一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用

摘要

本发明属于基因检测技术领域，公开了一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用。该SNP分子标记对应于NCBI公布的鸡参考基因组gallus_gallus‑5.0版本序列信息3号染色体正义链88,472,831位，此处碱基为T或G。本发明的SNP分子标记与鸡喙畸形性状相关，是一个新的分子标记，通过确定待测鸡在该SNP位点的基因型对鸡喙畸形性状进行净化，可以降低群体中喙畸形性状的发生概率，提高动物福利，减少养殖损失。具有很大的经济应用价值和科研价值。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

喙是鸟类重要且特有的面部器官，起到哺乳动物唇和齿的作用。在一些家禽品种中，尤其是清远麻鸡、文昌鸡、泰和乌鸡、胡须鸡和北京油鸡等地方鸡品种中，经常发现喙畸形的个体，有的群体发生率高达3％。喙畸形主要表现为上下喙错位，咬合不全，呈交叉状态(图1)，交叉角度不一，有的偏转1-2度，有的高达70度。喙畸形鸡的采食和饮水均受到严重影响，生长状况差，产蛋量低甚至不产，畸形角度大的个体死亡率很高。因此，喙畸形的发生严重危害动物福利，更是给家禽养殖行业造成一定的经济损失。

喙畸形性状在孵化期鸡胚和刚孵化出雏的鸡苗中，鲜见表现，主要是在育雏期的2-4周龄左右，伴随喙的生长才慢慢表现出来。传统方法中，通过表型选择淘汰育雏期的喙畸形的个体，但是表型淘汰后的群体再繁育的下一世代中仍然有喙畸形个体的产生。我国著名地方品种北京油鸡中的数据显示，仅仅依靠表型淘汰几乎不能改变群体世代间喙畸形的发生率。由于喙畸形性状的畸形程度不一致，有的上下喙交叉角度较小，肉眼判定喙正常的个体可能存在微小的不易观测到的畸形现象。交配试验显示，正常公母鸡交配仍然可以产生喙畸形的后代，喙畸形的公母鸡繁殖的后代畸形的发生概率更高，约为8％。在前期有系谱记录的喙畸形北京油鸡个体中，向上追溯四代，其中部分鸡可以追溯到共同祖先，连续两代都发生喙畸形的占所有喙畸形鸡的比例为62.5％。这说明该性状的发生具有可遗传性，相关调控基因的变异导致了喙畸形的发生，正常个体可能通过携带致畸基因导致后代个体出现喙畸形。因此有必要筛选与喙畸形性状相关的分子标记，用于早期鉴定并剔除群体中的喙畸形/致畸基因携带个体，或者肉眼难察觉的喙畸形个体。从而更准确和快速地将地方鸡群体中该不良表型剔除，降低喙畸形发生概率，提高动物福利水平，减少经济损失。

随着高通量测序技术和基因组遗传标记检测技术的突飞猛进，结合数量遗传学和统计学的方法来研究基因组上某一个位点或某一个区域的结构变异与表型性状的关联，是一种有效寻找表型性状分子标记的方法。全基因组关联分析(Genome-wide associationstudy，GWAS)是指以全基因组范围内的单核苷酸多态性(Single-nucleotidepolymorphism，SNP)为遗传标记，对复杂性状进行关联分析，从中筛选出与性状相关的变异位点。该变异位点可以作为分子标记，便于通过分子手段净化不良性状或者提高目的性状的选育进展。因此，研究与鸡喙畸形性状相关的分子标记具有重要应用价值。

发明内容

本发明为了准确地确定待测鸡的基因型，以方便对鸡喙畸形和致畸基因携带者进行早期剔除，降低喙畸形发生概率，提高动物福利，减少养殖损失，提出一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用。具体采用了以下技术方案：

一种与鸡喙畸形性状相关的SNP分子标记，所述SNP(单核苷酸多态性)分子标记对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-5.0版本序列信息3号染色体正义链第88,472,831位，此处碱基为T或者G(对应的rs号为rs313625170)。

