小麦条锈菌PSTG_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

摘要

本发明提供了小麦条锈菌PSTG_06025基因在小麦条锈病防治中的应用，所述PSTG_06025基因的序列如Seq ID No.1所示；所述的PSTG_06025基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将PSTG_06025基因作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_06025基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和作物分子育种技术领域，具体涉及小麦条锈菌PSTG_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法。

背景技术

小麦是我国第二大粮食作物，年均播种面积约为3.6亿亩。小麦产量的稳定与提高关系国计民生。然而多年来，真菌病害对小麦生产构成严重威胁，如锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病等病害的发生，严重影响小麦的产量和品质。其中，小麦条锈病俗称"黄疸"，是由专性寄生的条锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici)引起。在我国，小麦条锈发病猖獗，常年受害面积达6,000～8,000万亩(农业部文件：农农发2006-9)；发病严重年份造成大幅减产(20～30％)，威胁粮食安全。条锈菌存在有性生殖，毒性变异快，近年来新的优势小种持续出现，导致条锈病控制难度加大。小麦主要产区黄淮海麦区的条锈病发生面积有逐渐增加的趋势，2017年5月统计河南、山东、安徽等7省市累计发生面积超过4,000万亩(中国农业科技推广， 2017)。因此，有效防治条锈病对于我国粮食安全具有重要意义。

培育和种植抗病品种，是防治小麦条锈病经济、有效的重要措施。当前，我国多省的小麦品种审定已把是否具有条锈病抗性列为关键指标。提高抗性水平、培育持久抗性也已成为小麦新品种培育的重要目标。抗病品种的培育主要是通过抗条锈病基因的挖掘与利用，然而由于条锈菌生理小种毒性的快速变异，抗病基因大面积利用后可能会在短期内丧失抗病性。例如小麦育种上曾广泛使用的碧蚂一号、“洛类”、“繁6”衍生系等抗源，均已对当前流行小种失去抗性。对我国当前501 份主栽和后备品种的检测表明，不足30％的品种对当前流行小种表现抗病，而且其抗源主要集中在Yr26/Yr24等少数基因(韩德俊等，西北-华北-长江中下游条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病评价，中国农业科学，2010(43))。因此，拓宽小麦抗条锈病的抗源，开发新的条锈病防治策略，对于降低小麦条锈病大面积流行的风险具有重要意义。

小麦条锈菌由于其活体营养型及专性寄生特性，遗传转化困难；而且小麦本身同样难以开展遗传转化，因此小麦-条锈菌互作的遗传学研究困难很大，进展较慢。目前在小麦条锈菌中鉴定的侵染或致病关键基因数量较少，而且目前尚未有基因有效应用于小麦抗病育种。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦条锈菌基因作为分子靶标在麦类作物育种或条锈病防治中的应用以及一种利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：小麦条锈菌 PSTG_06025基因在小麦条锈病防治中的应用，所述PSTG_06025基因的序列如Seq ID No.1所示。

优选的，所述PSTG_06025基因作为转录抑制的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_06025基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。

优选的，将携带所述PSTG_06025基因的沉默表达载体导入麦类作物中获得抗条锈菌的麦类作物。

优选的，通过喷施所述PSTG_06025基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

优选的，所述PSTG_06025基因的转录抑制剂为能够抑制所述 PSTG_06025基因转录的dsRNA溶液。

优选的，通过喷施所述PSTG_06025基因的编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤： 1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得 PSTG_06025基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_06025基因片段构建小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体；所述PSTG_06025基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3) 采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。

优选的，步骤1)中所述PCR扩增用引物为CQM06025-F2和 CQM06025-R2引物；所述CQM06025-F2的序列如Seq ID No.3所示；所述CQM06025-R2引物的序列如Seq ID No.4所示。

优选的，步骤2)中所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体为包括潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar、PSTG_06025 基因片段的正向序列和PSTG_06025基因片段的反向序列的表达盒的载体。

优选的，所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体从 T-DNALeftBoarder到RightBoarder区段的序列如序列表Seq ID No.6 所示。

