一种水稻镉低积累突变体lcd1及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻镉低积累突变体

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及了一种水稻镉低积累突变体lcd>及其应用。

背景技术

镉（Cadmium，Cd）是一种对动植物均具有很强毒性的重金属元素，随着我国工业化、城镇化的快速发展，农田镉污染问题日益突出。水稻是我国最主要的粮食作物，也是一种对镉富集相对较高的作物，农田镉污染带来的大米镉超标事件时有发生。积极探索水稻低镉生产已成为持续高效利用土地资源和保证粮食产品质量安全的一项重要科学任务。目前采用的水稻低镉生产的技术主要有镉低积累品种筛选、调节土壤酸碱度、化学钝化、植物修复等。由于不同水稻品种间镉的积累能力差异明显,通过选择籽粒镉低积累的水稻品种种植，公认为是一种经济有效的途径，可以在重金属中、轻度污染的土壤上持续进行稻米安全生产。

近年来，国内外关于水稻镉积累的研究表明镉被水稻从土壤中吸收并在体内转运是受遗传控制的。由于水稻对重金属镉的积累具有显著的品种间差异，国内外学者通过对DH、RIL 群体等的 QTL 分析，已发现了一些控制品种间差异的遗传位点。如Ishikawa等用Koshihikari和Kasalath水稻构建的39个染色体置换系（CSSLs），分别在水稻第3、6和8号染色体定位到1个影响糙米镉含量的QTL。Kashiwagi等利用Kasalath和日本晴构建的回交重组自交系群体（BILs），鉴定到3个QTL与水稻地上部分镉含量相关，其中2个位于第4号染色体，1个位于第11号染色体。Abe等用LAC23和Koshihikari水稻构建的46个染色体置换系（CSSLs），在水稻第3号染色体定位到一个主效QTL（qlGCd3）降低籽粒镉的含量；Ueno等，Ishikawa等和Tezuka等在第7号染色体上同一区域均定位到1个控制水稻镉含量的主效QTL，这些研究使得利用分子标记辅助育种来筛选低镉水稻新品种成为可能。此外，在水稻中，一些参与镉的吸收、液泡隔离、木质部装载和韧皮部转运的基因也己经陆续被发现和研究，主要包括天然抗性巨噬细胞蛋白（NRAMP）和重金属ATP酶（P_1B-ATPase）等蛋白家族，这些转运子大部分都定位于水稻根系质膜或液泡膜，在Cd的吸收和解毒方面扮演着重要的作用。Ishikawa等利用离子束诱变获得三个OsNramp5基因突变体，遗传研究发现基因的不同位点突变均降低了其根系对Cd的吸收能力，从而使得茎叶和稻米中的Cd含量大幅降低。水稻OsHMA3是一个P_1B-ATPase>2+隔离在液泡中，从而减少镉向木质部的转移，降低Cd²⁺在籽粒中的积累。在籼稻品种Cho-Ko-Koku、Anjana>OsHMA3突变后，其在液泡中隔离Cd²⁺的功能缺失，最终使得Cd²⁺不能运进液泡，而是经木质部运输至地上部形成>2+富集。其他基因诸如OsNramp1、OsHMA2、OsIRT1和OsIRT2等也均被报道不同程度参与了根系对镉的吸收。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种水稻镉低积累突变体lcd1及其应用。

一种水稻镉低积累突变体lcd1，突变体lcd1的突变基因OsNRAMP5核苷酸序列如SEQ>lcd1的水稻植株和籽粒镉含量低于野生型水稻的植株和籽粒镉含量。

所述的突变基因OsNRAMP5的编码氨基酸序列如SEQ>

一种水稻镉低积累突变体lcd1的应用，使水稻镉低积累品种包含所述的突变体lcd1的突变基因OsNRAMP5；或使水稻包含所述的突变基因OsNRAMP5的编码氨基酸。

