一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法

摘要

本发明提供了一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法，包括以下步骤：吸取聚苯乙烯胶乳颗粒悬液，水洗干燥后得胶乳颗粒并称重；取多聚甲醛和30％盐酸混合搅拌，其中多聚甲醛、聚苯乙烯胶乳颗粒以及盐酸的重量比为1‑2：1：1‑2；加入聚苯乙烯胶乳颗粒，搅拌均匀后加入聚苯乙烯胶乳颗粒0.1倍重量的二氯化锰，25℃下保温8‑15分钟后加入少量醋酸酐和氯代环己烷，混合反应2‑4小时，离心弃去溶液，加入10％的盐酸和三聚甲醛混合液避光贮存备用。本发明工艺方法简单，反应物和反应产物毒性小，且制得的氯甲基化聚苯乙烯胶乳相比羧基化微球更稳定且保存时间更长，不需要活化可以直接进行抗体的偶联。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法。

背景技术

在免疫检测领域的一般情况下，首先将抗原抗体反应形成免疫复合物，然后用浊度法定量测定，但形成抗原-抗体复合物需要较长时间。胶乳增强免疫浊度测定法(简称LETIA)是近年来免疫检测领域出现的一种新的免疫检测技术，通过将胶乳偶联上抗体后可以改变抗体的反应度，使免疫沉淀反应得到增强，称为胶乳增强免疫比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒(免疫胶乳)，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成凝集颗粒，凝集物的形成使反应混合系统形成一定浊度，浊度增加的程度与标本中被检物浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测出标本中被检物的含量。LETIA不需要特殊仪器，自动、半自动生化分析仪即可测定，适宜在广大基础医疗单位推广应用。目前已被应用于许多分析物定量测定有数十种之多，如ASO、RF、CRP、转铁蛋白、弓形体、风疹、β2-微球蛋白及药物监测等。

目前LETIA检测试剂所采用的的乳胶颗粒多是羧基化微球，表面修饰的乳胶粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基与抗体的氨基端共价结合，但羧基化微球保存时间较短，容易变异；羧基化微球的报道较多，但有关氯甲基化微球的研究报道较少，目现有制备氯甲基化的技术中多采用氯甲醚对聚苯乙烯树脂进行氯甲基化，即在催化剂作用下，由聚苯乙烯交联微球与氯甲醚直接或间接反应制得，但是氯甲醚有严重的致癌毒性，易对操作人员健康产生危害，不宜长期大面积使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法，工艺方法简单，反应物和反应产物毒性更小，对人和环境都更友好，且制得的氯甲基化聚苯乙烯胶乳相比羧基化微球及氨基化微球保存时间更长，更稳定。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、吸取聚苯乙烯胶乳颗粒悬液，水洗干燥后得到胶乳颗粒，并对所述聚苯乙烯胶乳颗粒进行称重；

步骤2、取多聚甲醛和盐酸混合搅拌，升温后回流冷却，其中所述多聚甲醛、聚苯乙烯胶乳颗粒以及盐酸的重量比为1-2∶1∶1-2(优选地，所述多聚甲醛、聚苯乙烯胶乳颗粒以及盐酸的重量比为2∶1∶2)；

步骤3、加入所述步骤1中称量好的聚苯乙烯胶乳颗粒，搅拌均匀后，加入相当于所述聚苯乙烯胶乳颗粒0.1倍重量的二氯化锰作为第一催化剂，25℃下保温8-15分钟后(优选地，保温时间为10分钟)，加入少量醋酸酐和氯代环己烷作为第二催化剂，混合反应2-4小时(优选地，混合反应时间为3小时)；

步骤4、反应完成后，离心，弃去溶液，加入10％的盐酸和三聚甲醛混合液避光贮存备用。

对于上述技术方案的进一步改进，当需将所述步骤4得到的氯甲基化聚苯乙烯胶乳稀释到固体浓度低于1％时，需使用含0.05-0.1％表面活性剂SDS的pH7.0的磷酸盐缓冲液将胶乳体稀释至浓度为0.5％至1％的固体。

对于上述技术方案的进一步改进，所述步骤2中取多聚甲醛和盐酸混合搅拌后，升温至65℃回流3h，温度逐渐上升至85℃左右，回流结束，冷至4℃。

对于上述技术方案的进一步改进，所述步骤2中的浓盐酸的质量分数为30％或10％。

本发明具有的有益效果：本发明提供的一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法，工艺方法简单，反应物和反应产物毒性更小，对人和环境都更友好，且制得的氯甲基化聚苯乙烯胶乳相比羧基化微球及氨基化微球保存时间更长，更稳定，且制得的氯甲基化聚苯乙烯胶乳不需要活化可以直接进行抗体的偶联，操作简单。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法的流程图；

