一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法

摘要

本发明涉及一种诱导骨髓干细胞向神经细胞分化的方法。属骨髓干细胞分化为神经干细胞的方法。本发明在实施过程中取自体的骨髓干细胞和嗅鞘细胞，可排除异性蛋白排斥反应，避免道德和伦理压力，减轻病人经济负担；培养过程中采取分阶段诱导骨髓干细胞分化，诱导神经细胞前体进一步分化为成熟细胞，从而获得生物性状稳定，体外存活时间长，分化成熟的神经细胞。在培养过程向培养基中加入一定量的海藻糖和蔗糖，意外的发现海藻糖和蔗糖的加入使细胞分化为神经前体细胞的比例增加，分化周期缩短，从而可以短时间内得到大批量的成熟神经细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及诱导干细胞治疗的技术领域，具体是一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)常导致患者肢体瘫痪、大小便失禁及性功能障碍，是一种严重影响患者身心健康的常见病、多发病。随着现代化交通和工业的快速发展，脊髓损伤的发病率正在逐年增加，美国年发病率为20-40人/百万人口，我国脊髓损伤的年发病率约为15-20人/百万，而最新数据显示北京地区年发病率已达到惊人的60人/百万。脊髓损伤的修复是长期困扰医学界的科学研究难题，外科干预手段(包括骨折脱位复位、椎管减压、血肿清除等)与药物(如大剂量甲基强的松龙冲击疗法)治疗脊髓损伤的疗效十分有限。随着现代细胞和分子生物学技术的进步，科学家们尝试通过细胞移植的方法将体外培养的细胞植入脊髓损伤处以替代缺失的神经细胞，分泌促进神经再生的神经营养因子，保护神经元减少继发损伤，并与宿主神经系统整合，重建功能性突触，促进脊髓功能恢复，目前已经取得巨大的进展，成为极具前景的脊髓再生手段。

目前用于脊髓损伤修复的种子细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、雪旺氏细胞、嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞等。其中胚胎干细胞、神经干细胞、雪旺氏细胞均不同程度存在取材困难、定向分化不确定、涉及伦理道德等问题，难以应用于临床。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，又称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells)，来源于中胚层未分化的间充质细胞，具有向多种中胚层组织细胞分化的能力，如分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等。近年来发现BMSCs具有跨胚层分化的潜力，如分化为内胚层来源的心肌细胞，外胚层来源的神经细胞等。跨胚层分化能力的发现为BMSCs的应用创造了更广阔的前景，BMSCs移植修复中枢神经损伤诸如脑缺血、帕金森病、创伤性脑脊髓损伤的研究已经相继展开。BMSCs具有来源丰富、取材简便、易于体外扩增及能定向诱导分化等特点，且可进行自体移植而避免免疫排斥反应与伦理道德争论，因此通过移植BMSCs治疗SCI已经成为目前脊髓再生研究领域的热点。

尽管未分化与分化的BMSCs均可被用来修复脊髓损伤，但是经诱导预分化的BMSCs可能更适合用于细胞移植，因为BMSCs经预分化后形成的神经样细胞能更好地与脊髓神经损伤部位进行整合，修复病灶，且预分化后的BMSCs处于有丝分裂后期，可减少成肿瘤的几率。

目前用于体外诱导BMSCs向神经细胞分化的方法主要包括化学制剂法与生长因子组合法两种，其主要缺点包括细胞转分化率不高，分化过程中常伴随细胞变性、坏死(常见于化学制剂法)，分化细胞稳定性较差、体外环境下维持时间短(常见于化学制剂法与生长因子组合法)，分化细胞中神经元与神经胶质细胞比例难以控制，因而临床应用价值低。

例如，中国专利申请200810059560.9中公开了一种黄芩苷在促进骨髓间充质干细胞体外定向分化方面的用途及方法，该申请提供了一种用中药单体化合物黄芩苷诱导骨髓干细胞分化的方法，该化合物虽然可以成功诱导干细胞分化但是化学品诱导过程一直备受争议，因为化学物质除了有诱导细胞分化的作用外还有毒素。而且化学制剂法诱导细胞分化过程中常伴随着细胞变性、坏死，细胞分化稳定性差，体外环境维持时间短等缺点。

又如中国专利申请200810020094.3中公开了一种用脑脊液诱导自体骨髓干细胞分化为神经细胞的方法，该申请提供了一种用自体血清代替胎牛血清，自体脑脊髓液替代原来的添加剂及刺激因子得到神经细胞的方法，但是该方法分化出的神经细胞多数为不成熟的神经前体细胞，成熟细胞比例较低，分化细胞表型维持时间短，继而可能影响移植后体内存活时间与作用时效。