优选的，所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体的骨架为PC336。

本发明的有益效果：本发明首次发现所述的PSTG_06025基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，丰富了小麦条锈菌中侵染或致病的关键基因；将所述PSTG_06025基因应用于小麦条锈病防治中，将 PSTG_06025基因作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_06025基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

附图说明

图1为实施例1中沉默表达PSTG_06025的阳性转基因小麦除草剂筛选结果图；

图2为实施例1中抗条锈菌小麦PCR筛选检测结果；

图3为实施例2中抗条锈菌小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况图；图4为实施例2中抗条锈菌小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病图；

图5为实施例3中抗条锈菌小麦接种条锈菌后PSTG_06025基因的荧光定量表达分析结果图。

具体实施方式

本发明提供了小麦条锈菌PSTG_06025基因在小麦条锈病防治中的应用。在本发明中所述PSTG_06025基因的GenBank登录号为 KNF00609.1，所述PSTG_06025基因的序列如Seq ID No.1所示，基因序列长度为807bp，所述PSTG_06025基因编码氨基酸序列具有 CE4_MrCDA_Like结构域(cd10952)，具体序列如Seq ID No.2所示。

在本发明中，所述PSTG_06025基因优选的作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述 PSTG_06025基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。在本发明具体实施过程中，优选的通过以下三种方法来沉默PSTG_06025基因，以实现所述PSTG_06025基因在小麦条锈病防治中的应用：(一)将携带所述PSTG_06025基因的沉默表达载体导入麦类作物中，获得抗条锈菌的麦类作物；(二)通过喷施所述PSTG_06025基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖；所述转录抑制剂优选的为能够抑制所述PSTG_06025基因转录的dsRNA溶液；(三)通过喷施所述PSTG_06025基因编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤： 1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_06025基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_06025基因片段构建小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体；所述 PSTG_06025基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3) 采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。

本发明在扩增PSTG_06025基因片段前，优选的对PCR扩增引物进行设计。在本发明中，优选的以小麦条锈菌的全基因组序列为参考，以假定功能蛋白基因PSTG_06025(GenBank:KNF00609.1)的编码区序列为模板设计PCR引物；更优选的以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank登录号AJIL00000000.1或 BROAD下载链接 ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccin ia_striiformis_pst-78/)。本发明中，所述PCR扩增引物设计的方法采用本领域常规方法即可，具体的可采用引物设计软件来实现。在本发明中所述PCR扩增引物优选的为CQM06025-F2和CQM06025-R2引物；所述CQM06025-F2的序列如Seq ID No.3所示；所述 CQM06025-R2引物的序列如Seq ID No.4所示。

本发明在设计获得PCR扩增引物后，优选的对所述PCR扩增引物的扩增区段进行验证。所述验证具体的为用扩增区段的序列与小麦条锈菌PST-78全基因组数据和NCBI数据库中的小麦条锈菌序列进行比对，查看所述扩增区段的序列是否能够特异性靶标PSTG_06025基因。在本发明中上述PCR扩增引物的扩增区段序列，除其中一段 24bp序列(如Seq IDNo.11所示,具体为： GCAAATATCAGCACCTTATCGGCC，)与PSTG_06026基因序列一致外，未发现所述扩增区段的序列与其它基因存在长度大于20bp的 100％一致序列，表明利用CQM06025-F2/R2引物扩增区段的序列可以特异靶标PSTG_06025基因。

本发明中，以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行 PCR扩增获得PSTG_06025基因片段。在本发明中，优选的采用感染条锈菌生理小种CRY29后发病的小麦叶片制备cDNA；所述制备 cDNA的方法优选的采用常规TRIZOL法制备纯化RNA，并反转录获得cDNA。在本发明中，所述制备纯化RNA并反转录获得cDNA 分别采用RNA纯化试剂和反转录试剂盒。在本发明具体实施过程中，所述制备纯化RNA优选的采用天根生化科技(北京)有限公司，货号 DP405的试剂实现；所述并反转录获得cDNA优选的采用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号AT311-03。