应用包括转基因、杂交、回交或无性繁殖中的一种或者多种。

一种表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的突变体lcd1的突变基因OsNRAMP5。

附图说明

图1A是镉低积累突变体（lcd1）与野生型9311的植株比较图；

图1B是镉低积累突变体（lcd1）与野生型9311的稻穗比较图；

图2是两个子代△SNP-index在染色体上的分布图；

图3.1是染色体1 △(SNP-index)分布；

图3.2是染色体2 △(SNP-index)分布；

图3.3是染色体3 △(SNP-index)分布；

图3.4是染色体4 △(SNP-index)分布；

图3.5是染色体5 △(SNP-index)分布；

图3.6是染色体6 △(SNP-index)分布；

图3.7是染色体7 △(SNP-index)分布；

图3.8是染色体8 △(SNP-index)分布；

图3.9是染色体9 △(SNP-index)分布；

图3.10是染色体10 △(SNP-index)分布；

图3.11是染色体11 △(SNP-index)分布；

图3.12是染色体12 △(SNP-index)分布。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

本发明首先对水稻品种9311种子（M₀代）进行EMS诱变处理，种植处理的种子获得M₁代植株。M₁代植株自交产生种子（为>2代），在镉污染田块上种植>2代植株，收获的水稻籽粒脱壳后，用电感耦合等离子体光谱仪（ICP）测定糙米中的镉含量，筛选镉低积累植株。将获得的水稻低镉积累株系进一步自交筛选，并在湖南和浙江4个镉污染稻田种植验证，获得了一个稻米镉积累极低、能稳定遗传的突变纯合单株，命名为lcd1（low>

本发明公开了一个控制水稻籽粒低镉积累的基因突变位点，所述突变位点位于水稻OsNRAMP5基因起始密码子ATG下游+707位核苷酸，且存在C/T多态性，该位点具有TT基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

水稻镉低积累突变体lcd1，其突变基因OsNRAMP5核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ>

一、水稻镉低积累突变体获取过程

将常规水稻9311种子450g（此为M₀），清水浸种12小时，用1.0%的甲磺酸乙酯（EMS）室温浸泡处理12小时，期间搅拌，弃去EMS处理液并用清水冲洗4小时。经诱变处理的种子，经浸种、催芽后播种，25d秧龄后单本移栽，按常规肥水管理（此为M₁）。成熟时，根据结实率状况每株收获1～3穗，共收获4140个株。除单株种子保存外，每株随机取15粒混合成M₂种子。

次年，M₂种子浸种、催芽后播种，25d秧龄单本移栽于镉污染田块（土壤总镉10.0>

将获得的水稻镉低积累材料种子于次年浸种、催芽后播种，25d秧龄单本移栽18株于镉污染田块（土壤总镉土壤总镉1.5 mg/kg，pH5.4），按常规肥水管理。成熟后单株收获，共收获12株。收获后的水稻籽粒脱壳后，用ICP测定糙米中的镉含量，其中2株水稻的糙米镉含量明显低于野生型，分别为0.077 mg/kg和0.075 mg/kg，其他与野生型9311品种相同，为4.9mg/kg。

将其中的1个镉低积累株系进一步自交筛选，并在湖南和浙江4个镉污染稻田种植验证，获得了一个稻米镉积累极低、能稳定遗传的突变株，命名为lcd1>(low cadmium mutant 1)。

二、镉低积累突变体lcd1镉积累特性

镉低积累突变体lcd1其主要农艺性状、稻米品质与野生型9311没有显著差异（见图1A、图1B，表1）。

2016、2017连续两年在杭州镉污染稻田种植，2017年在湖南湘潭、益阳，浙江富阳、开化4个镉污染稻田种植，结果均显示突变体lcd1糙米中的镉含量仅为野生型9311的5%以下，且乳熟期突变体lcd1植株根系和地上部的镉含量均下降数十至数百倍，表明突变体lcd1具有镉积累极低的特性。以2017年在镉重度污染试验点的结果为例，野生型9311糙米中镉含量为4.44>lcd1糙米中镉含量为0.087>

三、镉低积累突变体lcd1突变基因的确定

将镉低积累水稻突变体lcd1与野生型9311品种进行杂交，所有F1植株均未表现低镉积累特性。当年冬季在海南将F₁代自交，获得F2代分离群体。随机选取约800粒F₂代种子，经浸种、催芽后，播种于漂浮在镉浓度为0.1>2分离群体中正常株和低镉积累株呈典型的3:1分离，表明水稻lcd>1突变体的低镉性状受隐性单基因控制。

进一步选择突变体lcd1与野生型9311品种杂交的F2群体作为定位群体，在分离出的镉低积累和高积累极端表型中各选择约30个单株，分别进行DNA提取，然后将30个样品DNA等量混合构建DNA池，进行全基因组重测序。

DNA提取按如下步骤进行：取约2 cm长的水稻叶片置于2 ml离心管中；在研钵中加入 800 μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴 20-30min，每 5min 颠倒混匀 1 次；加入等体积的氯仿/异戊醇 (24:1)，上下颠倒混匀，持续 10min；10000 rpm 离心，10min；吸取400 μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95%乙醇，-20℃冰置 20min；12000rpm 离心，15min；弃上清，加入500μl 75%乙醇，颠倒漂洗，12000rpm 离心5min ；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加 100μl ddH₂O>