本申请发明人长年致力于干细胞治疗领域的研究，曾首次探索将自体嗅粘膜来源的嗅鞘细胞(OECs)与BMSCs共培养，诱导BMSCs向神经样细胞分化，研究结果显示OECs能诱导BMSCs向神经细胞分化(Neuroscience Letters，2010，475(2)：99-103)。与以往的体外诱导方法比较，OECs共培养方式具有操作简便、细胞转分化率高的特点，而最大的优势则在于OECs与BMSCs均能通过自体获得，若应用于临床，可以避免免疫排斥反应与法律、伦理纠纷。然而，OECs共培养方式也存在与化学制剂法及生长因子组合法类似的缺陷，主要是分化细胞多数为未成熟的神经前体细胞，成熟神经细胞比例低；分化细胞表型维持时间短，继而可能影响移植后体内存活时间与作用时效；而以上两方面缺陷是影响BMSCs移植效果的最主要原因。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，又名FGF-2)是成纤维细胞生长因子家族一员，广泛分布于中胚层和神经外胚层来源的多种组织和器官，通过与组织特异性受体(FGFRs)结合，激活靶细胞内酪氨酸蛋白激酶而发挥作用，具有促进细胞增殖、分化、迁移等多种生物学效应，广泛参与血管生成、组织修复、肿瘤发生等生命过程。bFGF作为一种具有高效性和广谱性的重要的生长因子，近年来在中枢神经系统中的功能逐渐受到重视，bFGF/FGFRs体系对神经组织的主要作用体现在：神经发生、轴突生长、神经保护与再生等。

bFGF在神经系统发育及损伤修复中起重要作用，能促进神经组织来源的祖细胞或前体细胞增殖、并分化为成熟神经细胞，因此bFGF可以为神经细胞的分化提供应用思路。

然而，一方面，现有技术中，bFGF通常用于对神经组织来源的神经前体细胞的诱导分化。另一方面，体外细胞培养实验发现，除了必要的培养基条件外，添加bFGF明显促进BMSCs分裂增殖，并影响其向多谱系分化，如向神经细胞与成骨细胞分化。再一方面，bFGF如何加入诱导体系，采用何种条件进行诱导能够取得成熟神经细胞比例高与细胞表型维持时间长的效果目前仍处于未知状态。

因此，如何使用bFGF诱导非神经组织来源的骨髓基质干细胞高效地向神经细胞分化，形成更多的成熟神经细胞且形成的神经细胞表型维持时间长是本领域需要解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明用自体嗅鞘细胞诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化为神经前体细胞，并利用外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，又名FGF-2)促进神经前体细胞增殖分化，使BMSCs经OECs与bFGF阶梯式诱导后形成的神经样细胞，从而获得生物性状稳定，体外存活时间长，分化成熟的神经细胞。

本发明的目的在于提供一种能使骨髓干细胞定向分化为神经干细胞的新方法，为人类神经干细胞移植技术开辟新的途径。

本发明提供了一种诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化的方法，包括以下步骤：

(1)骨髓基质干细胞的培养；

(2)嗅鞘细胞的培养；

(3)骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养

将培养得到的骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养于Tranwells体系(非直接接触)中，模拟人体环境共培养在DMEM/F₁₂培养基中，骨髓基质干细胞培养在多聚赖氨酸处理的培养片上，嗅鞘细胞培养于孔径为0.4m的多孔膜的管芯中；每2-3天更换一次培养液，共培养两周，显微观察细胞形态学变化，并采用免疫组化与实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测神经元特异性标志物nestin、NSE、β-III-tubulin与MAP2，以及神经胶质细胞特异性标志物GFAP与p75^NTR的变化，证实经OECs体外诱导BMSCs向神经前体细胞分化，得到BMSCs来源的神经前体细胞；

(4)bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化

将步骤(3)得到的BMSCs来源的神经前体细胞接种于含有2-20ng/mLbFGF的DMEM培养基中，接种量为4-6×10⁵个细胞/mL培养基，培养时间为5-7天，得到成熟神经细胞。

