水稻OsBBTI4蛋白基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用

摘要

本发明公开了水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4在提高水稻抗稻瘟病上的应用，所述水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4的cDNA核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为SEQ ID No.1的简并序列。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。转入的胰蛋白酶抑制剂还通过抑制蛋白酶的水解，保护其他的蛋白不被降解，有效提高植物防御能力。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻OsBBTI4蛋白基因在提高水稻抗稻瘟病上应用。

背景技术

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)普遍存在于自然界的动物、植物和微生物中。目前，研究较多的胰蛋白酶抑制剂主要来源于人类主要的粮食，如豆科和乔本科等，在十字花科中也有报道。而在动物界中，动物的血液、胰脏，以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有胰蛋白酶抑制剂的存在。

蛋白酶抑制剂可分为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属蛋白酶抑制剂4大类。而胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor，Serpin)家族。其中研究最为广泛和深入的是Kunitz型抑制剂及Bowman-Birk型抑制剂两类，分别是库尼兹胰蛋白酶抑制剂(Kunitz type Trypsin inhibitor，简称KTI)和鲍曼-贝尔克胰蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk type Trypsin inhibitor，简称BBTI)。

Bowman-Birk起源于Kunitz，并将其取代之。Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(BBTI)于1946年自大豆中分离获得。该Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂的分子质量大约为8kD，富含半胱氨酸，包含2个反应位点及7个二硫键。2个反应位点分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反应位点的单边结构呈现环状结构。一环状结构为胰蛋白酶结合区域含有4个二硫键，可抑制胰蛋白酶的活性，而另一环状结构为胰凝乳蛋白酶的结合区，存在3个二硫键，可与胰凝乳蛋白酶相结合抑制其活性。由于分子内富含二硫键和亚基间的极性相互作用，这些BBTI的热稳定性和酸碱稳定性较好。

基于胰蛋白酶抑制剂结构和生化功能的广泛研究，而近些年来人们也注意到了胰蛋白酶抑制剂的生物学功能，包括：抗真菌、抗病毒和抗癌作用，并广泛开展了这方面的相关研究。

在抗病毒方面，Evandro等自豆类中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，该抑制剂可以抑制对HIV-1增殖至关重要的HIV-1反转录酶的活性，从而使得此胰蛋白酶抑制剂具有了抑制HIV-1增殖的可能性。Ye等发现来自蚕豆的Bowman-Birk型抑制剂也同样具有抑制HIV-1反转录酶活性的作用。这些研究都说明胰蛋白酶抑制及具有抑制病毒增殖的可能性。

在抗真菌方面，胰蛋白酶抑制剂主要在玉米中被广泛研究。研究发现，在玉米中，玉米胰蛋白抑制剂可以抑制黄曲霉菌的生长和孢子的萌发，被称作是一种抗真菌蛋白。并且认为这种抑制活性可能与寄主自身抑制黄曲霉素产生有关。也有报道称，当有病原物存在时，该胰蛋白酶抑制剂可以抑制病原菌的淀粉酶的活性，从而使病原真菌无法汲取营养，导致病原菌无法存活，从而抑制病原菌的正常生长。因此，胰蛋白酶抑制剂确实参与了植物的抗病性途径。并且激素茉莉酸处理或伤害处理后，胰蛋白酶抑制剂都有明显的诱导表达，这些研究都证明了胰蛋白酶抑制剂确实参与了植物的抗病信号途径，并且与JA信号转导存在交互作用。

因此，我们不难发现，植物中的胰蛋白酶抑制剂具有多种生物学功能，如抗病毒，抗真菌和抗虫的生物学功能。同时，胰蛋白酶抑制剂调控了多种病原菌侵染引起的植物抗病信号通路。

但是，水稻中的胰蛋白酶抑制剂研究甚少，水稻中的胰蛋白酶抑制剂对病原真菌的的生物学功能研究也未见任何报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种水稻OsBBTI4蛋白基因新的用途。

本发明的技术方案为：水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4在提高水稻抗稻瘟病上的应用，所述水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4的cDNA核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为SEQ ID No.1的简并序列。

水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4编码的多肽在提高水稻抗稻瘟病上的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种提高水稻抗稻瘟病的方法，将水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4进行克隆并构建植物表达载体，将该表达载体转入农杆菌，然后接种至水稻，选择具有抗稻瘟病抗性的超表达株及其后代，水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4的cDNA核苷酸序列为SEQID No.1所示或为SEQ ID No.1的简并序列。

进一步地，上述所述的一种提高水稻抗稻瘟病的方法中，表达载体为pCXUN。

进一步地，上述所述的一种提高水稻抗稻瘟病的方法中，农杆菌为EHA105。

对获得的转基因植株进行qRT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。打孔接种了生长至5-8周大时的转基因水稻植株，10-14天调查病情。一致的结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。转入的胰蛋白酶抑制剂还通过抑制蛋白酶的水解，保护其他的蛋白不被降解，有效提高植物防御能力。

附图说明

图1为pCXUN表达载体图谱；

图2为转基因水稻中OsBBTI4的表达量分析。WT表示野生型，OsBBTI4-OX-7-6和OsBBTI4-OX-16-2表示两个超表达株系；

图3为OsBBTI4-OX转基因植株增强了对稻瘟菌生理小种RB22的抗病性；

图4为OsBBTI4-OX转基因植株接种后发病病斑面积显著减少；

图5为OsBBTI4-OX转基因植株病斑区域的真菌生物量显著降低。

具体实施方式

实施例1

1)总RNA的提取

选用水稻粳稻品种日本晴，待水稻幼苗长至两周左右，立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5ml EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。

