一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法，包含如下步骤：(1)酶法降解肝素得到肝素二糖；(2)利用RAFT反应制备分子量可控且单分散的聚甲基丙新酰乙醇胺；(3)肝素二糖室温条件下通过连接剂接枝聚甲基丙新酰乙醇胺；(4)肝素二糖接枝聚甲基丙新酰乙醇胺的硫酸化。本发明的合成方法利用肝素二糖接枝在合成高分子骨架上，同时硫酸化，保证负电荷密度，检测表现出低抗凝血活性以及抗肿瘤转移特异性性能；其反应条件温和、易控，原料易得、成本较低，将有助于肝素类抗肿瘤药物的开发。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法。

背景技术

肝素，常常存在于肥大细胞中，也存在于肺、血管壁、肠粘膜等组织中，由于其各种亲和力在临床中被广泛用作抗凝药物。肝素最为人所熟知的是它在血液凝固过程中的作用，但在是生物活性功能中也能发挥其他作用比如抗炎、抗血管生成、及抗肿瘤作用。其中，肝素的抗肿瘤作用已经备受关注，许多研究已经证明了肝素能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。然而天然肝素是在结构上不均一的混合物，导致生物活性标准难以界定，构效关系和作用机理的研究非常困难。而天然肝素的强抗凝血活性可能会引发出血和血小板减少症等毒副作用。这限制了天然肝素的应用。此外，天然肝素的唯一来源是动物组织，具有可能带来病毒污染和不良反应的风险。而肝素在治疗中还可能会被肝素酶和其他酶在体内分解，导致失去生物活性。

肝素的抗凝血活性主要来自其包含的特定戊糖序列，该序列结构能够与抗凝血酶(AT-Ⅲ)结合，活化抗凝血酶，由于肝素具有的抗凝血活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等作用；此外，研究人员发现，肝素的抗肿瘤活性与其抗凝血能力并没有直接关联，而是由于肝素糖环伴随的氢键形成，和肝素硫酸根负电荷的作用，使肝素能够结合肿瘤转移过程中起重要作用的蛋白质的结果。因此，低抗凝血肝素的开发引起了很大关注，尤其在抑制肿瘤生长和转移方面。

申请号CN2012103286497的中国专利申请公开了一种控制生产低分子量肝素的方法，利用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量或超低分子量肝素，然而，由于肝素及其低分子量肝素结构的特异性和多分散性，导致副作用的风险高。

最近几年，许多研究者还尝试使用化学法合成结构明确的肝素二糖和肝素衍生物以减弱抗凝血活性，然而,这种方法伴随着生产的高成本和合成的困难，硫酸化程度的降低也减弱了肝素的抗肿瘤活性。因此去除具有抗凝能力的五糖序列，将确定组分的肝素二糖接枝在丙烯酸酯长链上并加以硫酸化，就有可能降低结构异质性，消除抗凝血活性，并提高其抗肿瘤活性，合成刷状具有抗肿瘤作用的肝素类似物大分子。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺及其制备方法；制备方法较为简单，具有原料低廉、反应条件温和易控等优点。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺，通过联用过量肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ，将天然肝素完全降解，分离制备得到天然二糖，将二糖接枝在特定分子量的丙烯酸酯长链上，加以硫酸化，得到具有良好化学稳定性，低抗凝血，优异生物相容性、抗肿瘤性能的类肝素大分子。

上述硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺的制备方法，包括如下步骤：

(1)肝素二糖的制备与分离：首先加入过量肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ将天然肝素完全酶解；然后利用G25、强阴离子色谱交换柱、G10凝胶脱盐得肝素二糖；

(2)聚甲基丙烯乙醇胺(PAMA)的合成：以乙醇胺盐酸盐、甲基丙烯酰氯为原料，合成甲基丙烯乙醇胺单体，再利用RAFT反应制备特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺；特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺通过RAFT反应实现，反应中通过控制添加引发剂、链转移剂添加量，同时控制反应条件实现分子量可控；

(3)接枝反应：称取肝素二糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，溶于pH 5.4～5.6的MES缓冲液，调节控制pH在7.5～8.5，再加入聚甲基丙烯乙醇胺，室温下反应8～12h，反应液离心除沉淀后，透析，冻干，得肝素二糖接枝聚甲基丙烯乙醇胺(GPHD)；