基因组重测序步骤如下：获得DNA后，将群体两个亲本和两个子代极端表型混池DNA样品随机打断成长度为350bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 进行建库，DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备，构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。

测序共产生 Raw data 49.508G，过滤后的 Clean data为49.344 G，测序质量高（Q20 ≥ 95.86%、Q30 ≥ 93.47%），GC含量分别在43.5%~45.05% 之间。综上，所有样本的数据量足够，测序质量合格，GC分布正常，建库测序成功。

有效测序数据通过BWA软件比对到参考基因组Oryza_Indica，比对结果经SAMTOOLS去除重复，所有样本的比对率在90.98%~98.88%之间。比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。

采用GATK3.3软件的UnifiedGenotyper模块进行多个样本SNP的检测，使用VariantFiltration进行过滤，得到总的SNP为2436991个。其中外显子上的同义变异为80651个，非同义变异为97540个。基于基因分型的结果，筛选两个亲本间纯合差异的标记，共挑选出1840586个多态性标记。根据子代SNP-index在染色体上的分布情况，可以明显的看出7号染色体即为候选基因所在染色体（见图2、图3.1-3.12）。

对于候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，筛选出候选基因Os07g0257200，该候选基因编码自然抗性相关巨噬细胞蛋白OsNRAMP5（natural resistance-associated macrophage protein），是水稻根部细胞参与吸收外部Mn²⁺、Cd²⁺和Fe²⁺的主要转运蛋白，其基因结构如SEQ>lcd>1突变体中ATG下游+707核苷酸处出现碱基置换C变为T，产生非同义突变，导致编码区翻译过程中第236个密码子CCC突变为CTC，由脯氨酸（Pro）变成亮氨酸（Leu）(如SEQ>

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种水稻镉低积累突变体lcd1及其应用

<150> 201810186392.3

<151> 2018-03-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1617

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atggagattg agagagagag cagtgagaga gggagcatca gctggagagc tagtgcggca 60

catgatcaag atgccaagaa gctcgacgca gatgatcagc tgctaatgaa ggagcctgca 120

tggaaaaggt tccttgccca tgttggtcct ggattcatgg tgtctttagc ctacttggat 180

cctggcaatt tggaaaccga tctgcaagcc ggagccaacc acagatatga gctgctctgg 240

gtgattctga ttggactcat cttcgcactt atcatacagt cgctagcagc taatcttgga 300

gtggttacag ggaggcatct ggctgagatc tgcaagagtg agtaccccaa gttcgtcaag 360

attttcctat ggctgctggc agagttggcc gtcatcgctg cagatatccc agaagttata 420

gggacggcct ttgctttcaa catattgttc catattccgg tgtgggtcgg cgtcctcatc 480

accggcacca gcactctact gcttcttggc ctccaaaaat acggggtgag gaagctggag 540

tttctgatat cgatgctggt gttcgtgatg gcggcgtgct tcttcgggga gctgagcatc 600

gtgaagccgc cggcgaagga ggtgatgaag gggctcttca tccccaggct caacggcgac 660

ggcgccaccg ccgacgccat tgccctcctc ggagctcttg tcatgctcca caatctgttc 720

ttgcattctg ccttggtgct atcgaggaag acaccggcat cagtcagagg aatcaaggac 780

gggtgcaggt tcttcctgta cgagagcggg ttcgcgctgt tcgtggcgct gctgataaac 840

atcgccgtcg tctccgtctc cggcaccgcc tgctcctccg ccaacctctc ccaagaggac 900

gccgacaagt gcgccaacct cagcctcgac acctcctcct tccttctcaa gaacgtgctg 960

ggcaagtcga gtgcgatcgt gtatggcgtg gcactgttgg catctgggca gagctccact 1020

attaccggca catacgctgg acagtacatc atgcagggtt tcttggacat caggatgagg 1080

aagtggcttc ggaacctgat gacaagaacc atcgccatcg cgccgagcct catcgtctcc 1140

atcatcggcg gctccagggg cgccggccgc ctcatcatca tcgcttcgat gatactgtcc 1200

ttcgagctgc cgtttgctct catccctctt ctcaagttca gcagcagtaa gagcaagatg 1260

gggccccaca agaactctat ctatataata gtgttctcgt ggttcctggg gctgctcatc 1320

atcggcatca acatgtactt cctgagcacg agcttcgtcg gctggctcat ccacaacgac 1380

ctccccaagt acgccaacgt gctcgtcggc gccgccgtct tcccgttcat gctcgtctac 1440

atcgtcgccg tcgtctacct caccatcagg aaggactccg tcgtcacctt cgtcgccgac 1500

tcctccctcg ccgccgtcgt cgacgccgag aaggccgacg ccggcgacct cgccgtcgac 1560

gacgacgagc ccttgccgta ccgcgacgac ctggccgaca tcccgctccc aaggtag 1617

<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Glu Ile Glu Arg Glu Ser Ser Glu Arg Gly Ser Ile Ser Trp Arg

