一种二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物的制备方法

摘要

本发明涉及一种二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物的制备方法，包括：硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子PMOs的制备，载药周期性介孔有机硅纳米载药体系PMOs‑DOX的制备，二硫化钼量子点MDs分散液的制备，二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物PMOs‑DOX@MDs的制备。本发明的方法简单，易于操作，反应条件温和，具有产业化实施的前景；制备得到的PMOs‑DOX@MDs具有较好的水分散性和生物相容性，药物装载量高，可以实现长效缓释，在较低pH值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境；且在较低功率的激光照射下产生过高热，可以进行光热治疗。

说明书

技术领域

本发明属于纳米载体的制备领域，特别涉及一种二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物的制备方法。

背景技术

肿瘤严重威胁着人类的健康甚至生命。传统治疗方法，主要包括化学疗法和放射疗法，由于副作用严重而最终治疗效果有限。目前，化疗在肿瘤的综合治疗中占主导地位，但是化疗药物在肿瘤治疗过程中会引起全身性毒副作用，这严重限制了其临床使用。同时传统的化疗药物依然存在一定的局限性，例如水溶性差、交叉耐药。缓解期短和明显的毒副作用等缺点。因此这类治疗方式的疗效有待提高。

光热治疗是利用光热转换剂在远程激发光源的照射下吸收光能并将光转换成热、借助所产生的局部快速加热消除肿瘤细胞。由于近红外光(NIR)(650-900nm)的组织穿透能力较强，所以可吸收近红外光并进行光热转化的近红外光热纳米粒子能进一步渗透到深部组织、同时将对非目标组织的伤害降低到最小。随着纳米技术的出现，很多种具有强近红外吸收的纳米材料包括有机染料、金纳米颗粒、碳纳米材料、过渡金属硫化物、硫化铜纳米颗粒等可以作为光热试剂用于肿瘤光热治疗，与此同时，将光热治疗与化疗结合对肿瘤进行协同治疗的研究也引起了广大科研工作者的关注。

周期性介孔有机硅凭借其独特的孔道结构、较大的比表面积和较好的生物相容性等优点，在吸附和医药载体方面有着广泛的应用。不同与介孔二氧化硅，周期性介孔有机硅中掺杂了一定的有机化合物基团导致其孔道易于改变。目前基于介孔二氧化硅响应的控释体系的研究对药物靶向输送和刺激响应控释相结合的研究中，将其作为一个良好的药物载体，更有效地将药物递送至治疗部位，实现刺激响应控释，提高治疗效果、与其他纳米材料结合进行协同治疗、减小毒副作用的相关研究逐步引起学者们的浓厚兴趣。

过渡金属硫化物具有强的近红外吸收，其具有较高的光和热灵敏度、良好的生物相容性、大的比表面积和易于修饰等特点被用于构建药物载体及光热治疗。因此，将二硫化钼量子点和周期性介孔有机硅进行结合，有望构建出一个集药物有效上载和可控释放与光热治疗进行化-光热协同治疗的纳米复合物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物的制备方法，该方法简单，易于操作，反应条件温和，具有产业化实施的前景，制备得到的二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物具有较好的水分散性和生物相容性，具有应用于肿瘤化-光热协同治疗的前景。

本发明的一种二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物的制备方法，包括：

(1)将模板剂分散在溶剂中，搅拌，再加入含硫硅源，继续搅拌，洗涤，离心，放入盐酸/甲醇的混合溶液中处理，离心，冷冻干燥，得到硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子(PMOs)，其中，模板剂与溶剂的比例为1g:20-70mL，模板剂与含硫硅源的比例为1g:0.5-1mL；

(2)将步骤(1)中PMOs分散在缓冲溶液中，加入含阿霉素(DOX)的缓冲溶液，搅拌，透析，冷冻干燥，得到载药周期性介孔有机硅纳米载药体系(PMOs-DOX)，其中PMOs与DOX的质量比为1-3:1，PMOs分散液的浓度为0.5-2mg/mL；

