检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器及其制备方法

摘要

本发明属于土壤重金属离子技术领域，具体为检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器及其制备方法。本发明的无酶传感器是金片电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极而构建成的标准三电极体系；其中，金片电极的表面自组装有多层聚多巴胺生物膜，同时在其表面修饰有DNA分子。本发明制备的重金属汞离子的无酶传感器具有以下优点：测定范围宽，检测限较低；制备工艺简单，操作非常简便；响应灵敏，检测速度快；对汞离子的检测具有良好的线性关系，有利于开发出连续在线检测重金属汞离子的平台；对铬离子、钾离子、钙离子和镁离子具有较强的抗干扰性能；在土壤实时原位检测方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于土壤重金属离子技术领域，具体涉及检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器及其制备方法。

背景技术

金属汞是一种毒性很大的环境污染物，在自然界中常常以化合物的状态存在。研究农业土壤中的重金属汞离子的含量对于人类健康有着至关重要的作用。环境中汞离子的测定方法通常有吸收光度法和荧光分光光度法（张军等。基于萘酰亚胺为发光团的Hg2+荧光探针的表征[J].化学试剂，2014，36：737-739.）。但是测定过程十分复杂，操作不便，尤其不利于农业土壤中重金属离子的现场快速检测和连续在线分析。电化学传感器高度集成化，自动化和微型化减少了使用者对环境和技术的要求，并且具有很高的灵敏度和选择性。同时由于电化学汞离子传感器通常是以氧化还原反应为传感机制，因此电极表面的设计非常重要。

DNA生物传感器具有非常好的靶向性能，能够准确分析出目标物质，并进行准确的含量测定（王永松等. 金纳米-金属硫蛋白紫外分光光度法检测汞离子[J].应用化工，2013，3：552-554）。然而DNA分子和金属衬底之间的结合强度是不够稳固的，因此会导致测试过程中DNA分子功能层的脱落，导致生物传感器检测性能受到损害。

针对以上问题，本发明提出了一种农业土壤中汞离子无酶生物传感器的制备方法，成功在金片电极表面实现了自组装聚多巴胺薄膜并且利用DNA分子修饰。并且在优化实验条件下对0.005 μM～1 μM范围内的汞离子浓度检测显示出良好的线性关系。通过循环伏安法和计时电流法测试，汞离子无酶传感器对汞离子的检测限低于0.020 μg/L。

若不使用聚多巴胺修饰，利用两端分别是巯基和季铵盐基团的烷基试剂来功能化金片电极，此方法检测限为0.067 μg/L（Liu, et al. Analytical Chemistry, 2010, 82：9606-9610）。

若不使用本发明特定的DNA修饰聚多巴胺修饰的金片电极，利用寡核苷酸DNA修饰聚多巴胺修饰的金片电极，传感器可以选择性地检出汞离子，但是检测限为0.082 μg/L（Han, et al. Analyst, 2009, 134：1857-1862）。

发明内容

本发明的目的在于提出一种测定范围宽、检测限低、检测速度快的检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器及其制备方法。

本发明提出的检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器，是金片电极作为工作电极、铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极而构建成的标准三电极体系；其中，所述金片电极的表面自组装有多层聚多巴胺生物膜，同时在其表面修饰有DNA分子。

本发明提出的检测农业土壤中重金属汞离子的无酶传感器的制备流程包括金片电极的表面活化和聚多巴胺层自组装和DNA分子的嫁接修饰。制备的具体步骤如下：

（1）金片电极的活化：将金片电极放置于质量百分比浓度为30-50%的稀硫酸水溶液之中，浸泡30-180 s，取出，用去离子水100-200 mL洗涤3-5次，干燥，得活化的金片电极；

（2）聚多巴胺层自组装：将步骤（1）中的活化的金片电极浸泡于2-4 g/L的多巴胺水溶液中，用2-4 M的盐酸调节多巴胺水溶液的pH值至8.5-9.5，放置30-45 min，取出，重复3-6次，得聚多巴胺修饰的金片电极；

（3）DNA修饰：将2-4 mL 100-200 μM的 DNA水溶液与96-198 mL 1 mM二茂铁甲酸溶液进行混合，然后将步骤（2）中的聚多巴胺修饰的金片电极放置于混合溶液中3-6 h，得DNA修饰的金片电极；

（4）无酶传感器的制备：将DNA修饰的金片电极作为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构建标准三电极体系，得无酶传感器。