所述的SNP分子标记在鸡喙畸形性状净化中的应用。

一种检测鸡喙畸形性状的方法，为根据上述SNP位点的基因型对鸡喙畸形性状基因携带者进行早期剔除，包括以下步骤：

(1)提取待检测鸡的基因组DNA；

(2)以鸡基因组DNA为模板，检测待测鸡3号染色体rs313625170SNP位点的基因型；

(3)基于SNP位点的基因型对待测鸡进行排查，剔除携带有害等位基因个体，其中，TG基因型和GG基因型为有害基因型。

步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行翅下静脉采血，用ACD抗凝剂进行抗凝处理后，经过SDS裂解液裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿抽提法提取全基因组DNA，溶解于灭菌双蒸水中。

步骤(2)中基因型采用600K Axiom^TMGenome-Wide>

步骤(2)中基因型还可以通过对特异性引物的扩增产物进行测序检测，其中上游引物序列为：5’-ATGTGGGAACTAAGGGGACAC-3’，如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列为5’-ACAGAAGGAGAACCTTTGCGG-3’，如SEQ ID NO:2所示；扩增产物长度为113bp。

步骤(2)中所述待测鸡3号染色体rs313625170SNP位点的基因型为TT、TG或者GG。

步骤(3)中所述TT基因型是指3号染色体rs313625170SNP位点碱基为T的纯合子；GG基因型是指3号染色体rs313625170SNP位点碱基为G的纯合子；TG基因型是指3号染色体rs313625170SNP位点碱基为T和G的杂合子。

本发明的有益效果为：本发明的SNP分子标记与鸡喙畸形性状相关，是一个新的分子标记，通过确定待测鸡的SNP位点的基因型对鸡喙畸形性状进行剔除，降低喙畸形发生概率，可以提高动物福利，减少养殖损失，具有很大的经济应用价值和科研价值。

附图说明

图1为鸡正常喙和畸形喙的图，其中，a图为畸形喙，b图为正常喙。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：rs313625170位点SNP分子标记与鸡喙畸形性状相关性的确认

试验材料：

采取病例-对照(case-control)试验设计，即分为鸡喙畸形组和正常组，比较两组之间基因型差异，找出与鸡喙畸形性状相关的位点。待测群体来自北京畜牧兽医研究所昌平试验基地，从北京油鸡群体中，挑选48个喙畸形个体和48个正常个体。

一、SNP分子标记的检测

1.基因组DNA的提取

(1)血样的采集

用翅下静脉采血法采集试验鸡只个体血液样品1.0mL，置于已加入0.2mL ACD抗凝剂的离心管中，混合均匀后于-20℃保存，以备基因组DNA的提取。

(2)基因组DNA的提取

①用移液器吸取30μL抗凝血，放入1.5mL离心管中，加入600μL SDS裂解液，10分钟后加入15μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃气浴震荡消化过夜。

②加入600μL Tris饱和酚，颠倒混匀10min，放置分层，如上层有块状物则需继续颠倒混匀，直到上层无块状物，12000rpm离心10min。

③吸取上层透明的水相溶液转移至另一1.5mL干净的离心管中，注意不要搅拌下层的酚-蛋白层。

④加入600μL酚:氯仿(1:1)溶液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

⑤吸取上清液放入另一1.5mL干净的离心管中。加入600μL氯仿溶液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

⑥吸取上清液放入另一1.5mL干净的离心管中，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混合，可见白色絮状物，12000rpm离心10min，倒掉乙醇。