(3)将四硫代钼酸铵和表面活性剂以质量比为1:2-6分散在溶剂一中，超声，加入还原剂，移至反应釜中反应，冷却，过滤，旋蒸，分散在溶剂二中，得到二硫化钼量子点(MDs)分散液，其中，四硫代钼酸铵与还原剂的比例为1mg:0.03-0.1mL，四硫代钼酸铵与溶剂一的比例为1mg:4-10mL，二硫化钼量子点(MDs)分散液的浓度为0.4-1.5mg/mL；

(4)将步骤(2)中PMOs-DOX加入到步骤(3)中MDs分散液中，避光搅拌过夜，水洗，离心，冷冻干燥，得到二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)，其中，PMOs-DOX与MDs的质量比为1-4:1。

所述步骤(1)中模板剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；溶剂为体积比为1:0.2-3:0.02-0.08的去离子水、乙醇和氨水的混合液；含硫硅源为摩尔比为1:0.1-0.5的正硅酸乙酯TEOS和双(三乙氧基硅基)-烷基多硫化物BTES。

所述步骤(1)中搅拌温度为30℃-55℃；继续搅拌时间为1-5h；处理时间为6h。

所述步骤(2)中缓冲溶液为PBS溶液，缓冲溶液的pH值为7.4。

所述步骤(2)中含阿霉素(DOX)的缓冲溶液浓度为0.5-1mg/mL；搅拌时间为3-5h。

所述步骤(3)中表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；溶剂一为甲醇。

所述步骤(3)中还原剂为水合肼；溶剂二为水。

所述步骤(3)中反应温度为100-180℃，反应时间为3-5h；过滤是用微孔滤膜。

所述步骤(4)中避光搅拌温度为3-5℃。

所述步骤(4)中二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物中周期性介孔有机硅的粒径为100-300nm，二硫化钼量子点的粒径为1.6-3.0nm。

本发明以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，TEOS和BTES混合溶液为硅源，在乙醇、超纯水和氨水混合液中，通过溶胶凝胶法形成硫掺杂的周期性介孔有机硅(PMOs)；将所得的PMOs与阿霉素(DOX)混合得到PMOs-DOX；以四硫代钼酸按为原料通过一步溶剂热法合成二硫化钼量子点，随后在超声下缓慢加入PMOs-DOX，在避光的条件下反应过夜，将反应后的溶液离心，冷冻干燥处理得到终产品。

本发明制备得到的PMOs-DOX@MDs进行药物释放实验及光热转换效率评价的方法为：

(1)配制pH值为7.4的含有DOX的PBS缓冲溶液及pH值为5.0的含有DOX的醋酸盐缓冲溶液，取一定体积于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种pH环境下的DOX标准曲线，其中DOX浓度为0.0025～0.08mg/mL；

(2)将1-5mg PMOs-DOX@MDs分别溶于10-15mL pH值为7.4的PBS缓冲溶液和10-15mL pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中，置于两个透析袋中。然后分别将透析袋放入10-30mLpH值为7.4的PBS缓冲溶液、10-30mL pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中振荡0.5-24h，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得到pH响应药物释放曲线。

(3)将1-5mg PMOs-DOX@MDs分别溶于10-15mL pH值为7.4的PBS缓冲溶液和10-15mL pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中，置于透析袋中，然后分别用808nm，照射功率1.0-3.0W/cm²的激光照射1-5min，随后置于摇床中振荡0.5-24h，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得到不同pH条件下的光热响应药物释放曲线。

(4)将1-20mg/mL的PMOs-DOX@MDs溶液置于离心管中，用功率为0.5-3W/cm²的808nm的近红外光照射5分钟，通过热电偶监控溶液的温度变化绘制溶液的升温曲线。

本发明制备得到的PMOs-DOX@MDs对乳腺癌细胞MCF-7进行检测，验证其细胞上载及抗肿瘤效果。细胞实验PMOs-DOX@MDs里DOX的浓度为0-20μg/mL。