(4)硫酸化反应：称取肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺、三氧化硫吡啶溶于超纯水中，调节pH至碱性，50～80℃反应24h，再用盐酸溶液中和，透析，冻干，即得。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ的酶活添加比例为1:1:1。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中甲基丙烯酰乙醇胺的合成具体步骤为：称取乙醇胺盐酸盐与对苯二酚混合，70～80℃下加入甲基丙烯酰氯，反应2h。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)聚甲基丙烯乙醇胺的合成具体步骤为：按摩尔比50～200:1:0.2称取甲基丙烯乙醇胺、偶氮二异丁腈(AIBN)和4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(CTA)，并溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，70～80℃氮气保护下反应24h，其中，AIBN作为引发剂，CTA作为聚合链转移剂。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)中，肝素二糖与PAMA的质量比10～20:4～5，肝素二糖、EDC和NHS的质量比为1:1.25～3：0.2～1.5。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(4)中，调节pH为9.5～10.5，所用试剂为碳酸钠。

作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺为分子量单分散的组分。

上述硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

作为本申请的优选技术方案，所述的肿瘤是黑色素瘤。

本发明所述的大分子是由肝素酶降解的肝素二糖，与氨基聚丙烯酸酯连接，一端反应基团是羧基，一端反应基团是氨基，通过形成酰胺键相连，合成的具有抗转移活性的类肝素含糖大分子。

本发明实施例中，硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺对肿瘤细胞迁移、穿膜能力的抑制作用，与肝素相比都显示出更强的抑制作用，且体外抗凝活性测定显示，其基本消除了抗凝血活性，非常具有发展潜力。

其具体合成路线如下：

本发明通过联用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ，将天然肝素完全降解，经G25凝胶初步过滤分离，强阴离子色谱交换柱分离制备得到天然二糖，G10凝胶脱盐后，将二糖接枝在特定分子量的聚甲基丙烯乙醇胺长链上，加以硫酸化，得到具有良好化学稳定性，低抗凝血，优异生物相容性、抗肿瘤性能的类肝素大分子。

本发明提供的硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺以及制备方法，与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明首先从天然肝素酶解获得二糖原料，免去了化学法合成肝素糖单元的繁琐，同时也消除了肝素抗凝血活性中心的数量，极大地降低了抗凝血活性；

(2)本发明的肝素二糖是天然二糖，具有安全性；高分子和肝素的选择均具有高度的生物安全性做前提；

(3)本发明将肝素二糖接枝在PAMA上，形成“糖簇效应”，产品也呈现低毒性和可忽略的抗凝血活性；

(4)本发明用硫酸化提高提高了产物活性位点的电荷密度，提高了抗转移活性；

(5)制备方法较为简单，具有原料低廉、反应条件温和易控等优点。

附图说明

图1为由肝素二糖的强阴离子交换色谱图；

图2为特定分子量聚甲基丙烯乙醇胺的GPC分子量测定图；

图3为采用划痕实验检测肝素和硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺对B16黑色素瘤细胞迁移的抑制情况；其中，Control代表无药物添加的空白对照组，Heparin代表肝素，SGPHD代表硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺；图为0h与24h后药物存在时细胞划痕愈合情况的对比；

图4为采用划痕实验检测肝素和硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺对B16黑色素瘤细胞穿膜的抑制情况；其中，Control代表无药物添加的空白对照组，Heparin代表肝素，SGPHD代表硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过商业购买的常规产品。

实施例1：

1.酶法降解制备肝素二糖

将6g肝素溶解于120mL包含5mM CaCl,20mM NaCl的pH 7.4Tris缓冲液中，加入肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ各10IU，置于37℃摇床150转/分钟震荡反应24h。反应结束后，反应液被煮沸3min使酶失活，5000r/min离心15min，取上清液冻干，得到肝素寡糖，本实施例通过提高温度使酶失活。

2.G25凝胶初步过滤分离

Sephadex G-25经处理，装成1.2×100cm的玻璃层析柱。将冻干寡糖使用超纯水配置成40mg/mL溶液，上样1mL,使用1mL/min超纯水流速洗脱，使用紫外检测器监测232nm吸收波长曲线，分管收集各峰并冻干。

3.强阴离子交换色谱检测二糖组分

采用HPLC法，色谱条件为：ProPac SAX-10色谱柱，以20mM–1.5M pH 3.5的NaCl溶液为流动相梯度洗脱，流速0.5mL/min,柱温25℃。分别上样分管收集的肝素二糖样品20μL，监测洗脱曲线，确定包含二糖组分，如图1所示，1-8峰分别为肝素结构中包含的八种二糖。

4.G10凝胶脱盐

将检测到的肝素二糖组分40℃旋转蒸发浓缩后，使用1.2×100cm Sephadex G10柱脱盐，流动相为超纯水，流速为1mL/min。脱盐二糖再次旋转蒸发浓缩后，冻干待用。

5.甲基丙烯酰乙醇胺单体的合成

将1g干燥的乙醇胺盐酸盐与30mg对苯二酚混合，置于25mL圆底烧瓶中，80℃加热搅拌状态下，滴入2mL甲基丙烯酰氯，70～80℃冷凝回流搅拌反应2h；向溶化的产物加入3mL四氢呋喃溶解，使用100mL乙醚8000r/min沉淀离心；沉淀用乙醚洗三次，真空干燥得到甲基丙烯酰乙醇胺单体。