⑦加入0.5mL已-20℃预冷的70％乙醇，洗涤2-3次。

⑧干燥DNA样品，加入100-200μL灭菌双蒸水充分溶解DNA。

⑨用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，使用分光光度计进行浓度测定。

⑩用双蒸水将DNA浓度调整至50ng/μL左右，-20℃保存，备用。

2.基因分型

取各待测鸡的基因组DNA，采用美国昂飞公司的600K Affymetrix^TM>

二、鸡喙畸形性状的全基因组关联分析

利用可针对case-control的混合群体进行分析的ROADTRIP(V1.2)(Thornton andMcPeek,2010)软件中的RM test模型进行基于单个SNP的全基因组关联分析。同时，为减少多重检验带来的假阳性率，以基于连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)修正的Bonferroni校正方法(Johnson et al.,2010；Nicodemus et al.,2005)对GWAS分析结果进行多重检验校正。独立检验数计算同样利用indep-pairwise命令，阈值为0.2。

结果表明，3号染色体正义链88,472,831位的rs313625170SNP分子标记与鸡喙畸形性状显著相关。

实施例2：个体rs313625170SNP位点基因型与鸡喙畸形性状的关联分析

试验材料：

采取病例-对照(case-control)试验设计，即分为鸡喙畸形组和正常组，比较两组之间基因型差异，找出与鸡喙畸形性状相关的位点。待测群体来自北京畜牧兽医研究所昌平试验基地，从北京油鸡群体中，挑选性状特征明显的48个喙畸形个体和48个正常个体。

一、SNP分子标记的检测

1.基因组DNA的提取

(1)血样的采集

用翅下静脉采血法采集试验鸡只个体血液样品1.0mL，置于已加入0.2mL ACD抗凝剂的离心管中，混合均匀后于-20℃保存，以备基因组DNA的提取。

(2)基因组DNA的提取

①用移液器吸取30μL抗凝血，放入1.5mL离心管中，加入600μL SDS裂解液，10分钟后加入15μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃气浴震荡消化过夜。

②加入600μL Tris饱和酚，颠倒混匀10min，放置分层，如上层有块状物则需继续颠倒混匀，直到上层无块状物，12000rpm离心10min。

③吸取上层透明的水相溶液转移至另一1.5mL干净的离心管中，注意不要搅拌下层的酚-蛋白层。

④加入600μL酚:氯仿(1:1)溶液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

⑤吸取上清液放入另一1.5mL干净的离心管中。加入600μL氯仿溶液，颠倒混匀10min，12000rpm离心10min。

⑥吸取上清液放入另一1.5mL干净的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混合，可见白色絮状物，12000rpm离心10min，倒掉乙醇。

⑦加入0.5mL已-20℃预冷的70％乙醇，洗涤2-3次。

⑧干燥DNA样品，加入100-200μL灭菌双蒸水充分溶解DNA。

⑨用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，使用分光光度计进行浓度测定。

⑩用双蒸水将DNA浓度调整至50ng/μL左右，-20℃保存，备用。

2.基因分型

取各待测鸡的基因组DNA，采用一对特异性引物进行PCR扩增，引物序列信息见表1，PCR扩增体系见表2，PCR扩增条件见表3。

表1 引物序列表

引物名称序列序列表对应编号上游引物5’-ATGTGGGAACTAAGGGGACAC-3’SEQ ID NO:1下游引物5’-ACAGAAGGAGAACCTTTGCGG-3’SEQ ID NO:2

表2 PCR扩增体系

试剂体积(μL)ddH₂O8.02×Taq Plus Master Mix10.0上游引物(10μM)0.5下游引物(10μM)0.5基因组DNA1.0Total20.0

表3 PCR扩增条件

扩增产物通过一代测序，即Sanger测序，用Chromas软件查看和分析rs313625170SNP位点的基因型。结果如表4所示。

表4鸡rs313625170SNP位点基因型及等位基因在正常和喙畸形鸡群体中的分布

二、基因型与喙畸形性状关联分析

采用SAS统计分析软件的FREQ过程对鸡rs313625170SNP位点基因型在正常和喙畸形鸡群体中的分布进行卡方检验，P<0.05表明差异显著。结果如表5所示。