1 5 1015

Ala Ser Ala Ala His Asp Gln Asp Ala Lys Lys Leu Asp Ala Asp Asp

202530

Gln Leu Leu Met Lys Glu Pro Ala Trp Lys Arg Phe Leu Ala His Val

354045

Gly Pro Gly Phe Met Val Ser Leu Ala Tyr Leu Asp Pro Gly Asn Leu

505560

Glu Thr Asp Leu Gln Ala Gly Ala Asn His Arg Tyr Glu Leu Leu Trp

65707580

Val Ile Leu Ile Gly Leu Ile Phe Ala Leu Ile Ile Gln Ser Leu Ala

859095

Ala Asn Leu Gly Val Val Thr Gly Arg His Leu Ala Glu Ile Cys Lys

100 105 110

Ser Glu Tyr Pro Lys Phe Val Lys Ile Phe Leu Trp Leu Leu Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Val Ile Ala Ala Asp Ile Pro Glu Val Ile Gly Thr Ala Phe

130 135 140

Ala Phe Asn Ile Leu Phe His Ile Pro Val Trp Val Gly Val Leu Ile

145 150 155 160

Thr Gly Thr Ser Thr Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gln Lys Tyr Gly Val

165 170 175

Arg Lys Leu Glu Phe Leu Ile Ser Met Leu Val Phe Val Met Ala Ala

180 185 190

Cys Phe Phe Gly Glu Leu Ser Ile Val Lys Pro Pro Ala Lys Glu Val

195 200 205

Met Lys Gly Leu Phe Ile Pro Arg Leu Asn Gly Asp Gly Ala Thr Ala

210 215 220

Asp Ala Ile Ala Leu Leu Gly Ala Leu Val Met Leu His Asn Leu Phe

225 230 235 240

Leu His Ser Ala Leu Val Leu Ser Arg Lys Thr Pro Ala Ser Val Arg

245 250 255

Gly Ile Lys Asp Gly Cys Arg Phe Phe Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Ala

260 265 270

Leu Phe Val Ala Leu Leu Ile Asn Ile Ala Val Val Ser Val Ser Gly

275 280 285

Thr Ala Cys Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gln Glu Asp Ala Asp Lys Cys

290 295 300

Ala Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Ser Phe Leu Leu Lys Asn Val Leu

305 310 315 320

Gly Lys Ser Ser Ala Ile Val Tyr Gly Val Ala Leu Leu Ala Ser Gly

325 330 335

Gln Ser Ser Thr Ile Thr Gly Thr Tyr Ala Gly Gln Tyr Ile Met Gln

340 345 350

Gly Phe Leu Asp Ile Arg Met Arg Lys Trp Leu Arg Asn Leu Met Thr

355 360 365

Arg Thr Ile Ala Ile Ala Pro Ser Leu Ile Val Ser Ile Ile Gly Gly

370 375 380

Ser Arg Gly Ala Gly Arg Leu Ile Ile Ile Ala Ser Met Ile Leu Ser

385 390 395 400

Phe Glu Leu Pro Phe Ala Leu Ile Pro Leu Leu Lys Phe Ser Ser Ser

405 410 415

Lys Ser Lys Met Gly Pro His Lys Asn Ser Ile Tyr Ile Ile Val Phe

420 425 430

Ser Trp Phe Leu Gly Leu Leu Ile Ile Gly Ile Asn Met Tyr Phe Leu

435 440 445

Ser Thr Ser Phe Val Gly Trp Leu Ile His Asn Asp Leu Pro Lys Tyr

450 455 460

Ala Asn Val Leu Val Gly Ala Ala Val Phe Pro Phe Met Leu Val Tyr

465 470 475 480

Ile Val Ala Val Val Tyr Leu Thr Ile Arg Lys Asp Ser Val Val Thr

485 490 495

Phe Val Ala Asp Ser Ser Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Glu Lys Ala

500 505 510

Asp Ala Gly Asp Leu Ala Val Asp Asp Asp Glu Pro Leu Pro Tyr Arg

515 520 525

Asp Asp Leu Ala Asp Ile Pro Leu Pro Arg

530 535

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