图2为本发明实施例提供的氯甲基化聚苯乙烯胶乳与抗体偶联的反应方程式。

具体实施方式

实施例1

1.1氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备

(1)吸取聚苯乙烯胶乳颗粒悬液100mL，水洗干燥后称重得到1g胶乳颗粒；

(2)取聚苯乙烯胶乳重量2倍的多聚甲醛和重量2倍的30％盐酸混合搅拌，升温至65℃回流3h，温度逐渐上升至85℃左右，回流结束，冷至4℃。

(3)回流后的反应液中加入称量好的聚苯乙烯胶乳颗粒，搅拌均匀后，加入胶乳颗粒0.1倍重量的二氯化锰作为催化剂，25℃下保温10分钟后，加入醋酸酐和氯代环己烷后混合，反应3小时。

(4)离心，弃去溶液，胶乳加入10％盐酸和三聚甲醛混合液避光贮存备用。

1.2制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳马上进行抗体偶联

将所述实施例1得到的氯甲基化聚苯乙烯胶乳进行抗体偶联，制备肌红蛋白抗体胶乳颗粒，操作步骤如下：

(1)当稀释到固体浓度低于1％时，可能需要使用含0.05-0.1％表面活性剂SDS的pH7.0的磷酸盐缓冲液。确保稀释后的分散均匀，不存在聚集体。同时确保稀释的胶乳的pH值不超过pH 7.0，否则在加入配体之前可能过早发生CH2-Cl键的裂解。

(2)将胶乳悬液和抗体溶液(pH调节至7.0)混合。

(3)通过加入0.1M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至pH8.5。

(4)继续搅拌反应混合物至少4小时。

(5)清洗，并用存储缓冲液重新分散，pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液可以用作储存缓冲液。重复洗涤步骤一次，并用存储缓冲液重新分散。再分散可能需要搅拌，摇动，涡旋和超声处理。

1.3制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳6个月后进行抗体偶联

实施例1制备的活化胶乳保存6个月后再偶联肌红蛋白抗体制备的肌红蛋白抗体胶乳颗粒，操作步骤如上。

实施例2

2.1氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备

(1)吸取聚苯乙烯胶乳颗粒悬液，水洗干燥后称重；

(2)取聚苯乙烯胶乳重量1倍的多聚甲醛和聚苯乙烯胶乳重量1倍的10％盐酸混合搅拌，升温至65℃回流5h，温度逐渐上升至90℃左右，回流结束，冷至4℃；

(3)回流后的反应液中加入称量好的聚苯乙烯胶乳颗粒，搅拌均匀后，加入胶乳颗粒0.1倍重量的二氯化锰作为催化剂，25℃下保温10分钟后，加入醋酸酐和氯代环己烷后混合，反应3小时；

(4)离心，弃去溶液，胶乳加入10％盐酸和三聚甲醛混合液避光贮存备用。

2.2制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳马上进行抗体偶联

将所述实施例2得到的氯甲基化聚苯乙烯胶乳进行抗体偶联，制备肌红蛋白抗体胶乳颗粒，操作步骤如下：

(1)当稀释到固体浓度低于1％时，可能需要使用含0.05-0.1％表面活性剂SDS的pH7.0的磷酸盐缓冲液。确保稀释后的分散均匀，不存在聚集体。同时确保稀释的胶乳的pH值不超过pH 7.0，否则在加入配体之前可能过早发生CH2-Cl键的裂解。

(2)将胶乳悬液和抗体溶液(pH调节至7.0)混合。

(3)通过加入0.1M NaOH溶液将反应混合物的pH调节至pH8.5。

(4)继续搅拌反应混合物至少4小时。

(5)清洗，并用存储缓冲液重新分散，pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液可以用作储存缓冲液。重复洗涤步骤一次，并用存储缓冲液重新分散。再分散可能需要搅拌，摇动，涡旋和超声处理。

2.3制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳6个月后进行抗体偶联

实施例2制备的活化胶乳保存6个月后再偶联肌红蛋白抗体制备的肌红蛋白抗体胶乳颗粒，操作步骤如上。

实施例3：对比例

3.1采用现有技术的刚制备好的羧基胶乳偶联抗体

操作步骤如下，以4mL活化胶乳偶联抗体为例：

(1)配制试剂

①、配制PH＝5.0的50mM MES缓冲液(活化)；

②、配制PH＝6.0的50mM MES缓冲液(偶联)；

③、配制100mg/ml的NHS溶液；

④、配制50mg/ml的EDAC溶液；

⑤、胶乳:NHS:EDAC＝10:15:3；

⑥、清洗液：1mM HCl,100ml，4℃预冷；

⑦、偶联缓冲液：0.2M NaHCO3+0.5M NaCl,pH 8.3,50ml；

(2)活化羧基胶乳：

①、在1.5mL的离心管中加入pH5.0 50mM的MES缓冲液690μL；

②、加入100μL 10％的胶乳，涡旋混匀；

③、加入150μL的NHS溶液；

④、加入60μL的EDAC，涡旋混匀；

⑤、恒温(30℃)摇床上活化200rpm 30min；

⑥、恒温(30℃)摇床上封闭200rpm 2h，之后置于4℃冰箱贮存；

(2)肌红蛋白抗体的偶联：

①、准确称取40mg抗体溶于4.0ml 0.2M NaHCO3+0.5M NaCl，pH 8.3缓冲液，溶解完全后备用。

②、将约4ml NHS活化胶乳用4℃预冷的1mM HCl洗3-5次后抽干，再用0.2M NaHCO3+0.5M NaCl,pH 8.3清洗2次，抽干后将4ml NHS活化胶乳(约3.0g)加入到10ml的反应器(磨口三角瓶或离心管)中(注意：清洗后应立即使用)。

