蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中的应用

摘要

本发明公开了蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中的应用。所述蛋白质PpPYL2为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。实验证明，向野生型衣藻CC‑1690wild type mt+[21gr]中导入所述蛋白质PpPYL2的编码基因，得到的转基因植物的抗逆性增加。因此，蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

自然环境中的干旱和高盐等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成植物大规模减产。生物反应器是现代生物技术基因工程的细胞产物的生产者，就是将目的基因导入到生物体内，用其来生产目的基因的产物。很多植物被用作生物反应器，尤其是单细胞藻类植物。目前，作为生物反应器的藻类植物在产油、提取次生代谢物质、生产药物等方面的应用极为广泛，但是由于藻类植物在大规模培养过程中易受环境的影响而影响生长，且面临其它生物(如其它野生藻类)和各种病害的侵染，因此提高植物的抗逆性是急需解决的技术问题。

苔藓植物是5亿年前古奥陶纪出现的陆地先锋植物，其生活史中以“茎叶体”的配子体为主要营养生长阶段。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆时，必然要面对水分亏损和温度骤变两大胁迫。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于维管植物(如蕨类、种子植物)的逆境应对机制，如存在于苔藓植物细胞内的一些抗逆基因可以保护细胞免于逆境伤害。

小立碗藓是一种苔藓植物，是研究水生植物向陆生植物进化过程的理想物种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质PpPYL2为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2可由194个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质PpPYL2，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质PpPYL2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质PpPYL2的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质PpPYL2的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

所述编码所述蛋白质PpPYL2的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质PpPYL2的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质PpPYL2的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由585个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的蛋白质PpPYL2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质PpPYL2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质PpPYL2且具有蛋白质PpPYL2功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)小立碗藓；c4)衣藻；c5)野生型衣藻CC-1690wild type mt+[21gr]。

上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。

为解决上述问题，本发明还提供了培育抗逆性转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性转基因植物的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：提高受体植物中所述蛋白质PpPYL2的编码基因的表达量，得到抗逆性高于所述受体植物的转基因植物。

本发明所提供的培育抗逆性转基因植物的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质PpPYL2的活性，得到抗逆性高于所述受体植物的转基因植物。

上述方法中，所述蛋白质PpPYL2的编码基因可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质PpPYL2的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质PpPYL2的DNA分子。

上述方法中，所述受体植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)小立碗藓；c4)衣藻；c5)野生型衣藻CC-1690wild type mt+[21gr]。

上述方法中，所述抗逆性为抗盐性和/或抗旱性。

上述方法中，所述“提高受体植物中所述蛋白质PpPYL2的编码基因的表达量”或所述“提高受体植物中所述蛋白质PpPYL2的活性”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述蛋白质PpPYL2的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pChlam-PpPYL2。所述重组质粒pChlam-PpPYL2具体可为将载体pChlamiRNA3int1的限制性内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(载体pChlamiRNA3int1被限制性核酸内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列3所示的DNA分子。

所述方法在植物育种或制备生物反应器中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)小立碗藓；c4)衣藻；c5)野生型衣藻CC-1690wild type mt+[21gr]。

实验证明，本发明所提供的蛋白质PpPYL2能提高植物的抗逆性：与野生型衣藻或转空载体衣藻相比，转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性和抗盐性均有显著的提高。结果表明，可以利用蛋白质PpPYL2提高衣藻的抗逆性，对抗逆性新材料的选育具有重要作用。蛋白质PpPYL2在调控植物抗逆性中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为PCR扩增产物的电泳图。

图2为重组质粒pChlam-PpPYL2的结构示意图。

图3为转PpPYL2基因的衣藻巴龙霉素筛选前后对比图。

图4为分子检测结果。

图5为实时定量检测结果。

图6为生长曲线的绘制。

图7为在固体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗盐性。

图8为在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗盐性。

图9为在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗盐性。

图10为在固体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性。

图11为在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性。

图12为在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小立碗藓和BCD固体培养基均记载在如下文献中：Cove DJ，Perroud PF，CharronAJ，McDaniel SF，Khandelwal A，Quatrano RS.Isolation of DNA，RNA，and protein fromthe moss Physcomitrella patens gametophytes.Cold Spring Harb Protoc.2009Feb；2009(2):pdb.prot5146.doi:10.1101/pdb.prot5146.公众可从首都师范大学(即申请人处)获得小立碗藓，以重复本申请实验。