本发明在获得感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA后，以所述cDNA为模板，进行PCR扩增获得PSTG_06025基因片段。在本发明中所述PCR扩增使用的酶优选的为高保真酶，更优选的为Phusion 高保真酶(Thermo Scientific公司，货号F-530S)；所述PCR扩增的体系和程序采用本领域常规的PCR扩增体系和程序即可，具体的在本发明实施过程中，所述PCR体系为：5X Phusion HF Buffer:10μl， Phusion DNA Polymerase:0.5μl，CQM06025-F2:1.5μl， CQM06025-R2:1.5μl，10mM dNTPs:1μl，Template DNA:1μl， ddH₂O:34.5μl；所述PCR程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，>

本发明在获得扩增产物后优选的对扩增产物进行分离和测序，本发明中所述分离采用本领域常规的分离方法即可；所述测序委托测序公司完成；本发明中所述扩增产物测序获得的序列如Seq ID No.5所示，与参考基因PSTG_06025的序列相似性100％。

本发明在获得PSTG_06025基因片段后，利用GATEWAY克隆技术构建小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体。在本发明中，所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体的构建方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D]. 山东农业大学,2013.)，具体的包括以下步骤：(A)将所述PSTG_06025 基因片段与入门载体连接后转入大肠杆菌感受态细胞获得阳性克隆质粒；(B)将所述阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架 PC336进行LR反应，同时将PSTG_06025基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。

在本发明中，优选的将所述PSTG_06025基因片段与入门载体连接；所述入门载体优选的为实验室改造的PC414C，与常规入门载体 pENTR-D-TOPO相比，PC414C插入了多克隆位点，可通过酶切、连接的方法实现定向克隆。具体连接PC414C与目标片段的方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D]. 山东农业大学,2013.)的材料与方法部分内容。本发明为利用 GATEWAY克隆技术，优选的在CQM06025-F2/R2引物序列上增加保护碱基和酶切位点获得改良后引物。优选的所述保护碱基连接在引物序列5’末端；所述保护碱基的数目优选的为2～4个；在本发明具体实施过程中，所述CQM06025-F2上的保护碱基优选的为CAA和CQM06025-R2上的保护碱基优选的为TCA。在本发明中，所述酶切位点优选的为NotI酶切位点和AscI酶切位点，所述CQM06025-F2 引物序列连接NotI酶切位点，所述CQM06025-R2引物序列连接AscI 酶切位点。

在本发明具体实施过程中，所述PSTG_06025基因片段与入门载体连接前，优选的将上述改良后引物扩增获得的包括PSTG_06025基因片段PCR扩增产物和入门载体PC414C进行NotI、AscI双酶切获得酶切产物，然后利用T4-DNA连接酶将纯化后的酶切产物(即 PSTG_06025基因片段和入门载体)进行连接获得连接产物。本发明在获得连接产物后，优选的将所述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选纯化后获得阳性克隆质粒DNA。在本发明中，筛选转化后的大肠杆菌感受态细胞获得所述阳性克隆质粒。本发明中所述筛选的方法优选的为菌落PCR；所述菌落PCR的引物优选的为 CQM06025-F2/R2；所述纯化阳性克隆质粒DNA优选的采用质粒 DNA试剂盒完成。本发明在获得阳性克隆的质粒DNA后，利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.) 进行LR反应，将PSTG_06025基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。本发明中，所述载体构建采用本领域常规的载体构建方法和程序，无其他特殊要求，能够获得RNAi 沉默表达载体即可。

本发明中获得的小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体编号为PC925，所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体上从 T-DNALB(LeftBoarder)到RB(RightBoarder)区段的序列优选的如Seq IDNo.6所示，所述T-DNA LB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列为包含顺次连接的潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar及PSTG_06025基因片段的正向序列和PSTG_06025 基因片段的反向序列的表达盒。

