菌来制备得到次级代谢产物‑单孢菌酸（Monospora acid），本发明的制备方法简单易行，相对于其它培养基，该方法成本更低，并具有可持续性，制备过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可实现工业化生产，提取得到单孢菌酸单体，纯度可达98.3%。

说明书

技术领域

本发明属于微生物及其天然产物的应用技术领域，具体涉及一株伊比利亚单孢囊菌及其应用。

背景技术

人体内血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与心血管疾病的发生风险密切相关。临床研究表明，在一定程度上LDL-C水平越低，心血管事件的发生率也越低。临床应用降低LDL-C水平的首选药物为他汀类(statins)，可有效降低LDL-C水平和心血管疾病发生风险。但研究表明，即使使用高剂量的他汀类药物，高心血管疾病风险的患者心血管事件的发生率仍然较高。另外，部分患者存在对高剂量他汀类药物不耐受的问题。因此研发更安全强效的新型降血脂药物对于心血管疾病的防治具有重大意义。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)通过促进低密度脂蛋白受体LDLR降解来调节血浆低密度脂蛋白脂(LDL-C)代谢。抑制PCSK9可以显著降低血浆LDL-C水平，因此PCSK9成为降脂药物研发的热门靶点。

目前以已上市的PCSK9为靶点的降脂药物均为抗体类药物，这类药物具有特异性、多样性及制备定向性等特点。但同时其纯化工艺成本过高、价格昂贵、药物质量检测标准不成熟、可能存在重度不良反应、患者的顺应性低等劣势。小分子化合物可弥补以上不足，且目前没有针对该靶点的小分子药物，因此开展抑制PCSK9小分子药物意义重大。通过微生物发酵获得PCSK9抑制剂，具有周期短、成本低、人体副作用小和可持续性等优势。

与此同时，血栓栓塞性疾病的防治问题一直是近年来的研究热点。血栓形成，即局部血液凝块形成，是导致心肌梗死和中风等动脉疾病以及静脉血栓栓塞性疾病(包括深部静脉血栓形成和肺栓塞)发生和患者死亡的主要原因，而药物治疗在防治过程中起着重要的作用，抗血栓形成药物可按作用机制分为抗凝血药物、抗血小板药物和直接溶血栓药物等，临床上均能用于预防和治疗血栓形成。其中抗凝血药物是通过影响凝血因子，从而阻止血液凝固过程的药物，临床主要用于血栓栓塞性疾病的预防与治疗。

抗凝血药物主要可以分为直接抗凝血药(如肝素、低分子肝素、肝素类似物、直接血栓抑制剂)和间接抗凝血药(如香豆素、茚满二酮衍生物)。但是，来源于植物或动物的化学成分一般含量较低，且分离纯化难度大，很少能够进入工业化生产；且以天然产物为母核进行的化学合成，生产成本高，对人体的毒副作用大。通过微生物发酵获得在医药和农药领域具有开发价值的的代谢产物，具有周期短、成本低、人体副作用小和可持续性等优势。

伊比利亚单孢囊菌(Monosporascus ibericus)属于单孢囊菌属真菌。目前，现有报道中该属仅包括4个种，分别为管释单孢囊菌M.cannonballus、拟弯孢单孢囊菌M.eutypoides、伊比利亚单孢囊菌M.ibericus、和单孢囊菌M.monosporus，这几种单孢囊菌属真菌均报道自相对干旱，且土壤类型呈碱性或有盐分积累的地区，单孢囊菌属真菌能造成香瓜侧根的腐败，病部散生多数黑色圆形小点，因此，对单孢囊菌属真菌进行深入研究具有生态学价值和生物学意义。

单孢菌酸(Monospora acid)，分子式为C

发明内容

本发明的目的是提供一株伊比利亚单孢囊菌，并利用所述伊比利亚单孢囊菌制备单孢菌酸(Monospora acid)。

为实现上述目的，本发明所用的菌种为分离自宁夏盐池县植物盐爪的一株内生真菌，该菌株的分类学名称为伊比利亚单孢囊菌Monosporascus ibericus CLC008，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年7月3日，保藏号为:CCTCC NO：M 2020274。

