一种超高效合相色谱-串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法

摘要

本发明属于分析化学领域和农药残留检测技术领域，具体是一种超高效合相色谱‑串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法，涉及多种手性农药的外消旋体的拆分及定量方法。该方法采用QuEChERS方法提取烟草及干果中的甲霜灵和烯酰吗啉，用合相色谱手性固定相结合三重四极杆串联质谱同步检测了甲霜灵和烯酰吗啉2种手性农药的对映体。本发明首次采用合相色谱快速的对甲霜灵和烯酰吗啉进行手性分离，灵敏度高。以超临界CO

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域和农药残留检测技术领域，具体是一种超高效合相色谱-串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法，涉及多种手性农药的外消旋体的拆分及定量方法。

背景技术

目前使用的农药中有25％是手性的，手性农药的生物活性存在对映体差异性，其活性往往只存在于一个或少数几个对映体中，而手性农药的对映体在环境中的消解和归趋往往也有明显的不同。即手性农药对映体在自然环境和生物体中的活性、毒性以及吸收、代谢、降解等诸多方面可能存在巨大差异。

农药甲霜灵，化学名D,L-(2,6-二甲基苯基)-N-(2’-甲氧基乙基)氨基丙酸甲酯，是一种易被植物吸收、上行传导的高效杀菌剂。该农药市售品为其R、S的外消旋体。但是药理研究表明，甲霜灵的主要杀菌效果来自于R体。侯经国等【分析化学，2003，31(3),307-310】采用手性色谱柱经高效液相色谱分离了甲霜灵的一组对映体，但是该方法手性柱合成繁琐，分离时间长。烯酰吗啉通常存在顺、反异构体（Z和E异构体），Z异构体有杀菌功能，属有效成份。其中 E异构体在水中的溶解度是Z异构体的两倍，除物理性质不同外,其光谱效应和离子化效率也存在差异【农药学学报，2011，13(2),169-173】。

上述甲霜灵和烯酰吗啉的结构式如下所示：

这两类农药也是常用于防治烟草黑胫病，在烟草中检出率较高，因而建立甲霜灵和烯酰吗啉对映体纯度的测定方法对于开发生产R体甲霜灵和Z型烯酰吗啉单一产品和生产厂家进行产品质量控制是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用合相色谱-串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法，该方法能快速、准确的将外消旋的甲霜灵和烯酰吗啉的一组对映体进行分离，并且可以准确定量，基质干扰少，环境友好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种超高效合相色谱-串联质谱技术拆分、测定手性农药甲霜灵和烯酰吗啉对映体的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；样品可为烟草、谷物或干果。

(2)检测条件：将待测样品进行合相色谱-串联质谱检测，根据洗脱峰保留时间、目标化合物定量离子对和定性离子对分离各个洗脱峰，即得到各个手性农药对映体，

a、合相色谱检测条件如下：色谱柱：规格150 mm×3.0 mm，2.5µm的 ACQUITY UPC²Trefoil>2/乙醇，流速：2mL/min；梯度洗脱；>

b、所述的梯度洗脱方式如下：初始至第2分钟CO₂和乙醇的体积比由99%:1%变成92%:8%;>2和乙醇的体积比从92%:8%变成88%:12%;第3.5分中到第4分钟CO₂和乙醇的体积比从88%:12%变成70%:30%;第4分钟到第5.5分钟CO₂和乙醇的体积比从77%:30%变成99%:1%;第5.5分钟到第8分钟CO₂和乙醇的体积比为99%:1%;

c、所述根据洗脱峰保留时间和母离子/子离子的质荷比特征分离各个洗脱峰的方法如下：

保留时间为3.05分钟、定量离子对为280.1/192.1、定性离子对为280.1/220.1的洗脱峰即为S-甲霜灵；

保留时间为3.16分钟、定量离子对为280.1/192.1、定性离子对为280.1/220.1的洗脱峰即为R-甲霜灵；

保留时间为7.56分钟、定量离子对为388.1/165.0、定性离子对为388.1/300.9的洗脱峰即为E-烯酰吗啉；

保留时间为7.70分钟、定量离子对为388.1/165.0、定性离子对为388.1/300.9的洗脱峰即为Z-烯酰吗啉；

(3)检测方法：配制R-甲霜灵和E-烯酰吗啉的基质混合标准工作溶液，按照步骤(2)提供的色谱和质谱条件进行分离，并记录每种对映体对应的峰面积，以每种对映体的浓度值为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到R-甲霜灵和E-烯酰吗啉的一元线性回归方程；

将待测样品按照前述方法进行分离，并记录每种对映体对应的峰面积；将每种对映体对应的峰面积代入上述一元线性回归方程，即得到待测样品中各对映体的浓度。

在本发明中，步骤(1)中的样品前处理过程具体如下：准确称取2 g研磨后的粉末样品于50 mL具盖离心管中，加入10mL水，泡发后加入10 mL乙腈，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡5 min；然后向离心管中加入5g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠至离心管中，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡5 min，然后以6000 rpm速率离心3 min；移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，并加入50 mg C18和50 mg中性氧化铝，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2min，以6000 rpm 速率离心3 min；吸取上清液经0.45 μm有机相滤膜过滤，用乙腈稀释2倍，即为待测样品溶液。

步骤(2)中的质谱条件中，离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描；毛细管电压为2.6KV；离子源温度150℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气体流速800 L/h；锥孔气体流速50 L/h；补偿溶剂0.1%甲酸甲醇溶液，流速为0.2 mL/min；

每种农药的去簇电压和碰撞能量如下：

甲霜灵定量离子对和定性离子对的去簇电压均为26V，碰撞能量分别为17V和13V；

烯酰吗啉定量离子对和定性离子对的去簇电压均为41V，碰撞能量分别为30V和20V。

步骤(3)中的所述的各种农药的一元线性回归方程如下：

R-甲霜灵：Y=329X+879,线性范围为25ng/mL-500ng/mL，线性相关系数0.9998;