本发明在获得小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体后，采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_06025基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。本发明中受体材料优选的为高感小麦条锈病的品系CB037。本发明中所述转化的具体技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的小麦条锈菌PSTG_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)PCR扩增获得PSTG_06025基因片段

以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank 登录号AJIL00000000.1或BROAD下载链接 ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccin ia_striiformis_pst-78/)，以假定功能蛋白(hypothetical protein)基因 PSTG_06025(GenBank:KNF00609.1)的编码区序列为模板设计PCR 引物。正向引物序列CQM06025-F2如Seq ID No.3所示：5`-caagcggccgcGACGGTCCTTTCGATTTTGAG-3`；反向引物序列 CQM06025-R2如Seq ID No.4所示：5`- tcaggcgcgccATCTCCAGAATCGAATGTCCAG-3`。扩增区段长度369 bp。利用扩增区段的序列比对小麦条锈菌PST-78全基因组数据 (https://genome.jgi.doe.gov/Pucst_PST78_1/Pucst_PST78_1.home.html>

取材感染条锈菌生理小种CRY29后发病的小麦叶片，利用常规 TRIZOL法(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP405)纯化RNA，并制备cDNA(北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号 AT311-03)。使用Phusion高保真酶(Thermo Scientific公司，货号F-530S)使用引物CQM06025-F2和CQM06025-R2进行PCR扩增 (PCR体系：5X Phusion HFBuffer:10ul,Phusion DNA Polymerase: 0.5ul,CQM06025-F2:1.5ul,CQM06025-R2:1.5ul,10mM dNTPs:1ul, Template DNA:1ul,ddH₂O:34.5ul；PCR程序：98℃>

自CRY29分离得到的基因片段序列如Seq ID No.5所示，与参考基因PSTG_06025的序列相似性100％。

(二)小麦条锈菌基因PSTG_06025沉默表达载体的构建

为利用GATEWAY克隆技术构建基因沉默表达载体， CQM06025-F2/R2引物两端分别增加3个保护碱基(CAA、TCA)及 NotI酶切位点(GCGGCCGC)或AscI酶切位点(GGCGCGCC)，以连入改造后的入门载体PC414C(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL 的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)。PCR扩增产物及载体 PC414C首先进行NotI、AscI双酶切，酶切产物纯化后利用T4-DNA 连接酶进行连接。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD201)。利用引物CQM06025-F2/R2进行菌落PCR来筛选携带目的基因片段的阳性克隆，并纯化质粒DNA (天根生化科技(北京)有限公司，货号DP103)。

利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)进行LR反应，同时将PSTG_06025基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336以构建RNAi沉默表达载体。

LR反应体系：目的载体(150ng/μl)1μl；入门载体PC414C (50-150ng)1μl，ddH₂O>TM>2O>

小麦条锈菌基因PSTG_06025沉默表达载体上从T-DNA LB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列如序列表Seq ID No.6。其中包含潮霉素抗性基因(Hyg)、除草剂抗性基因(Bar)及两段方向相对的PSTG_06025基因片段的表达盒。

(三)普通小麦的遗传转化及后代筛选

小麦遗传转化采用基因枪介导转化法，受体材料选用高感小麦条锈病的品系CB037。技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。小麦授粉后 15天左右，挑选幼胚直径为1.5mm大小的幼胚剪取穗子剥取种子，表面消毒灭菌后剥取幼胚放置于高渗培养基上用基因枪轰击，再在诱愈培养基上23℃暗培养四周，每两周继代一次。四周后从诱愈培养基转到分化培养基，从分化培养基上愈伤开始放在光照培养(23℃， 16hlight，8h dark)。两周后从分化培养基上再转到分化培养基上，直到再生出幼苗。把分化出的苗取出放在生根培养基上，大约3-4周待根长壮就可以移栽到土里。

通过叶片涂抹除草剂初步筛选阳性转基因后代。除草剂为 AgrEvo公司产品Finale，货号F30617006，使用浓度为0.3％。3-5天后根据叶片涂抹部位的敏感程度筛选阳性转基因后代。