野生型衣藻CC-1690wild type mt+[21gr]为美国DUKE大学衣藻中心的产品(网址为http://www.chlamycollection.org/)，野生型衣藻CC-1690wild type mt+[21gr]在下文简称21gr或野生型衣藻或WT。

载体pChlamiRNA3int1记载于如下文献中：Molnar A，Bassett A，Thuenemann E，Schwach F，Karkare S，Ossowski S，Weigel D，Baulcombe D.Highly specific genesilencing by artificial microRNAs in the unicellular alga Chlamydomonasreinhardtii[J].Plant Journal，2009，58(1):165-174.

琼脂糖凝胶回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。RNeasy plantmini Kit为QIAGEN公司的产品。反转录试剂盒为TAKARA公司的产品。

TAP液体培养基：NH₄Cl>4·7H₂O>2·2H₂O>2HPO₄>2PO₄>3BO₄>4·7H₂O>2·4H₂O>2·6H₂O1.61g/L，CuSO₄·5H₂O>4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O>4·7H₂O4.99g/L，其余为水。

TAP固体培养基：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，得到的培养基。

巴龙霉素平板：含有10μg/mL的巴龙霉素的TAP固体培养基，趁热倒入培养皿中，得到巴龙霉素平板。

TAP固体平板：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，趁热倒入培养皿中，得到TAP固体平板。

加盐TAP固体平板1：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入NaCl并使其浓度为150mM，趁热倒入培养皿中，得到加盐TAP固体平板1。

加盐TAP固体平板2：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入NaCl并使其浓度为200mM，趁热倒入培养皿中，得到加盐TAP固体平板2。

加盐TAP固体平板3：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入NaCl并使其浓度为250mM，趁热倒入培养皿中，得到加盐TAP固体平板3。

干旱TAP固体平板1：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入甘露醇并使其浓度为300mM，趁热倒入培养皿中，得到干旱TAP固体平板1。

干旱TAP固体平板2：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入甘露醇并使其浓度为450mM，趁热倒入培养皿中，得到干旱TAP固体平板2。

干旱TAP固体平板3：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入甘露醇并使其浓度为600mM，趁热倒入培养皿中，得到干旱TAP固体平板3。

干旱TAP固体平板4：在TAP液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为1.5g/100mL，加入甘露醇并使其浓度为750mM，趁热倒入培养皿中，得到干旱TAP固体平板4。

实施例1、PpPYL2基因的克隆

本发明的申请人从小立碗藓中克隆出PpPYL2基因。具体方法如下：

1、模板的获得

取在BCD固体培养基光照培养(温度25℃，相对湿度70％，连续光照，光照强度40-60μmol/m².s^-1)7天的小立碗藓的原丝体，然后采用Trizol法提取小立碗藓的原丝体的总RNA，然后用逆转录酶反转录出第一链cDNA。

2、人工合成引物F：5’-GTCATGCAGGAGAAACAGGGGCGG-3’(双下划线为限制性内切酶Nde Ⅰ的识别序列)和R：5’

-GTCCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACGGTGCCGCTGGTTTCTCGTTG-3’(方框为限制性内切酶Xba>

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，得到约630bp的双链DNA分子(见图1)，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，得到DNA片段1。DNA片段1中含有序列表中序列1所示的双链DNA分子(简称PpPYL2基因)，编码序列表中序列2所示的蛋白质(简称PpPYL2蛋白或蛋白质PpPYL2)。

实施例2、转PpPYL2基因的衣藻的获得

一、重组质粒的构建

1、重组质粒pChlam-PpPYL2的构建

(1)用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切实施例1步骤3获得的DNA片段1，回收约630bp的DNA片段2。

(2)用限制性内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切载体pChlamiRNA3int1，回收约6.2Kb的载体骨架。

(3)将DNA片段2与载体骨架连接，得到重组质粒pChlam-PpPYL2。

根据测序结果，对重组质粒pChlam-PpPYL2进行结构描述如下：将载体pChlamiRNA3int1的限制性内切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子。重组质粒pChlam-PpPYL2的结构示意图见图2。重组质粒pChlam-PpPYL2具有氨苄青霉素和巴龙霉素两个筛选标记。