本发明又提供了所述伊比利亚单孢囊菌在制备单孢菌酸中的应用，在应用时，通过生物发酵方法，利用伊比利亚单孢囊菌制备得到次级代谢产物-单孢菌酸(Monosporaacid)，其结构式如下：

本发明进一步提供了所述伊比利亚单孢囊菌在制备抗凝血药剂或者降脂药物中的应用。

本发明还提供了利用伊比利亚单孢囊菌制备单孢菌酸(Monospora acid)的方法，具体包括如下步骤：

(1)菌种活化：将伊比利亚单孢囊菌接种到培养基A上，培养活化菌种；

(2)发酵培养：将步骤(1)制备的活化菌种接种于培养基B中，扩增培养，获得发酵物；(3)粗提物的制备：将步骤(2)得到的发酵物用乙酸乙酯浸提，浸提液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物；

(4)硅胶柱层析分离：将步骤(3)制备的粗提物以二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:1、100:2、100:4、100:8进行梯度洗脱，经薄层层析检测，得到目标流份，再利用硅胶柱层析法或葡聚糖凝胶柱层析分离得到目标化合物。

具体的，培养基A为PDA平板培养基。

具体的，培养基B的制备方法：将50-70g大米和100ml水混合，121℃下高压灭菌20-40分钟。

具体的，步骤(1)中的培养条件为25～30℃恒温培养48-72小时。

具体的，步骤(2)中的培养条件为20-25℃条件下静置培养25-28天。

具体的，步骤(3)中具体的浸提方法为：在步骤(2)制备的发酵物中加入乙酸乙酯，在20～25℃下冷浸10-12h，并用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取2-3次，合并提取液，然后，在温度为30～34℃，真空度为0.07～0.08MPa的条件下减压回收乙酸乙酯后，得粗提物。

具体的，步骤(4)中洗脱前，先将步骤(3)制备的粗提物用80～100目硅胶拌样后装柱，再用二氯甲烷、甲醇进行洗脱，其中粗提物与80～100目硅胶的重量比为1︰2，固定相为200～300目硅胶。

本发明产生的有益效果是：

本发明通过生物发酵方法，利用伊比利亚单孢囊菌来制备单孢菌酸(Monosporaacid)，本发明的制备方法简单易行，相对于其它培养基，该方法成本更低，并具有可持续性，制备过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可实现工业化生产，提取得到单孢菌酸单体，纯度可达98.3％，所述单孢菌酸在制备降脂药物方面和抗凝血药物方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)靶点试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

以下实施例中所用伊比利亚单孢囊菌是2016年8月28日采集自宁夏，盐池县的一种植物盐爪爪的一株内生真菌，且特殊生境真菌可产生特殊生物功能的次级代谢产物，盐爪爪主要生长在盐碱滩、盐湖边等高碱高盐地带，该菌株的分类学名称为伊比利亚单孢囊菌Monosporascus ibericus CLC008，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年7月3日，保藏号为:CCTCC NO：M 2020274。

分离筛选方法如下：

选取生长状态的盐爪爪叶片并用清洗干净，然后剪取5mm*5mm的叶片，接着将其放入装了70％乙醇的离心管中，1min后，倒出70％乙醇，向其中加入40ml 3％次氯酸钠，10min后取出叶片，最后用无菌水冲洗3次，将5片叶片均匀放入带有PDA培养基的平板(90mm)中，并在25℃恒温培养7d后挑菌，将挑好的菌种接种到带有PDA培养基的平板(90mm)中，并在25℃恒温培养7d，将纯化完成的菌株保藏至装有30％的甘油2ml小管中。