如图1所示，其中CB037为转基因受体，株系2446-1A、2491-2A 为阴性转基因单株；2491-2A-2、2546-6A、5670-4A为阳性转基因单株。阴性转基因材料的叶片涂抹部位明显黄化或干枯坏死，而阳性转基因材料的叶片涂抹部位稍微黄化、无明显干枯坏死。

同时，取材转基因小麦的叶片制备DNA及cDNA，利用引物 CQM06025-F2/R2、LB306F/CQM06025-R2进行PCR扩增对转基因材料进行筛选确认；如图2所示，A、B为以gDNA为模板的PCR 结果；A图PCR引物为CQM06025-F2/R2；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照；B图PCR引物为LB306F/CQM06025-R2，其中引物LB306F(Seq>2O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照。多数样品可产生与阳性对照(载体DNA)相同的扩增条带，表明来自阳性转基因材料。

实施例2抗条锈菌小麦条锈病抗性鉴定

小麦条锈菌新鲜孢子的繁殖：温室内种植感病品种辉县红，一叶一心期用注射器注射孢子水溶液接菌，然后用喷壶喷水并搭盖塑料薄膜进行保湿。为保证充分发病可重复接菌2-3次，每次间隔1周。孢子水溶液的准备：取干燥、冻存(-80℃)的孢子，用适量自来水悬浮至淡橙色，室温下置于摇床震荡混匀30min(180rpm)，然后注射接菌。接菌后约20天可见零星发病，大约30天后可见大量叶片发病，可收集大量新鲜孢子用于转基因材料的接种鉴定。

利用T_1:2世代(收获实施例1中第一代转基因材料的种子)种子在温室大棚内种植并接种小麦条锈菌，鉴定其条锈病抗性。种植前一周温室浇水浇透，晾晒一周左右。挑选15粒健康饱满的转基因种子均匀点播，行距25cm，行长1m。每隔十行种植2行转基因受体品种CB037。待生长至一叶一心期，取新鲜孢子进行接菌，接种后浇水并搭盖塑料布保持高湿环境。为了保证接种成功，初次接种后每隔一周进行重复接种，重复三次，每株至少接种三个分蘖。野生型CB037>

利用温室鉴定的抗病材料，收获T_2:3世代种子后，在人工气候箱内进行重复鉴定。取干净的9cm培养皿，内置3层圆形滤纸，加入>

如图3所示，其中A为野生型CB037，B为PC925转基因材料。温室种植T_1:2材料重复接菌三次之后，野生型CB037发病充分，叶片表面有大量孢子堆；而转基因材料叶片表面未见孢子堆产生，条锈病抗性效果明显。

如图4所示：T_2:3材料在培养箱内接菌12天后，野生型CB037>

实施例3抗条锈菌小麦中PSTG_06025基因的表达鉴定

小麦苗期叶片接菌12天后，野生型CB037叶片表面布满大量孢子堆。我们在小麦接菌后不同时期分别取CB037及转基因材料叶片约100mg，使用Trizol法提取RNA，制备cDNA用于实时荧光定量 PCR。引物序列为CQM06025-F3和CQM06025-R3，具体序列如序列表SeqIDNo.7、Seq IDNo.8所示。以小麦条锈菌α微管蛋白基因为内参(黄雪玲等，农业生物技术学报，2012，20(2)：181-187)，引物 TUBA-F/R序列如序列表SeqID No.9、Seq ID No.10所示。

PCR体系为：5μl 2×SYBR GreenMaster，正向与反向引物(10μM) 各1μl，1μlcDNA，2μl ddH2O，总体系为10μl。PCR反应采用两步法：95℃10min，40个循环的95℃15s，60℃1min。