2)水稻胰蛋白酶抑制剂蛋白基因OsBBTI4的克隆和植物表达载体的构建

设计两端引物：

P1：5-ATGAGCAACACCACCATGGC-3(SEQIDNo.3)，

P2：5-CTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3(SEQ ID No.4)

将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Taq酶72℃保温10min末端加A后，回收目的片段。同时，用限制性内切酶XcmI酶切pCXUN载体，然后回收酶切后的载体片段，进一步将OsBBTI4克隆到双元表达载体pCXUN(图1)，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确。

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体pCXUN-OsBBTI4转入农杆菌菌株EHA105，进一步转入水稻粳稻品种日本晴，对获得的转基因植株进行qRT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价(图2)。

实施例2

OsBBTI4-OX转基因株系抗病性鉴定：

打孔接种：待转基因水稻长至5-8周叶龄时，挑选倒二叶进行稻瘟菌打孔接种，然后将水稻放在植物生长箱中黑暗培养24小时后，转移至12小时光照，12小时黑暗条件下生长10-14天；观察病斑扩展情况，调查病情，统计病斑面积和生物量，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病转基因植株。

结果发现与野生型(WT)相比，OsBBTI4超表达转基因植株增强了对稻瘟菌生理小种RB22的抗病性(图3)，同时，统计了转基因株系和野生型发病叶片的相对病斑面积(表1)和相对真菌生物量(表2)，具体表现为OsBBTI4超表达转基因植株接种后发病病斑面积仅为对照的50％左右(图4)，病斑区域的真菌生物量下降为对照的20％左右(图5)。

表1转基因株系和野生型发病叶片的相对病斑面积

表2转基因株系和野生型发病叶片的相对生物量

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

序列表

<110> 申请人名称:中国农业科学院植物保护研究所

<120> 水稻OsBBTI4蛋白基因在提高水稻抗稻瘟病上应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgagcaaca ccaccatggc tatttccacc atccttctct tcctcctcgc cggcctcgtc 60

gccgcccacg gcgacggcga caccatgatc cgtctcccaa gcgacggcgc cgaagcacca 120

ccacgcccgc ccaaaccctg ggactgctgc gacaacatcg agatgtcccc gctcgagatc 180

ttcccgccgc tgtaccgctg caacgacgag gtgaagcagt gctccgccgc ctgcaaggag 240

tgcgtggagg cgcccggcga cttcccccgc ggcgccttcg tgtgccgcga ctggtactcg 300

acggtggacc cgggccacat gtgcacggcg ccggatcagc cgacgacgaa gaggccgtgg 360

aagtgctgtg acagcatcgt gcagctgccg cagaggatct tcccgccgtt ctggcgctgc 420

gacgacgagc tggagcccgg caagtgcacc gccgcgtgca agtcgtgcag ggaggcgccg 480

gggccgttcc cggggccgct catctgcgag gacgtctact ggggcgccga cccgggcccc 540

ttgtgcacgc cgcggccatg ggggaaatgc tgcgacaagg ccttctgcaa caagatgaac 600

ccgccgacct gccgctgcat ggacgaggtg aacaagtgcg ccgccgcgtg caaggattgc 660

cagcgtgtgg agtcgtcaga gccgcctcgc tacgtctgca aggaccgctt caccggccag 720

cccgggccca tgtgcaaacc ccgagcggag aactag 756

<210> 2

<211> 251

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ser Asn Thr Thr Met Ala Ile Ser Thr Ile Leu Leu Phe Leu Leu

1 5 1015

Ala Gly Leu Val Ala Ala His Gly Asp Gly Asp Thr Met Ile Arg Leu

202530

Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ala Pro Pro Arg Pro Pro Lys Pro Trp Asp

354045

Cys Cys Asp Asn Ile Glu Met Ser Pro Leu Glu Ile Phe Pro Pro Leu

505560

Tyr Arg Cys Asn Asp Glu Val Lys Gln Cys Ser Ala Ala Cys Lys Glu

65707580

Cys Val Glu Ala Pro Gly Asp Phe Pro Arg Gly Ala Phe Val Cys Arg

859095

Asp Trp Tyr Ser Thr Val Asp Pro Gly His Met Cys Thr Ala Pro Asp

100 105 110

Gln Pro Thr Thr Lys Arg Pro Trp Lys Cys Cys Asp Ser Ile Val Gln

115 120 125

Leu Pro Gln Arg Ile Phe Pro Pro Phe Trp Arg Cys Asp Asp Glu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Lys Cys Thr Ala Ala Cys Lys Ser Cys Arg Glu Ala Pro

145 150 155 160

Gly Pro Phe Pro Gly Pro Leu Ile Cys Glu Asp Val Tyr Trp Gly Ala

165 170 175

Asp Pro Gly Pro Leu Cys Thr Pro Arg Pro Trp Gly Lys Cys Cys Asp

180 185 190

Lys Ala Phe Cys Asn Lys Met Asn Pro Pro Thr Cys Arg Cys Met Asp

195 200 205

Glu Val Asn Lys Cys Ala Ala Ala Cys Lys Asp Cys Gln Arg Val Glu

210 215 220

Ser Ser Glu Pro Pro Arg Tyr Val Cys Lys Asp Arg Phe Thr Gly Gln

225 230 235 240

Pro Gly Pro Met Cys Lys Pro Arg Ala Glu Asn

245 250

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcaaca ccaccatggc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagttctcc gctcggggtt 20