形态特征如下：

菌丝体由透明到浅棕色组成，有隔膜和分枝平滑有壁，直径2-4μm；子囊初生卷曲。子囊分散，球状到半球形，半透明，深褐色，400–700μm。被绒毛，9-12层，结构角状，35–45μm厚，由浅黄色至浅灰色组成棕色薄壁细胞，直径4–25μm，2–4μm厚。1到6个孢子，束状，棍棒状到亚圆柱形，厚壁，具柄，顶部圆形，宽且顶端环关；轴突纤细，具隔膜，具圆形，成熟时内陷。子囊孢子单细胞，球状，多层，厚壁，成熟时深棕色。

同时，依据《真菌鉴定手册(1979.9)》，鉴定为伊比利亚单孢囊菌。

实施例1

所述单孢菌酸(Monospora acid)通过以下步骤制得：

(1)菌种活化：将伊比利亚单孢囊菌(Monosporascus ibericus)接种到90mm平板PDA培养基上，25℃恒温培养72小时，获得活化菌种；

(2)发酵培养：将步骤(1)制备的活化菌种用手术刀片将其分为12份，取一份接种于培养基B(培养基B的制备方法：将60g大米和100ml水混合，121℃下高压灭菌40分钟)中，温度为25℃条件下静置培养25天，获得发酵物；

(3)粗提物的制备：在步骤(2)制备的发酵物中加入300ml乙酸乙酯，在20～25℃下冷浸12h，并用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并三次的提取液，得提取液，然后，在温度为30～34℃，真空度为0.07～0.08MPa的条件下减压回收乙酸乙酯后，得到粗提物100g；

(4)硅胶柱层析分离：将步骤(3)制备的粗提物用80～100目硅胶拌样后装柱(粗提物与80～100目硅胶的重量比为1︰2)，固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱(二氯甲烷－甲醇体积比为100:1；100:2；100:4；100:8)，硅胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:4的流份，40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇后，将得到的流份用甲醇溶解，经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)层析(流动相为甲醇)，得目标化合物纯品800mg(纯度为98.3％)。

步骤(3)中通过HPLC检测，检测到目标化合物在粗提物中的含量为26.6％，具体的测定条件为，色谱条件：Sepax GP-C18 5μm(250mm×4.6mm)色谱柱，流动相：乙腈︰水︰甲酸为10︰90︰0.1；流速：1.25mL/min，检测波长220nm，保留时间值10.70min。

对制备得到的目标化合物的结构进行了鉴定，结果如下：

【性状】白色粉末

【鉴定】分子式：C

仪器设备：Waters 2695液相色谱仪,

试验结果：利用ESI-MS，

利用薄层色谱法，在硫酸显色剂中显色，110℃下15秒钟，呈现棕色斑点。

经

实施例2单孢菌酸(Monospora acid)在制备降脂药物中的应用

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)靶点试验

具体方法如下：

2.1仪器试剂

ELISA所用抗体如His-tag一抗，HRP二抗均购自Abcam，实验所用EGF-AB蛋白和PCSK9蛋白均源自生物中心实验室自行构建培育和纯化。剩余材料包括20xPBS(生工生物)，脱脂奶粉(BD)，TMB高效显色剂(索莱宝生物)，ELISA用96孔板(Corning)，浓硫酸(科密欧)，DPBS(HyClone)，Tween 20(阿拉丁)，ddH2O(Milli-Q制备)及其他必要耗材。

实验用仪器采用Plate Reader EnVision(PerKinElmer)读取OD值，恒温培养箱(上海一恒)用于37℃孵育。

2.2试验方法

2.2.1配制PBST

600mL的ddH

2.2.2配制封闭液

2.5g脱脂奶粉+50mL的PBST配置成5％脱脂奶封闭液；

2.2.3 EGFAB蛋白的包被

EGF-AB蛋白用DPBS稀释为20μg/mL，每孔100μL加入96孔ELISA板，放入37℃恒温箱包被2-3小时，PBST清洗；

2.2.4封闭

5％脱脂奶粉37℃封闭1-2小时，PBST清洗，放入37℃恒温箱干燥30min；

2.2.5样品处理

单孢菌酸样品按初始浓度800μmol/L，1/2浓度梯度稀释至25μmol/L，各加1.25μg/mL的PCSK9，每组浓度三个重复，每个样品100μL，室温震荡1小时；处理后各样品加于已提前包被封闭的96孔板，室温震荡2-3小时，PBST清洗；