有益效果

(1)本发明的方法简单，易于操作，反应条件温和，具有产业化实施的前景；

(2)本发明制备得到的二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)具有较好的水分散性和生物相容性，具有应用于肿瘤化-光热协同治疗的前景；

(3)本发明制备得到的二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)药物装载量高，可以实现长效缓释，且具有pH及光照双响应输送，在较低pH值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境；且在较低功率的激光照射下产生过高热，可以进行光热治疗。

附图说明

图1为实施例1中PMOs(a)、MDs(c)和PMOs-DOX@MDs(d)的TEM图及PMOs(b)的SEM图。

图2为实施例2中DOX(a)、PMOs(b)、PMOs-DOX@MDs(c)、PMOs-DOX(d)、MDs(e)的紫外图谱(A)及PMOs的孔径分布(B)。

图3为实施例3中PMOs(a)、PMOs-DOX@MDs(b)的Zeta电势变化(A)及PMOs，PMOs-DOX，MDs，PMOs-DOX@MDs的水动力学直径变化(B)。

图4为实施例4中阿霉素在pH＝7.4的PBS缓冲溶液和pH＝5.0的醋酸盐缓冲溶液下的标准曲线。

图5为实施例4中PMOs-DOX@MDs在不同条件的体外释放行为图。

图6为实施例5中PMOs-DOX@MDs在不同的浓度(A)以及不同功率(B)的激光照射下的升温曲线。

图7为实施例6中PMOs-DOX@MDs和单独的DOX对MCF-7细胞的MTT结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将1.0g CTAB分散于20mL去离子水和45mL乙醇的混合溶剂中，加热到35℃，搅拌溶解。然后加入1mL氨水，搅拌1小时。接着加入0.45mL TEOS和0.15mL BTES，继续反应2小时后，水洗，醇洗，于10000rpm离心分离，得到沉淀即为硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子。将该沉淀于120mL盐酸/甲醇(体积比为2:85)的混合溶液中回流6小时，再离心分离，得到沉淀，重复以上回流操作三次，离心并冷冻干燥得到硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子(PMOs)。

(2)将10mg PMOs分散在10mL pH值为7.4的PBS溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入10mL含DOX的PBS溶液(0.5mg/mL)，在室温状态下搅拌4h。最后将含阿霉素(DOX)的PMOs溶液放入透析袋(MW＝8000～14000)中，用透析法将未连接上的阿霉素除去，用PBS缓冲液透析3次，每次2L。最后将产物冷冻干燥后获得载药周期性介孔有机硅纳米载药体系PMOs-DOX。

(3)取10mg四硫代钼酸铵和35mg PVP分散在40mL甲醇中，超声中加入0.35mL水合肼，随后将混合液转移至反应釜中，在120℃反应3h，冷却至室温，微孔滤膜过滤后旋蒸，并重新分散在水中得到二硫化钼量子点(MDs)分散液(1mg/mL)。

(4)取20mg步骤(2)中PMOs-DOX，缓慢加入到10mL步骤(3)中二硫化钼量子点(MDs)分散液(1mg/mL)中，在4℃下避光搅拌过夜后，水洗，离心，冷冻干燥后得到二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)。

图1表明：PMOs呈球形，且粒径在150nm左右，MDs的粒径在1.8-2.5nm之间，且很好地负载在载药的周期性介孔有机硅(PMOs-DOX)上。

实施例2

(1)将1.0g CTAB分散于15mL去离子水和30mL乙醇的混合溶剂中，加热到45℃，搅拌溶解。然后加入0.7mL氨水，搅拌1小时。接着加入0.7mL TEOS和0.14mL BTES，继续反应3小时后，水洗，醇洗，于10000rpm离心分离，得到沉淀即为硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子。将该沉淀于120mL盐酸/甲醇(体积比为2:85)的混合溶液中回流6小时，再离心分离，得到沉淀，重复以上回流操作三次，离心并冷冻干燥得到硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子(PMOs)。