该无酶传感器对于汞离子检测限为0.019 μg/L。

其中，该DNA的序列为：5’-S-S-TTCTTTCTTTCCCCCCTTGTTTGTT-NH₂-3’（SEQ>

其中，若金片电极放置于质量百分比浓度为30-50%的稀硫酸水溶液之中浸泡超过30 s，经组装之后的汞离子无酶传感器检测限为0.87 μg/L。

其中，若金片电极放置于质量百分比浓度为30-50%的稀硫酸水溶液之中浸泡超过180 s，经组装之后的汞离子无酶传感器检测限为0.34 μg/L。

其中，若多巴胺的质量浓度低于2 g/L，经组装之后的汞离子无酶传感器检测限为0.48 μg/L。

其中，若多巴胺的质量浓度高于4 g/L，经组装之后的汞离子无酶传感器检测限为0.64 μg/L。

其中，若使用寡核苷酸DNA（SEQ ID NO.2）修饰聚多巴胺修饰的金片电极，经组装之后的汞离子无酶传感器检测限为0.93 μg/L。

其中，该DNA的序列为：5’-ATGTCACGTTATTGCATTCG-3’（SEQ ID NO.2）。

本发明制备的检测土壤中汞离子无酶传感器，具有以下优点：（1）该重金属汞离子传感器的测定范围宽，检测限较低。（2）制备工艺简单，操作非常简便。（3）该重金属汞离子传感器的响应灵敏，检测速度快（< 2 s）。（4）该传感器对于汞离子的检测具有良好的线性关系，有利于开发出连续在线检测重金属汞离子的平台。（5）该电化学生物传感器对于铬离子，钾离子，钙离子和镁离子具有较强的抗干扰性能。可以成功应用于土壤中重金属汞离子的检测，在土壤实时原位检测方面具有应用价值。

本发明的有益效果在于：（1）成功利用了稀硫酸活化金片电极的表面，使得其表面的褶皱结构增加，极大提高了其比表面积；

（2）利用聚多巴胺生物层薄膜对金片电极进行了自组装，可以大大增加金片电极与DNA探针分子之间的结合强度；

（3）DNA探针分子与聚多巴胺的化学键合可以大大增加传感器的稳定性；

（4）将此传感器应用于土壤溶液检测时，其具备良好的抗干扰性能的实际服用性能。

具体实施方式

下面通过实例进一步描述本发明。

实施例1

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于50%稀硫酸溶液之中浸泡180 s，得到表面活化的金片电极。

将4 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.5。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复4次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于200 mL 180 μM DNA（SEQ ID NO.1）之中在室温避光条件下浸泡5 h使得L-半胱氨酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.019 μg/L。

实施例2

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于50%稀硫酸溶液之中浸泡10 s，得到表面活化的金片电极。

将4 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.5。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复4次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于200 mL 180 μM DNA（SEQ ID NO.1）之中在室温避光条件下浸泡5 h使得L-半胱氨酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.87 μg/L。

实施例3

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于50%稀硫酸溶液之中浸泡200 s，得到表面活化的金片电极。

将4 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.5。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复4次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于200 mL 180 μM DNA（SEQ ID NO.1）之中在室温避光条件下浸泡5 h使得L-半胱氨酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.34 μg/L。

实施例4

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于40%稀硫酸溶液之中浸泡45 s，得到表面活化的金片电极。

将1 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.0。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复4次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于150 mL 150 μM DNA（SEQ ID NO.1）之中在室温避光条件下浸泡4 h使得L-半胱氨酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.48 μg/L。

实施例5

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于50%稀硫酸溶液之中浸泡180 s，得到表面活化的金片电极。

将8 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.5。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复4次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于200 mL 180 μM DNA（SEQ ID NO.1）之中在室温避光条件下浸泡5 h使得L-半胱氨酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.64 μg/L。

实施例6

将金片电极分别放置于去离子水和无水乙醇中超声5 min，将整个金片电极放置于40%稀硫酸溶液之中浸泡55 s，得到表面活化的金片电极。

将3 g多巴胺加入至1 L的去离子水之中，加入tris，然后由HCl调节溶液的pH使其稳定在9.0。活化后的金片电极放置于多巴胺溶液中浸泡10 min，重复5次，多巴胺在金片表面完成自组装反应。

将制得的金片电极浸放置于200 mL 120 μM 寡核苷酸DNA（SEQ ID NO.2）之中在室温避光条件下浸泡4 h使得寡核苷酸与多巴胺之间的功能性基团充分化学键合。

配置土壤标准溶液，然后利用集成的标准三电极系统：工作电极（DNA修饰的金片电极）、对电极（铂电极）、参比电极（Ag/AgCl电极）进行测定溶液中的汞离子含量。通过循环伏安法和计时电流法的测试，此金片传感器的检测限为0.93 μg/L。

序列表

<110> 复旦大学

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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