利用2^－△△CT算法分析各个基因的表达，利用SigmaPlot12.5软件作图。

由上述实施例可知，本发明提供的PSTG_06025基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将所述PSTG_06025基因应用于小麦条锈病防治中，通过沉默所述PSTG_06025基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 小麦条锈菌PSTG_06025基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 1

atgaacacca ttctacgtct cagttttgta gtggcatttt ttttgctctc gtttatccaa 60

tccaggtcct tgaaaaaggc agctatagtt aaatacgctc ctccggctac tacctgctcg 120

cgtcctgggc tggtctctct gacctttgac gacggtcctt tcgattttga gacggagatc 180

tcggactacc tccatgcacg aaaaatccaa agcactttct ttgtgaacgg caataactgg 240

ggctgcatct atgacgagtc aatagtacaa caattgaaac acacattctc gcagggacac 300

ttgattggat cacacacttg gtcgcatgca aatatcagca ccttatcggc cgagcgatta 360

catcaagagc tcgacttaat tgaagaagcg ttgatcaaaa ttataggagc gaagcccaaa 420

ttctttcgtc ctccttacgg tagctacgat cagaagagcc tggggatatt gaaagagcga 480

ggttatgttg tggccaactg gacattcgat tctggagatg ctgtcggtgc gactcccgag 540

caatcaatag ggggttacag gaatctagca aaaaagttcc catcctcgca gatcaccctc 600

aatcatgaga cttaccaaac cactgcagaa aaggtgattc cgtatgcagt tccccttcta 660

caaaaggctg gctataggct tgtccatatg tcggagtgct tggggacagg aaccaatata 720

aacgatcttt accaatggat tggaaagccc tccgaaagag acgcatcatg gacctgtgca 780

ggaaaaccgg tcgccggccc agactga 807

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> Puccinia striiformis f. sp. tritici PST-78

<400> 2

Met Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Phe Val Val Ala Phe Phe Leu Leu

1 5 1015

Ser Phe Ile Gln Ser Arg Ser Leu Lys Lys Ala Ala Ile Val Lys Tyr

202530

Ala Pro Pro Ala Thr Thr Cys Ser Arg Pro Gly Leu Val Ser Leu Thr

354045

Phe Asp Asp Gly Pro Phe Asp Phe Glu Thr Glu Ile Ser Asp Tyr Leu

505560

His Ala Arg Lys Ile Gln Ser Thr Phe Phe Val Asn Gly Asn Asn Trp

65707580

Gly Cys Ile Tyr Asp Glu Ser Ile Val Gln Gln Leu Lys His Thr Phe

859095

Ser Gln Gly His Leu Ile Gly Ser His Thr Trp Ser His Ala Asn Ile

100 105 110

Ser Thr Leu Ser Ala Glu Arg Leu His Gln Glu Leu Asp Leu Ile Glu

115 120 125

Glu Ala Leu Ile Lys Ile Ile Gly Ala Lys Pro Lys Phe Phe Arg Pro

130 135 140

Pro Tyr Gly Ser Tyr Asp Gln Lys Ser Leu Gly Ile Leu Lys Glu Arg

145 150 155 160

Gly Tyr Val Val Ala Asn Trp Thr Phe Asp Ser Gly Asp Ala Val Gly

165 170 175

Ala Thr Pro Glu Gln Ser Ile Gly Gly Tyr Arg Asn Leu Ala Lys Lys

180 185 190

Phe Pro Ser Ser Gln Ile Thr Leu Asn His Glu Thr Tyr Gln Thr Thr

195 200 205

Ala Glu Lys Val Ile Pro Tyr Ala Val Pro Leu Leu Gln Lys Ala Gly

210 215 220

Tyr Arg Leu Val His Met Ser Glu Cys Leu Gly Thr Gly Thr Asn Ile

225 230 235 240

Asn Asp Leu Tyr Gln Trp Ile Gly Lys Pro Ser Glu Arg Asp Ala Ser

245 250 255

Trp Thr Cys Ala Gly Lys Pro Val Ala Gly Pro Asp

260 265

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcggccg cgacggtcct ttcgattttg ag 32

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaggcgcgc catctccaga atcgaatgtc cag 33