二、转PpPYL2基因衣藻的获得

1、取300μL野生型衣藻培养液(约20万个衣藻细胞)，置于装有100mL TAP液体培养基的250mL锥形瓶中，22℃培养4-5天，得到培养液1；将全部的培养液1转移至1L锥形瓶中，22℃培养24h，得到培养液2。

2、取培养液2，3000rpm离心5-10min，弃上清，收集沉淀1。

3、向沉淀1中加入1mL含60mM山梨醇的TAP液体培养基，重悬，得到重悬液1。

4、取电击杯(直径为4㎜)，加入300μL重悬液1和1μg线性化的重组质粒pChlam-PpPYL2(由限制性内切酶NotI酶切重组质粒pChlam-PpPYL2得到)，得到混合液。将装有混合液的电击杯首先冰上放置5min，然后放入电击转化仪中的电击杯槽内转化(电击时间9-13s)，最后置于冰上恢复15min。

电击参数：Voltage(电压)800V，Capacitance(电容)25μF；Resistance(分流电阻)none，Cuvette：4㎜。

5、将完成步骤4的混合液加入装有10mL含60mM山梨醇的TAP液体培养基的15mL试管中，置于摇床上22℃过夜培养(转速为30-40rpm)，得到培养液3。

6、取培养液3，3000rpm离心5-10min，弃上清，用残留的液体重悬沉淀，得到重悬液2。将重悬液2均匀涂布于巴龙霉素平板或TAP固体平板上，待干燥后22℃倒置培养过夜，然后正常培养(22℃)培养7天后观察。

实验结果见图3(左图为TAP固体平板，右图为巴龙霉素平板)。通过巴龙霉素筛选，获得100株拟转PpPYL2基因的衣藻，每株衣藻及其后代即为一个株系，将100株拟转PpPYL2基因的衣藻株系依次命名为No.1～No.100。

三、拟转空载体衣藻的获得

按照上述步骤二的方法，将重组质粒pChlam-PpPYL2替换为载体pChlamiRNA3int1，其它步骤均相同，得到拟转空载体衣藻。

四、分子检测

提取野生型衣藻、拟转空载体衣藻或拟转PpPYL2基因的衣藻的基因组DNA，并分别作为模板，以实施例1步骤2合成的F和R1：5’-CAATCAGCGAAATCGGCCATCC-3’为引物进行PCR扩增。

PCR扩增的实验结果见图4(WT为野生型衣藻，M为Marker，1为No.1，2为No.2，3为No.3，4为No.4，5为No.5，6为No.6，7为No.7，8为No.8，9为No.9，10为No.10，11为No.11，12为No.12，13为No.13，14为No.14，15为No.15，16为No.16，17为No.17，18为No.18，19为No.19，20为No.20，21为No.21，22为No.22，23为No.23，24为No.24，25为No.25，26为No.26，27为No.27，28为No.28，29为No.29，30为No.30，31为No.31，32为No.32，33为No.33，34为No.34，35为No.35，36为No.36，37为No.37，38为No.38，39为No.39，40为No.40，41为No.41，42为No.42，43为No.43，44为No.44，45为No.45，46为No.46，47为No.47，48为No.48，49为No.49，50为No.50，51为No.51，52为No.52，53为No.53，4为No.54，5为No.55，56为No.56，57为No.57，58为No.58，59为No.59，60为No.60，61为No.61，62为No.62，63为No.63，64为No.64，65为No.65，66为No.66，67为No.67，68为No.68，69为No.69，70为No.70，71为No.71，72为No.72，73为No.73，74为No.74，75为No.75，76为No.76，77为No.77，78为No.78，79为No.79，80为No.80，81为No.81，82为No.82，83为No.83，84为No.84，85为No.85，86为No.86，87为No.87，88为No.88，90为No.90，92为No.92，95为No.95，100为No.100，∨表示扩增出691bp的条带的衣藻株系)。结果表明，野生型衣藻和拟转空载体衣藻均不能扩增得到约691bp的条带，而随机选择的92株拟转PpPYL2基因的衣藻中的50株则扩增得到691bp的条带。因此，No.1、No.2、No.3、No.5、No.6、No.9、No.10、No.11、No.12、No.15、No.17、No.23、No.24、No.26、No.27、No.28、No.29、No.30、No.31、No.32、No.33、No.34、No.35、No.38、No.39、No.41、No.42、No.43、No.44、No.45、No.46、No.48、No.51、No.57、No.59、No.64、No.67、No.68、No.70、No.71、No.72、No.73、No.74、No.75、No.78、No.79、No.81、No.85、No.86和No.92均鉴定为转PpPYL2基因的衣藻，拟转空载体衣藻鉴定为转空载体衣藻。