2.2.6一抗孵育

清洗完成后His-tag一抗每孔100μL加入96孔板，室温下震荡1-2小时，PBST清洗；

2.2.7二抗孵育

HRP二抗每孔100μL加入96孔板，室温下震荡1小时，PBST清洗；

2.2.8清洗拍干后每孔加入TMB显色液，后避光室温震荡至有颜色显出后加2M的H

2.3试验结果

表1

从图1和表1试验结果可以看出，化合物单孢菌酸可显著抑制前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的活性(IC

实施例3单孢菌酸(Monospora acid)在制备抗凝血药物中的应用

抗凝血试验

具体方法如下：

3.1实验动物

獭兔，雄性，体重2.0～2.5kg，动物适应性饲养一周。温度25±2℃，光照12小时/天，湿度在40～45％，自由饮水摄食。

3.2仪器试剂

HF6000-4半自动凝血分析仪(南方汉方医疗器械有限公司)；TGL-16gR高速台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子天平(美国Mettle-Toledo公司)，氯化钠注射液(河北天成药业股份有限公司，A14091701)；0.109mol/L枸橼酸钠溶液(自制)、维生素K

3.3试验方法

3.3.1样品溶液的配制

精密称取1mg monospora acid溶解于80μL溶剂(DMSO:Tween80:生理盐水＝10％：5％：85％)制得浓度为12.5mg/mL的monospora acid溶液。精密称取灯盏花素8mg溶解于240μL溶剂制得浓度为33.33mg/mL的灯盏花素溶液。维生素K

3.3.2 APTT的检测方法

獭兔耳缘静脉取血3.6mL，置于含有400μL浓度为0.109mol/L的枸橼酸钠的离心管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，取上层清液备用。在测试杯中加入25μL样品溶液，再加入100μL血浆和37℃预温的APTT试剂100μL，于37℃孵育5min后加入37℃预温下的0.025mol/L CaCl

3.3.3 PT的检测方法

血浆制备方法同1.3.2方法。在测试杯中加入25μL的样品溶液，再加入100μL的血浆，37℃孵育3min后加入37℃预温的PT试剂200μL，记录凝固时间，即为PT值。

3.3.4 TT的检测方法

血浆制备方法同1.3.2方法。在测试杯中加入50μL样品溶液和200μL的血浆，孵育3min后加入TT试剂200μL，记录凝固时间，即为TT值。

3.3.5 FIB的检测方法

血浆制备方法同1.3.2方法。按照试剂说明书测定标准曲线。取200μL血浆和100μL样品，然后加入700μL缓冲液。混匀后，取稀释后的血浆200μL，37℃预温3min，加入凝血酶溶液100μL，记录纤维蛋白原的含量，即为FIB值。

3.4数据处理

结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较，组间差异采用LSD(least significant difference)检测方法，其中P<0.05说明具有统计学意义，图均用GrapPad Prism软件绘制。

3.5试验结果

表2活化部分凝血活酶时间(APTT)

注：与空白比：

由表2可知，与空白组相比，monospora acid可显著的延长APTT(p<0.01)，弱于阳性对照灯盏花素(p<0.001)，具有抗凝血作用。

表3凝血酶时间(TT)

注：与空白比：

由表3可知，与空白相比，monospora acid可显著地延长TT(p<0.001)，具有抗凝血的作用。

表4凝血酶原时间(PT)

注：与空白比：

由表4可知，与空白相比，monospora acid可显著地延长PT(p<0.001)，强于阳性对照灯盏花素(p<0.001)，具有抗凝血的作用。

表5纤维蛋白原(FIB)

注：与空白比：

由表5可知，与空白相比，monospora acid对于FIB并没有活性。

综上所述，单孢菌酸(Monospora acid)可通过显著的延长APTT、PT和TT，进而发挥抗凝血作用。

上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所作的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。