(2)将15mg PMOs分散在15mL pH值为7.4的PBS溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入5mL含DOX的PBS溶液(1mg/mL)，在室温状态下搅拌4h。最后将含阿霉素(DOX)的PMOs溶液放入透析袋(MW＝8000～14000)中，用透析法将未连接上的阿霉素除去，用PBS缓冲液透析3次，每次2L。最后将产物冷冻干燥后获得载药周期性介孔有机硅纳米载药体系(PMOs-DOX)。

(3)取15mg四硫代钼酸铵和30mg PVP分散在75mL甲醇中，超声中加入0.7mL水合肼，随后将混合液转移至反应釜中，在150℃反应3h，冷却至室温，微孔滤膜过滤后旋蒸，并重新分散在水中得到二硫化钼量子点(MDs)分散液(0.5mg/mL)。

(4)取15mg步骤(2)中PMOs-DOX，缓慢加入到10mL步骤(3)中二硫化钼量子点(MDs)分散液(0.5mg/mL)中，在4℃下避光搅拌过夜后，水洗，离心，冷冻干燥后得到二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)。

图2表明：PMOs的孔径大约在3.8nm左右，从紫外图谱的变化可以看出DOX成功负载到PMOs的孔道中及MDs的成功负载到PMOs-DOX上。

实施例3

(1)将2.0g CTAB分散于30mL去离子水和70mL乙醇的混合溶剂中，加热到55℃，搅拌溶解。然后加入2mL氨水，搅拌1小时。接着加入1.4mL TEOS和0.32mL BTES，继续反应1小时后，水洗，醇洗，于10000rpm离心分离，得到沉淀即为硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子。将该沉淀于120mL盐酸/甲醇(2:85)的混合溶液中回流6小时，再离心分离，得到沉淀，重复以上回流操作三次，离心并冷冻干燥得到硫掺杂的周期性介孔有机硅纳米粒子(PMOs)。

(2)将20mg PMOs分散在15mL pH为7.4的PBS溶液中，在搅拌的情况下，逐滴加入7mL含DOX的PBS溶液(1mg/mL)，在室温状态下搅拌4h。最后将含阿霉素(DOX)的PMOs溶液放入透析袋(MW＝8000～14000)中，用透析法将未连接上的阿霉素除去，用PBS缓冲液透析3次，每次2L。最后将产物冷冻干燥后获得载药周期性介孔有机硅纳米载药体系(PMOs-DOX)。

(3)取20mg四硫代钼酸铵和45mg PVP分散在100mL甲醇中，超声中加入1.8mL水合肼，随后将混合液转移至反应釜中，在180℃反应3h，冷却至室温，微孔滤膜过滤后旋蒸，并重新分散在水中得到二硫化钼量子点(MDs)分散液(0.5mg/mL)。

(4)取30mg步骤(2)中PMOs-DOX，缓慢加入到15mL步骤(3)中二硫化钼量子点(MDs)分散液(0.5mg/mL)中，在4℃下避光搅拌过夜后，水洗，离心，冷冻干燥后得到二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)。

图3表明：二硫化钼量子点负载的周期性介孔有机硅纳米载药复合物(PMOs-DOX@MDs)已经成功合成。

实施例4

取实施例1得到的PMOs-DOX@MDs载药体系进行药物释放实验的方法：

(1)配制pH值为7.4的含有DOX的PBS缓冲溶液(0.0025～0.08mg/mL)及pH值为5.0的含有DOX的醋酸盐缓冲溶液(0.0025～0.08mg/mL)，于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种pH环境下的DOX标准曲线，如图4所示。

(2)取两份5mg PMOs-DOX@MDs分别溶于10mL pH值为7.4的PBS缓冲溶液及10mL pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中，置于两个透析袋中，然后分别将透析袋置于30mL pH值为7.4的PBS缓冲溶液和pH值为5.0的醋酸盐缓冲溶液中振荡，于不同时间点取样，补充新鲜缓冲液，得到pH响应药物释放曲线，如图5所示。