<210> 5

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacggtcctt tcgattttga gacggagatc tcggactacc tccatgcacg aaaaatccaa 60

agcactttct ttgtgaacgg caataactgg ggctgcatct atgacgagtc aatagtacaa 120

caattgaaac acacattctc gcagggacac ttgattggat cacacacttg gtcgcatgca 180

aatatcagca ccttatcggc cgagcgatta catcaagagc tcgacttaat tgaagaagcg 240

ttgatcaaaa ttataggagc gaagcccaaa ttctttcgtc ctccttacgg tagctacgat 300

cagaagagcc tggggatatt gaaagagcga ggttatgttg tggccaactg gacattcgat 360

tctggagat 369

<210> 6

<211> 8459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

cccggtcggc atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca 360

ctatcggcga gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt 420

tgtgtacgcc cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc 480

caagctgcat catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg 540

cggagcatat acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag 600

tagcgcgtct gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc 660

tcgtattggg aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca 720

ttgtccgtca ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg 780

cagtcctcgg cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg 840

tcgtccatca cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca 900

cgccatgtag tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg 960

ctaagatcgg ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc 1020

agttcggttt caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag 1080

gtcaggctct cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat 1140

gcaaagtgcc gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc 1200

aggacatatc cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag 1260

agctgcatca ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc 1320

gcggtgagtt caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag 1380

agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 1440

tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 1500

gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 1560

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga 1620

acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact 1680

gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt 1740

accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc 1800

ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa 1860

gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 1920

ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat 1980

ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa 2040

tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg 2100

tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg 2160

ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 2220

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2280

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2340

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2400

acgaattccc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg 2460

cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa 2520

acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc 2580

aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt 2640

tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgggtcat cagatctcgg tgacgggcag 2700

gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca 2760

gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc 2820

gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc 2880

ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg 2940

gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt 3000

ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac ctcgccgtcc acctcggcga cgagccaggg 3060

atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc cgtccactcc tgcggttcct gcggctcggt 3120

acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta gtggttgacg atggtgcaga ccgccggcat 3180

gtccgcctcg gtggcacggc ggatgtcggc cgggcgtcgt tctgggctca tggtagatcc 3240

ccggggatcc tctagagtcc cccgtgttct ctccaaatga aatgaacttc cttttccact 3300

atcttcacaa taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt 3360

accctttgtt gaaaagtctc aattgccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattt 3420

ttggagtaga caagtgtgtc gtgctccacc atgttgacga agattttctt cttgtcattg 3480

agtcgtaaga gactctgtat gaactgttcg ccagtcttta cggcgagttc tgttaggtcc 3540

tctatttgaa tctttgactc catggccttt gattcagtgg gaactacctt tttagagact 3600

ccaatctcta ttacttgcct tggtttgtga agcaagcctt gaatcgtcca tactggaata 3660

gtacttctga tcttgagaaa tatatctttc tctgtgttct tgatgcagtt agtcctgaat 3720

cttttgactg catctttaac cttcttggga aggtatttga tttcctggag attattgctc 3780

gggtagatcg tcttgatgag acctgctgcg taagcctctc taaccatctg tgggttagca 3840

ttctttctga aattgaaaag gctaatctgg ggacctgcag gcatgcaagc ttgcatgcct 3900

gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 3960

ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 4020

tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 4080

tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 4140

attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 4200

ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 4260

ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 4320

cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 4380

aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 4440

ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 4500

agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg 4560

gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 4620

ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 4680

caggcggcct cctcctcctc tcacggcacg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct 4740

ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc 4800

cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc 4860

gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc 4920

tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg 4980

tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg 5040

tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat 5100

ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg 5160

gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc 5220

ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 5280

atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 5340

gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 5400

ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 5460

ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 5520

tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 5580

tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 5640

gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 5700

aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 5760

tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 5820

acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 5880

acttctgcag gtcgactcta gaggatcccc cgggggtacc gggccccccc tcgaggtcat 5940

caccactttg tacaagaaag ctgggtcggc gcgccatctc cagaatcgaa tgtccagttg 6000

gccacaacat aacctcgctc tttcaatatc cccaggctct tctgatcgta gctaccgtaa 6060

ggaggacgaa agaatttggg cttcgctcct ataattttga tcaacgcttc ttcaattaag 6120

tcgagctctt gatgtaatcg ctcggccgat aaggtgctga tatttgcatg cgaccaagtg 6180

tgtgatccaa tcaagtgtcc ctgcgagaat gtgtgtttca attgttgtac tattgactcg 6240

tcatagatgc agccccagtt attgccgttc acaaagaaag tgctttggat ttttcgtgca 6300

tggaggtagt ccgagatctc cgtctcaaaa tcgaaaggac cgtcgcggcc gcggagcctg 6360

cttttttgta caaacttgtg ataagggcga attctgcaga tatccatcac actggcggcc 6420

gctcgagcat gcatctagtg gatcccccgg gctgcaggaa ttcgatcgag tgaagatccc 6480

tttcttgtta ccgccaacgc gcaatatgcc ttgcgaggtc gcaaaatcgg cgaaattcca 6540

tacctgttca ccgacgacgg cgctgacgcg atcaaagacg cggtgataca tatccagcca 6600

tgcacactga tactcttcac tccacatgtc ggtgtacatt gagtgcagcc cggctaacgt 6660

atccacgccg tattcggtga tgataatcgg ctgatgcagt ttctcctgcc aggccagaag 6720

ttctttttcc agtaccttct ctgccgtttc caaatcgccg ctttggacat accatccgta 6780

ataacggttc aggcacagca catcaaagag atcgctgatg gtatcggtgt gagcgtcgca 6840

gaacattaca ttgacgcagg tgatcggacg cgtcgggtcg agtttacgcg ttgcttccgc 6900

cagtggcgcg aaatattccc gtgcaccttg cggacgggta tccggttcgt tggcaatact 6960

ccacatcacc acgcttgggt ggtttttgtc acgcgctatc agctctttaa tcgcctgtaa 7020

gtgcgcttgc tgagtttccc cgttgactgc ctcttcgctg tacagttctt tcggcttgtt 7080

gcccgcttcg aaaccaatgc ctaaagagag gttaaagccg acagcagcag tttcatcaat 7140

caccacgatg ccatgttcat ctgcccagtc gagcatctct tcagcgtaag ggtaatgcga 7200

ggtacggtag gagttggccc caatccagtc cattaatgcg tggtcgtgca ccatcagcac 7260

gttatcgaat cctttgccac gcaagtccgc atcttcatga cgaccaaagc cagtaaagta 7320

gaacggtttg tggttaatca ggaactgttc gcccttcact gccactgacc ggatgccgac 7380

gcgaagcggg tagatatcaa gcttatcgat accgtcatca caagtttgta caaaaaagca 7440

ggctccgcgg ccgcgacggt cctttcgatt ttgagacgga gatctcggac tacctccatg 7500

cacgaaaaat ccaaagcact ttctttgtga acggcaataa ctggggctgc atctatgacg 7560

agtcaatagt acaacaattg aaacacacat tctcgcaggg acacttgatt ggatcacaca 7620

cttggtcgca tgcaaatatc agcaccttat cggccgagcg attacatcaa gagctcgact 7680

taattgaaga agcgttgatc aaaattatag gagcgaagcc caaattcttt cgtcctcctt 7740

acggtagcta cgatcagaag agcctgggga tattgaaaga gcgaggttat gttgtggcca 7800

actggacatt cgattctgga gatggcgcgc cgacccagct ttcttgtaca aagtggtgat 7860

aagggcgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg aatttccccg 7920

atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 7980

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 8040

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 8100

cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 8160

tgttactaga tcgggaattc gatatcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 8220

gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 8280

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 8340

aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt 8400

aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgttta 8459

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaatccagg tccttgaaaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtccctgcga gaatgtgtgt 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggacccac gctgccaata acta 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggagtcccg aacaattatc cgc 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 11

gcaaatatca gcaccttatc ggcc 24

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacctcgcaa ggcatattg 19