③、将抗体溶液加入到活化胶乳中，反应温度恒定在4℃(或室温/25℃)，摇床中振荡混合(离心管水平放置)，转速120rpm，反应过夜(或5h)。

④、反应停止后，静置，取上清离心(3000g，5min，室温)，收集上清液用于未偶联抗体的浓度分析(可采用Bradford、Lowry、BCA法，NHS在280nm有强吸收，不能采用OD280测定蛋白浓度)，计算偶联的抗体的配基密度；将其余料液转移到砂芯漏斗中用去离子水清洗、抽干。

⑤、封闭未反应的NHS：将4ml抽干的抗体亲和胶乳加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml 0.5mol/L乙醇胺+0.5M NaCl，pH 8.3溶液(或0.1mol/LTris-HCl，pH 8.3)。反应温度恒定在4℃(或室温/25℃)，搅拌速度120rpm，反应过夜(或5h)。反应停止后将料液转移到砂芯漏斗中抽干，用去离子水清洗。

⑥、清洗

将制得的抗体偶联胶乳依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5M NaCl的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH 8.0)和去离子水充分洗涤(重复交替清洗3次)，抽干，去除未反应的配基。

⑦、保存

制得的肌红蛋白抗体偶联胶乳保存于4℃溶液中。

3.2采用现有技术的制备完6个月后的羧基胶乳偶联抗体

操作步骤如3.1中所述。

实验例：对比分析实验

实验组1：将所述实施例1中的1.2制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳马上进行抗体偶联得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

实验组2：实施例1中的1.3制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳6个月后进行抗体偶联得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

实验组3：实施例2中的2.2制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳马上进行抗体偶联得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

实验组4：实施例2中的2.3制备完后的氯甲基化聚苯乙烯胶乳6个月后进行抗体偶联得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

实验组5：实施例3中的3.1采用现有技术的刚制备好的羧基胶乳偶联抗体得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

实验组6：实施例3中的3.2采用现有技术的制备完6个月后的羧基胶乳偶联抗体得到的肌红蛋白抗体胶乳颗粒。

对所述1-6实验组用蛋白检测试剂盒进行检测目的蛋白的浓度，其中，试剂盒所含的试剂为：R1：0.05mol/L PBS缓冲液，2.5％PEG6000,0.5％NaN3；R20.2％兔抗人血红蛋白抗体包被胶乳颗粒，0.1％NaN3；抗原标准品：试剂盒检测标准品。

操作步骤如下：将冷藏保存的蛋白检测试剂盒恢复到室温，向9组0.5mL的EP管均加入R1 225μL，然后分别加入在实验组1-6的待测测样品8μL、标准品组8ul、设空白对照组(只加R1)，再加R2 75μL,枪头混匀，37℃反应10min，用生化仪在600nm波长处检测A值。以标准品浓度为横坐标，A600值作为纵坐标绘制浓度标准曲线，建立回归方程，把检测质控品的A600值代入回归方程，计算样品目的蛋白浓度。其中，每个实验组做3个重复。

通过各组目的蛋白浓度的检测结果进行分析，计算分析实施例1(实验组1和实验组2)、实施例2(实验组3和实验组4)和实施例3(实验组5和实验组6)的批内变异系数和批间变异系数。

实验组组内变异系数实验组12.1％～3.2％实验组22.7％～3.5％实验组32.5％～5.7％实验组45.5％～8.7％实验组53.7％～9.1％实验组69.7％～15.1％

表一

实施例每组实施例6个月后的变异系数实施例1(实验组1与实验组2对比)8.6％～12.3％实施例2(实验组3与实验组4对比)10.6％～17.2％实施例3(实验组5与实验组6对比)16.5％～20.3％

表二

由表一可知，实验组1-实验组6中每组内进行比较，实验组1实验组2的变异系数最小；实验组5和实验组6的变异系数最大。

由表二可知，将实施例1中的实验组1与实验组2进行比较，将实施例2中的实验组3与实验组4进行比较，将实施例3中的实验组5与实验组6进行比较，其中，实施例1变异系数最小，实施例3变异系数最大。

因此，本实施例1中提供的一种氯甲基化聚苯乙烯胶乳的制备方法检测的目的蛋白变系数最小，保存的时间最长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。