6.特定分子量聚甲基丙烯乙醇胺的合成

将662mg甲基丙烯乙醇胺、4.24mg AIBN、0.821mg4-氰基戊酸二硫代苯甲酸溶于5mL无水DMF，加入聚合管。聚合管使用液氮冷却，抽真空后解冻，置换高纯氮气，重复三次。聚合管70-80℃油浴搅拌反应24h后，使用100mL乙醇沉淀，再使用乙醇洗三次，将沉淀出的聚合物真空干燥。聚合物分子量使用GPC测定(图2)，结果显示聚合物为分子量单分散的组分。

7.肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺

取200mg混合肝素二糖、47mg NHS与257mg EDC溶于50mL pH 5.5MES缓冲液，室温下搅拌30min。使用三乙胺调节pH到8，再加入50mg聚甲基丙烯乙醇胺，室温搅拌反应8h。反应液离心除去沉淀，使用截留分子量3000透析袋透析，冻干得到产物肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺。

8.肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺的硫酸化

取二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺50mg，三氧化硫吡啶75mg，溶于5mL超纯水中，使用碳酸钠调节pH为9.5～10.5,反应液在50～80℃氮气氛下搅拌反应24h后使用0.1M盐酸溶液中和，使用截留分子量3000透析袋透析，冻干得到产物硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺。

性能测试

1.硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺体外对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用

将易转移的B16黑色素瘤细胞接种在24孔板上，密度为5×10⁴/孔。待孔中细胞密度大于90％后，使用200μL枪头于每孔细胞层上平行画出划痕。使用PBS清洗两次，更换为无血清培养基，同时分组加入肝素(512mg/L)，不同浓度的硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺(128mg/L、256mg/L和512mg/L)，继续培养24h，观察并拍照划痕愈合情况。

结果如图3显示，没有加药处理的B16黑色素瘤细胞层划痕经过24h后基本愈合，说明其原本的迁移能力很强。而加入肝素和硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺均对这种愈合有明显的抑制作用，而且硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺对B16黑色素瘤细胞迁移的抑制能力更强。

2.硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺体外对肿瘤细胞穿膜能力的抑制作用

于24孔板各孔分别加入700μL含有不同浓度的肝素和硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺(128mg/L、256mg/L和512mg/L)的培养基，装置Transwell小室。向每个小室上层接种100μL密度为1×10⁶/mL的B16黑色素瘤细胞悬浮液，继续培养24h后，使用棉签擦去小室上层的B16黑色素瘤细胞，并使用0.1％结晶紫溶液对穿过小室膜的B16黑色素瘤细胞染色，PBS清洗残余染料三次后，观查并拍照细胞穿膜情况。

结果如图4显示，肝素和硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺均对这种穿膜运动有明显的抑制作用，且硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺显示出了更强的抑制能力。

3.硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺体外抗凝活性测定

硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺体外抗凝活性使用欧洲药典7.0版本的底物显色法测定。6.05g/L Tris溶液被盐酸调节pH至8.4作为稀释液。160μL不同浓度的药物与过量的抗凝血酶AT-Ⅲ以及20μL人血清在37℃水浴60s后，加入40μL 2mM凝血因子Xa(S-2765)或Ⅱa(S-2238)显色底物，10-30s时间段测定405nm处吸收。使用肝素标准品(220U/mg)按上述方法测定不同浓度肝素的抗Xa或Ⅱa活性，并绘制标准曲线，根据标准曲线，计算硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺的抗Xa或Ⅱa活性。

表1硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺(SGPHD)及作为对照组的肝素、肝素二糖体外抗凝活性

由表1可以看出，硫酸化肝素二糖接枝聚甲基丙烯酰乙醇胺具有与肝素二糖相当的抗凝血能力，比肝素低50倍以上，因此，当用作抗肿瘤药物时，可忽略SGPHD的出血风险；肝素的抗凝血活性由单链糖蛋白抗凝血酶Ⅲ介导，该活性主要来源于NA/NS混合区域中特异性的可与抗凝血酶特异性结合的五糖序列，由于SGPHD的肝素二糖不含有上述五糖结构，所以SGPHD理论上可以降低其抗凝血活性。

由以上的性能测试数据可以看出，SGPHD对抑制B16细胞迁移、侵入和粘附与肝素相比显示了更强的作用，同时还消除了肝素抗凝血活性中心的数量，极大地降低了抗凝血活性，这些结果对抗肿瘤药物的进一步合理设计与应用产生重要影响。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。