上述方法的步骤(1)骨髓基质干细胞的培养可以采用本领域常规使用的任何方法培养得到传代骨髓基质干细胞。

上述方法步骤(2)嗅鞘细胞的培养可以采用本领域常规使用的任何方法培养得到传代嗅鞘细胞。

申请人在细胞培养的过程中意外发现在骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养的培养基中加入一定量的海藻糖和蔗糖，并控制海藻糖和蔗糖质量比为3：1，可以增加骨髓基质细胞分化得到的神经前体细胞中成熟神经细胞的比例，并且可以减少细胞凋亡。

所述的海藻糖的加入量为每升DMEM/F₁₂培养基中0.05-3mg；优选为0.05-2mg；进一步优选为0.05-1mg。

所述的蔗糖的加入量为每升DMEM/F₁₂培养基中0.02-1mg；优选为0.02-0.6mg；进一步优选为0.02-0.3mg。

同样，在步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化的含有2-20ng/mL bFGF的DMEM培养基中加入质量比为3：1的海藻糖和蔗糖，可以加快神经前体细胞向成熟细胞分化的速度，使神经前体细胞向成熟神经细胞分化的周期缩短，分化得到的成熟神经细胞稳定性好，可以在短时间内得到大批量的成熟神经细胞，并且得到的成熟神经细胞细胞体外环境维持时间长。

所述的海藻糖的加入量为每升DMEM培养基中加0.05-3mg；优选为0.05-2mg；进一步优选为0.05-1mg。

所述的蔗糖的加入量为每升DMEM培养基中加0.02-1mg；优选为0.02-0.6mg；进一步优选为0.02-0.3mg。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)取自体的骨髓干细胞和嗅鞘细胞，可排除异性蛋白排斥反应，避免道德和伦理压力，减轻病人经济负担；

(2)采取分阶段诱导骨髓干细胞分化，诱导神经细胞前体进一步分化为成熟细胞，从而获得生物性状稳定，体外存活时间长，分化成熟的神经细胞。

(3)在培养过程加入一定量的海藻糖和蔗糖，意外的发现海藻糖和蔗糖的加入使细胞分化为神经前体细胞的比例增加，分化周期缩短，从而可以短时间内得到大批量的成熟神经细胞。

具体实施方案

基础实施例

准备实验：

采用本领域常规使用的方法培养得到传代的骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞。

(1)骨髓基质干细胞的培养

(2)嗅鞘细胞的培养

(3)骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养

将上述步骤(1)和步骤(2)培养得到的骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养于Tranwells体系(非直接接触)中，模拟人体环境共培养在DMEM/F₁₂培养基中，在每升培养基中加入1.2mg的葡萄糖和0.4mg的蔗糖，骨髓基质干细胞培养在多聚赖氨酸处理的培养片上，嗅鞘细胞培养于孔径为0.4m的多孔膜的管芯中；每2-3天更换一次培养液，共培养两周，显微观察细胞形态学变化，并采用免疫组化与实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测神经元特异性标志物nestin、NSE、β-III-tubulin与MAP2，以及神经胶质细胞特异性标志物GFAP与p75^NTR的变化，证实经OECs体外诱导BMSCs向神经前体细胞分化，得到BMSCs来源的神经前体细胞；通过检测发现，培养2周后得到的神经前体细胞的比例占原骨髓基质干细胞的95％以上。

(4)bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化

将步骤(4)得到的BMSCs来源的神经前体细胞接种于含有15ng/mLbFGF的DMEM培养基中，在每升培养基中加入0.9mg的葡萄糖和0.3mg的蔗糖，接种量为4×10⁵个细胞/mL培养基，培养时间为5天，得到90％以上的成熟神经细胞。

动物实验

1、动物造模

选择雌性SD大鼠，体重250-300g，氯胺酮(90mg/kg)腹腔内注射麻醉，俯卧位固定于手术台上，显微镜下切开暴露胸10椎板并切除之，显露硬膜，采用Allens WD法，以10g×2.5cm致伤力损伤脊髓，造成脊髓挫裂伤模型。

2、细胞移植

动物分六组，分别为单纯BMSCs注射组、BMSCs+单次bFGF注射组、BMSCs+两次bFGF注射组、单纯bFGF注射组。均在造模术后4周，参照Bakshi等建立的方法经腰3-5椎间隙穿刺、蛛网膜下腔注射BMSCs或/和bFGF，其中BMSCs注射量为20μL(含10⁶个细胞)，bFGF注射量为150μg/kg，其中BMSCs+两次bFGF注射组在首次注射后1周，再次进行bFGF注射。