(3)取两份5mg PMOs-DOX@MDs分别溶于10mL PBS缓冲溶液及10mL醋酸盐缓冲溶液中，置于两个透析袋中，然后分别用808nm、1W/cm²的激光(NIR)照射5min，随后置于摇床中振荡，分别于不同的时间点取样检测，并补充缓冲液，得到光热响应药物释放曲线，如图5所示。

图5表明：在不同pH值条件下PMOs-DOX@MDs的药物释放存在显著差异，在较低pH值环境下释放率更高，且光热可显著提高药物的释放，肿瘤组织与正常组织细胞相比其pH值较低，该载药材料的释放正好符合这一特性。表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的pH/光多重刺激响应型药物载体。

实施例5

取实施例2中的PMOs-DOX@MDs载药体系光热转换性能测定的方法：

(1)配制不同浓度(1-20mg/mL)的PMOs-DOX@MDs水溶液置于离心管中，将纯水置于离心管中做空白对照，组装好激光器及测温装置，用功率为2W/cm²的808nm的近红外光照射5分钟，通过热电偶监控溶液的温度变化绘制不同浓度溶液的升温曲线，如图6A所示。

(2)配制一系列浓度为2.5mg/mL的PMOs-DOX@MDs水溶液置于离心管中，组装好激光器及测温装置，分别用不同功率(0.5-3W/cm²)的808nm的近红外光照射5分钟，通过热电偶监控溶液的温度变化绘制不同功率激光照射下溶液的升温曲线，如图6B所示。

图6表明：随着照射时间的加长，温度逐渐上升并趋于稳定；且在一定的照射功率下，升温幅度随着浓度的加大而加大；同时，当固定浓度不变时，随着照射功率的加大，PMOs-DOX@MDs的升温幅度亦加大，证明合成的PMOs-DOX@MDs可以在一定的激光照射下产生过高热，可作为一个良好的光热剂用于光热治疗。

实施例6

(1)在96孔细胞培养板中种入MCF-7细胞，每孔细胞密度大约为10000个，并补足每孔200μL的培养液，在5％CO₂的条件下于培养箱中培养24h。

(2)培养24h后倒掉旧培养基，加入含有不同浓度的实施例3中PMOs-Dox@MDs的20μL PBS溶液，以相同DOX浓度的纯DOX的PBS溶液做对照，并补足180μL新鲜培养基，孵育24h。

(3)孵育24h后，每孔加20μL的0.5％的MTT溶液，置37℃恒温箱中静置4h，吸去孔内培养液，并添加200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪检测在570nm处各孔的紫外吸收值。

图7表明：随着PMOs-DOX@MDs中DOX浓度的增加，可以产生明显的细胞毒性，同时，仅以化疗而言，PMOs-DOX@MDs的抗肿瘤效果略强于单纯的药物治疗，也验证了PMOs-DOX@MDs能将抗肿瘤药物有效地递送至肿瘤组织。

实施例7

(1)在24孔细胞培养板中放入盖玻片，并种入MCF-7细胞，每孔细胞密度大约为3×10⁴个，并补足每孔1mL的培养液，在5％CO₂的条件下于培养箱中培养24h。

(2)第二天倒掉旧培养基，用PBS清洗两次后无激光照射组中加入100μL实施例3中PMOs-DOX@MDs(100μg/mL)的培养基溶液，并补足900μL新鲜培养基，孵育4h。激光照射组加入100μL PMOs-DOX@MDs(100μg/mL)的培养基溶液，并补足900μL新鲜培养基，在孵育2h后用功率为2.0W/cm²的近红外光照射5min后继续孵育2h。

(3)吸去含PMOs-DOX@MDs的培养基溶液，并用PBS冲洗，加1ml 2.5％的戊二醛固定15min。

(4)吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加1mLDAPI染色15min。

(5)吸去DAPI后用PBS冲洗数次，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。

检测结果表明：在激光照射组中DOX发出的红色荧光明显强于无激光照射组，说明激光产生的过高热不仅可以促进细胞的上载，而且还可以促进药物的释放。