五、转录分析

进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

(1)获得样本

取300μL No.1培养液(约10⁵个衣藻细胞)，离心，收集沉淀，沉淀即为样本1。

按照上述方法，将No.1分别替换为No.2、No.3、No.5、No.6、No.9、No.10、No.11、No.12、No.15、No.17和No.23，其它步骤均不变，获得样本2、样本3、样本4、样本5、样本6、样本7、样本8、样本9、样本10、样本11和样本12。

取300μL野生型藻株培养液(约10⁵个衣藻细胞)，离心，收集沉淀，沉淀即为样本13。

取300μL转空载体衣藻培养液(约10⁵个衣藻细胞)，离心，收集沉淀，沉淀即为样本14。

(2)实时定量检测

采用RNeasy plant mini Kit提取步骤(1)中样本(样本1、样本2、样本3、样本4、样本5、样本6、样本7、样本8、样本9、样本10、样本11、样本12、样本13或样本14)的总RNA，将该总RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA，获得cDNA溶液，cDNA溶液中DNA的浓度为200ng/μL。

以该cDNA溶液为模板，实时定量检测样本中PpPYL2基因的相对表达量(以CBLP基因作为内参基因)。

鉴定PpPYL2基因的引物为5’-GCCGGATTTCCAGTTCCTGTT-3’和5’-AGCAACTCGTGCTTGTGGAACC-3’。鉴定CBLP基因的引物为5’-TGGGACAAGATGGTCAAGGTCTG-3’和5’-CACCAGGTTGTTCTTCAGCTTGC-3’。

根据2-ΔΔCT法分析不同藻株中PpPYL2基因的相对表达量。结果表明(图5)，No.11的PpPYL2基因的相对表达量最高。野生型藻株、No.1、No.5、No.6、No.10和转空载体衣藻的PpPYL2基因的相对表达量无显著差异。选择No.2和No.23进行下述实验。

六、生长曲线分析

取300μL野生型藻株培养液(约10万个衣藻细胞)，置于装有100mL TAP液体培养基的250mL锥形瓶中，22℃培养6天。从野生型衣藻置于250mL锥形瓶开始计时(第1天)，每隔24h测定培养液的750nm处的吸光值。以培养时间为横坐标，750nm处的吸光值为纵坐标，绘制野生型衣藻的生长曲线。实验重复三次，取平均值。

按照上述方法，将野生型衣藻替换为No.2，其它步骤均不变，得到No.2的生长曲线。

按照上述方法，将野生型衣藻替换为No.23，其它步骤均不变，得到No.23的生长曲线。

按照上述方法，将野生型衣藻替换为转空载体衣藻，其它步骤均不变，得到转空载体衣藻的生长曲线。

实验结果见图6。结果表明，野生型衣藻、转空载体衣藻、No.2和No.23的生长曲线均呈现“S”型；实验第2-3天，四种藻株均处于对数生长期；实验第4天，四种藻株均处于稳定期；实验第4天，四种藻株的吸光值完全一致。因此，在正常培养条件下，PpPYL2基因对野生型衣藻的生长没有影响。

实施例3、转PpPYL2基因的衣藻的抗逆性鉴定

待测衣藻为野生型衣藻、转空载体衣藻、No.2或No.23。

一、在固体平板上鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗盐性

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、将300μL待测衣藻的培养液(约10万个衣藻细胞)接种于TAP液体培养基中，22℃培养至OD₇₅₀为1.3，得到培养液。

2、取培养液，用TAP液体培养基稀释1倍，得到培养液稀释液甲；取培养液，用TAP液体培养基稀释10倍，得到培养液稀释液乙；取培养液，用TAP液体培养基稀释100倍，得到培养液稀释液丙。