表5位点rs313625170在正常群体和喙畸形群体中基因型分布差异比较

由表5可以看出，正常群体和喙畸形群体中该位点基因型的分布有显著差异(P<0.0001)，其中正常群体中以TT基因型为主，喙畸形群体中以GG基因型为主。

实施例3：应用rs313625170位点基因型进行北京油鸡喙畸形性状净化效果

试验材料：

选择北京畜牧兽医研究所昌平试验基地同一批次孵化出雏的北京油鸡Y系家系群体1249只，其中育雏公鸡206只，母鸡1043只。

一、喙畸形性状表型测定

在28日龄前对鸡喙性状进行肉眼观察，计数发生喙畸形的个体，结果如表6所示。该世代(计为G1代)公鸡中畸形率为2.43％，母鸡中畸形率为1.44％，公母混合群体畸形率为1.60％。

表6在28日龄前G1中通过表型鉴定的喙畸形和正常个体数量及比例

性状公鸡(个数)公鸡(率)母鸡(个数)母鸡(率)公母混合(只数)公母混合(率)喙正常20197.57％102898.56％122998.40％喙畸形52.43％151.44％201.60％合计20610431249

二、表型观测喙正常个体后代畸形发生率

在29周龄，将肉眼观测的喙形态正常的北京油鸡母鸡994只和公鸡183只(该数字与28日龄正常个体数的差异来自饲养期间个体的死亡等)，进行混精交配，收集10天种蛋，累计5312个，人工孵化，出雏3906只(记为G2-1代)。通过翻肛鉴别公母，分别饲养。

在G2-1代出雏至28日龄期间，对喙形态进行观测，计数喙畸形个体，结果如表7所示。G2-1代公鸡中畸形率为2.02％，母鸡中畸形率为1.52％，公母混合群体畸形率为1.77％。

表7在28日龄前G2-1群体中喙畸形和正常个体数量及比例

性状公鸡(个数)公鸡(率)母鸡(个数)母鸡(率)公母混合(只数)公母混合(率)喙正常189397.98％194498.48％383798.23％喙畸形362.02％301.52％691.77％合计193219743906

三、rs313625170SNP位点基因型分型和有害基因型个体剔除

1.基因组DNA提取

在G1代36周龄，将肉眼观测的喙形态正常的北京油鸡母鸡990只和正常公鸡179只(该数字与28日龄正常个体数的差异来自饲养期间个体的死亡等)，采集个体翅下静脉血，提取基因组DNA，方法同实施例1。

2.rs313625170SNP位点基因型分型和有害基因型个体剔除

以个体基因组DNA为模板，检测rs313625170SNP位点基因型。方法同实施例2。分型结果如表8所示。

将G1群体中rs313625170SNP位点基因型为GG和TG型基因型个体从交配体系中剔除。

表8 G1代鸡rs313625170SNP位点基因型分布

3.基因型剔除后个体繁育G2-2世代

将TT基因型个体(即138只公鸡和740母鸡)进行混精交配，收集10天种蛋，累计4842个，人工孵化，出雏3714只(记为G2-2代)。通过翻肛鉴别公母，分别饲养。

在雏鸡出雏至28日龄期间，对喙形态进行观测，计数喙畸形个体，结果如表9所示。G2-2代公鸡中畸形率为0.16％，母鸡中畸形率为0.21％，不区分性别，畸形率为0.19％。G2-2世代中喙畸形发生率仅相当于G2-1中的十分之一。

表9在28日龄前G2-2群体中喙畸形和正常个体数量及比例

性状公鸡(个数)公鸡(率)母鸡(个数)母鸡(率)公母混合(只数)公母混合(率)喙正常182399.84％188499.79％370799.81％喙畸形30.16％40.21％70.19％合计182618883714

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种与鸡喙畸形性状相关的分子标记及其应用

<130> FII180033

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> 人工序列

<223> 上游引物

<400> 1

atgtgggaac taaggggaca c 21

<210> 2

<211> 21

<212> 人工序列

<223> 下游引物

<400> 2

acagaaggag aacctttgcg g 21