E-烯酰吗啉：Y=932X+4854,线性范围为25ng/mL-500ng/mL，线性相关系数0.9996。

步骤(3)中，配制基质混合标准工作溶液的具体方法如下：分别称取10 mg的R-甲霜灵和E-烯酰吗啉标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成每种农药的单一标准储备液；移取一定量各农药的单一标准储备液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度配得混合标准储备液；分别移取混合标准储备液25μL, 50μL, 100μL, 250μL , 500μL及1000μL到6个10 mL容量瓶中，用乙腈定容，制得标准工作溶液；然后分别移取上述标准工作溶液500 μL与500μL的空白样品基质溶液混合，配制成基质混合标准工作溶液。

步骤(3)中的空白样品基质溶液的制备方法如下：准确称取2 g研磨后的空白样品于50 mL具盖离心管中，加入10mL水，泡发后加入10 mL乙腈，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡5 min。然后向离心管中加入5g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1g 柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠至离心管中，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡5 min，然后以6000 rpm速率离心3 min；移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，并加入50 mg C18和50 mg中性氧化铝，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000rpm 速率离心3 min；吸取上清液经0.45 μm有机相滤膜过滤，滤液备用。

本发明首次采用合相色谱结合串联质谱实现了甲霜灵和烯酰吗啉2种手性农药的分离分析。该方法采用多糖型手性固定相的色谱柱，在合相色谱系统上拆分了上述手性农药对映体，考察了不同的流动相组成、系统背压等对拆分的影响，优化了分离条件。再对每个农药的质谱参数进行了优化，建立了同步分离甲霜灵和烯酰吗啉手性农药对映体的分析方法。最后用上述对映体拆分方法，样品以乙腈为萃取溶剂提取后，提取液经净化后进UPC²-MS/MS分析，甲霜灵和烯酰吗啉对映体获得了良好的分离及测定。该方法中甲霜灵和烯酰吗啉的最低检测限分别为0.0015和0.0018mg/kg。本发明采用超临界CO₂为流动相，节省了大量有机溶剂的使用，绿色环保。本发明方法使用合相色谱快速分析，有利于同分异构体的分离，减少假阳性的结果，分析速度快，耗时仅仅8分钟，灵敏度高。

附图说明

图1：甲霜灵和烯酰吗啉标准溶液的UPC²-MS/MS选择离子色谱图（该图作为摘要附图）。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

乙腈、甲醇、乙醇均为色谱级试剂，柠檬酸钠、氯化钠均为分析纯试剂；蒸馏水，符合GB/T 6682中一级水的要求。

Waters TQD四极杆串联质谱仪；水浴恒温振荡器；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）。

2．样品处理：

准确称取2 g研磨后的谷物样品于50 mL具盖离心管中，加入10mL水，泡发后加入10 mL乙腈，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000 rpm 速率振荡5 min。然后向离心管中加入5g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠至离心管中，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000 rpm速率振荡5 min，然后以6000 rpm速率离心3 min；移取上清液1.0 mL于1.5 mL离心管中，并加入50 mg C18和50 mg中性氧化铝，于漩涡混合振荡仪上以2000 rpm速率振荡2 min，以6000 rpm 速率离心3 min。吸取上清液经0.45 μm有机相滤膜过滤，用乙腈稀释2倍。进超高效合相色谱串联质谱（UPC²-MS/MS）检测；所测样品优选为烟草及谷物。

3.检测条件：合相色谱检测条件如下：色谱柱：规格150 mm×3.0 mm，2.5µm的ACQUITY UPC² Trefoil>2/乙醇，流速：2mL/min；梯度洗脱；>2和乙醇的体积比由99%:1%变成92%:8%;>2和乙醇的体积比从92%:8%变成88%:12%;第3.5分中到第4分钟CO₂和乙醇的体积比从88%:12%变成70%:30%;第4分钟到第5.5分钟CO₂和乙醇的体积比从77%:30%变成99%:1%;第5.5分钟到第8分钟CO₂和乙醇的体积比为99%:1%;

质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描；毛细管电压为2.6KV；离子源温度150℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气体流速800 L/h；锥孔气体流速50L/h；补偿溶剂0.1%甲酸甲醇溶液，流速为0.2 mL/min；甲霜灵定量离子对为388.1/165.0、定性离子对为388.1/300.9，定量离子对和定性离子对的去簇电压均为26V，碰撞能量分别为17V和13V；烯酰吗啉定量离子对为280.1/192.1、定性离子对为280.1/220.1，定量离子对和定性离子对的去簇电压均为41V，碰撞能量分别为30V和20V；

4.测定方法: 将已知浓度的R-甲霜灵和E-烯酰吗啉标准溶液混合，用空白样品基质稀释2倍，按照前述提供的色谱和质谱方法进行分离，并记录每种对映体对应的峰面积，以每种对映体的浓度值为自变量，以其对应的峰面积为因变量，得到一元线性回归方程。

将待测样品按照前述提供的方法进行分离，并记录每种对映体对应的峰面积；将每种对映体对应的峰面积代入一元线性回归方程，得到所述待测样品中E-烯酰吗啉和Z-烯酰吗啉的浓度分别为1.22和0.45 mg/kg。

为判断方法的准确性，在此样品中加入1.0 µg的E-烯酰吗啉标准溶液，进行同上的样品前处理，以UPC²-MS/MS测得分析物的选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中的E-烯酰吗啉含量为2.18>

实例2：

如实施例1所述，选择另一烟草样品，样品中S-甲霜灵和R-甲霜灵含量分别为1.42和0.88mg/kg。