3、将10μL培养液稀释液(培养液稀释液甲、培养液稀释液乙或培养液稀释液丙)均匀涂布于固体平板上，22℃培养7天，观察。固体平板为TAP固体平板、加盐TAP固体平板1、加盐TAP固体平板2或加盐TAP固体平板3。

部分实验见图7(A为TAP固体平板；B为加盐TAP固体平板3；其中空载为转空载体衣藻，WT为野生型衣藻，Ha 2为No.2，Ha 23为No.23，a为培养液稀释液甲，b为培养液稀释液乙，c为培养液稀释液丙)：在TAP固体平板上，各藻株的生长状态无显著差异；随着NaCl浓度的增加，待测衣藻的生长的抑制效果越明显；在加盐TAP固体平板3上，NaCl对转基因藻株No.2和No.23的抑制效果明显低于野生型衣藻；各固体平板上，野生型衣藻和转空载体衣藻的生长状态无显著差异。结果表明，与野生型衣藻相比，No.2或No.23的抗盐性提高。

二、在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗盐性

实验重复三次，每次重复的步骤如下：将300μL待测衣藻的培养液(约10万个衣藻细胞)接种于TAP液体培养基或含150mM NaCl的TAP液体培养基中，22℃培养4天，然后观察待测衣藻的生长状态并测定其在750nm处的吸光值。

待测衣藻的生长状态见图8(左图为TAP液体培养基，右图为含150mM NaCl的TAP液体培养基)，待测衣藻在750nm处的吸光值见图9。在TAP液体培养基中，各藻株的生长状态无显著差异；在含150mM NaCl的TAP液体培养基中，野生型衣藻和转空载体衣藻几乎不能生长，No.2和No.23的生长状态较好。

上述结果表明，与野生型衣藻相比，No.2或No.23的抗盐性提高。

三、在固体平板上鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、将300μL待测衣藻的培养液(约10万个衣藻细胞)接种于TAP液体培养基中，22℃培养至OD₇₅₀为1.3，得到培养液。

2、取培养液，用TAP液体培养基稀释1倍，得到培养液稀释液甲；取培养液，用TAP液体培养基稀释10倍，得到培养液稀释液乙；取培养液，用TAP液体培养基稀释100倍，得到培养液稀释液丙。

3、将10μL培养液稀释液(培养液稀释液甲、培养液稀释液乙或培养液稀释液丙)均匀涂布于固体平板上，22℃培养7天，观察。固体平板为TAP固体平板、干旱TAP固体平板1、干旱TAP固体平板2、干旱TAP固体平板3或干旱TAP固体平板4。

部分实验见图10(A为TAP固体平板；B为干旱TAP固体平板1；C为干旱TAP固体平板2；D为干旱TAP固体平板3；E为干旱TAP固体平板4；其中vector为转空载体衣藻，WT为野生型衣藻，Line2为No.2，Line23为No.23，a为培养液稀释液甲，b为培养液稀释液乙，c为培养液稀释液丙)：在TAP固体平板上，各藻株的生长状态无显著差异；随着甘露醇浓度的增加，待测衣藻的生长的抑制效果越明显；在干旱TAP固体平板4上，甘露醇对转基因藻株No.2和No.23的抑制效果明显低于野生型衣藻；各固体平板上，野生型衣藻和转空载体衣藻的生长状态无显著差异。结果表明，与野生型衣藻相比，No.2或No.23的抗旱性提高。

4、在液体培养基中鉴定转PpPYL2基因的衣藻的抗旱性

实验重复三次，每次重复的步骤如下：将300μL待测衣藻的培养液(约10万个衣藻细胞)接种于TAP液体培养基或含450mM甘露醇的TAP液体培养基中，22℃培养5天，然后观察待测衣藻的生长状态并测定其在750nm处的吸光值。

待测衣藻的生长状态见图11(左图为TAP液体培养基，右图为含450mM甘露醇的TAP液体培养基)，待测衣藻在750nm处的吸光值见图12。在TAP液体培养基中，各藻株的生长状态无显著差异；在含450mM甘露醇的TAP液体培养基中，野生型衣藻和转空载体衣藻生长状态较差，No.2和No.23的生长状态较好。

上述结果表明，与野生型衣藻相比，No.2或No.23的抗旱性提高。