3、功能评价

模型大鼠在造模术前、造模术后及细胞移植术后1、2、4、8周行功能评价。功能评价采用Basso Beatlie Bresnahan运动功能评分。将实验大鼠放置于直径2m的圆形平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分三部分：第一部分0-7分，评判动物后肢各关节活动；第二部分8-13分，评判后肢的步态及协调功能；第三部分14-21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分，测试结果见下表1

表1

4、电生理测试

模型大鼠在造模术前、造模术后及细胞移植术后1、2、4、8周行SEP检查。麻醉后，将刺激电极捆扎于一侧下肢腓肠肌外的皮肤上，周围以温盐水湿润。经Nihon Kohden电刺激仪给予直流方波电脉冲刺激，强度为50mA，波宽0.1ms，频率3Hz。记录电极置于动物对侧感觉皮质表面，参考电极插入左额皮下。信号以FA292放大器放大，滤波带通100～1000Hz，平均200次，电脑采样并贮存信号。每只动物均测双下肢。

分析检测结果，将bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化得到的成熟神经细胞移植到大鼠体内，4周后进行SEP检查显示结果已基本恢复到造模术前的水平，8周后进行SEP检查显示结果已完全恢复到造模术前的水平。

为了进一步证明本发明提供的培养基具有缩短细胞培养时间，提高神经前体细胞，以及成熟神经细胞的比例的有点，又进行了以下对比试验。

对比实施例1-9

对比实施例1

与基础实施例的不同在于步骤(3)中DMEM/F₁₂培养基中不含葡萄糖和蔗糖，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的70％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为5天，得到65％左右的成熟神经细胞。

对比实施例2

与基础实施例的不同在于步骤(4)中DMEM培养基中不含葡萄糖和蔗糖，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的93％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为8天，得到70％左右的成熟神经细胞。

对比实施例3

与基础实施例的不同在于步骤(3)和步骤(4)中DMEM/F₁₂培养基和DMEM培养基中都不含葡萄糖和蔗糖，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的68％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为7天，得到41％左右的成熟神经细胞。

对比实施例4

与基础实施例的不同在于步骤(3)中DMEM/F₁₂培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1：1，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的85％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为5天，得到78％左右的成熟神经细胞。

对比实施例5

与基础实施例的不同在于步骤(4)中DMEM培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1：1，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的92％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为7天，得到73％左右的成熟神经细胞。

对比实施例6

与基础实施例的不同在于步骤(3)和步骤(4)中DMEM/F₁₂培养基和DMEM培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1∶1，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的83％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为6天，得到70％左右的成熟神经细胞。

对比实施例7

与基础实施例的不同在于步骤(3)中DMEM/F₁₂培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1∶5，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的76％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为5天，得到67％左右的成熟神经细胞。

对比实施例8

与基础实施例的不同在于步骤(4)中DMEM培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1∶5，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的92％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为5天，得到74％左右的成熟神经细胞。

对比实施例9

与基础实施例的不同在于步骤(3)和步骤(4)中DMEM/F₁₂培养基和DMEM培养基中葡萄糖和蔗糖的比例为1∶5，其他方法与步骤与基础实施例相同。

实验结果：步骤(3)中将骨髓基质干细胞和嗅鞘细胞共培养两周后神经前体细胞的比例占原细胞的76％，步骤(4)中bFGF诱导BMSCs来源的神经前体细胞的进一步分化培养时间为8天，得到69％左右的成熟神经细胞。

将各个实施例中神经前体细胞所占比例与成熟神经细胞所占比例列于下表2

表2

实例神经前体细胞所占比例％成熟神经细胞所占比例％基础实施例9590对比实施例17065对比实施例29370对比实施例36841对比实施例48578对比实施例59273对比实施例68370对比实施例77667对比实施例89274对比实施例97669

为了进一步证明本发明提供的方法培养可以得到性质优良的成熟神经细胞，对基础实施例以及对比实施例1-9中培养得到的成熟神经细胞细胞的表型维持时间进行分级，根据时间长短分别6个级别，表型维持时间最短的为1级，表型维持时间最长为6级，实验数据由下表3所示：

表3

通过上述数据可以看出，基础实施例制备的神经细胞表型维持时间明显长于对比实施例。而分化细胞表型维持时间短，继而可能影响移植后体内存活时间与作用时效，因此本发明提供的方法制备的神经细胞更具有实用性。

惟以上所述者，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施之范围，即大凡依本发明权利要求及发明说明书所记载的内容所作出简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明权利要求所涵盖范围之内。此外，摘要部分和标题仅是用来辅助专利文件搜寻之用，并非用来限制本发明之权利范围。