橡胶树白粉菌内源启动子WY193及其用途

摘要

本发明公开了一种橡胶树白粉菌内源启动子WY193及其用途，所述启动子WY193具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的变体。本发明还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、转基因植物、外植体和愈伤组织。所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及橡胶树白粉菌内源启动子WY193及其用途。

背景技术

启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，是基因表达调控中重要的顺式元件。而核心启动子则是能够通过RNA酶作用机制精确指导转录起始的最短连续DNA序列，包括TATAbox、起始子、下游核心启动子元件、TFIIB识别元件和十基序元件。

目前启动子的分类依据主要是控制转录水平及作用方式和功能两种。根据控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；根据转录模式，启动子包括组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子为在多数或全部组织中保持持续活性的启动子，而诱导型启动子则是受外界化学或物理信号调控的启动子，其诱导源主要是化学因子、物理因子，人工合成的化学诱导物三大类。

通常认为从单子叶植物中分离的组成型启动子在单子叶转基因植物中表现更高的转录活性，而且在启动子和报告基因间含有内含子会提高转录水平。目前，人们已开发的适合单子叶植物高效表达的基因有水稻Actin I启动子和玉米Ubiquitin启动子等。此外，李为民等人发现玉米中采用Ubiquitin启动子启动CAT基因的表达比采用35S启动的基因表达效率高出10倍，而Lu等还从水稻中分离到新的rubi3启动子，其能使基因在各个组织中表达，且启动活性高于玉米中发现的Ubi-1启动子，强效且极具应用前景。

目前单子叶植物中存在的组织型启动子种类较少，主要是从大麦中分离到的Lem1启动子，该启动子主要启动基因在大麦的外稃和内稃中表达；还有水稻中的Ca²⁺-ATPase启动子全长具有维管组织表达特异性，该启动子还可对干旱、高盐、病原菌等多种胁迫予以响应。

单子叶植物中具有大量诱导型启动子，其中水稻贡献了绝大部分功劳。目前，从水稻中克隆到的启动子有Rab16A盐诱导启动子、Os HsfB2cp，PM19p，Hsp90p热诱导启动子、TdCor39冷诱导启动子、Rab16B ABA诱导启动子、LHCPII和R4CL-1光诱导启动子、Os EBP-89病原微生物诱导启动子。而小麦中克隆到的启动子主要为以下四种：mwcs120和Wcorl5冷诱导启动子、EmABA诱导启动子和Cab光诱导启动子。大麦中同样也有已克隆出的诱导型启动子，例如blt4.9和blt101.1冷诱导启动子、Dhn4s干旱诱导启动子和PGIII病原微生物诱导启动子。玉米、天麻中也有出现个别诱导型启动子。而个别启动子也出现被多种因素诱导的情况，例如水稻中的Os DREB1B启动子则可受盐、ABA、PEG非生物胁迫及其他生物胁迫的诱导等。

Ca MV35S启动子具有在双子叶植物中高效表达的特点，且能在所有细胞和任何时候进行转录，对于获得大量外源蛋白具有很大的优势，已被广泛应用于启动外源基因的表达。

许多双子叶植物中的组织型启动子例如柑橘韧皮部蛋白基因(Cs PP)启动子、拟南芥韧皮部基因(At PP2)启动子和拟南芥蔗糖运输基因(At SUC2)启动子，因为拥有了植物激素应答元件、光反应元件、生物和非生物胁迫响应元件以及组织特异性表达元件，因而具有在植物维管组织中的韧皮部特异性表达的能力。近年来发现的豇豆储藏蛋白基因8SGα启动子驱动下的GUS酶活活性是CaMV35s启动子活性的2-4倍，且该启动子具有种子表达特异性。

目前的诱导型启动子研究现状中，双子叶植物较单子叶植物具有更多的种类，涉及植物范围也更广。其中，拟南芥中的诱导型启动子占据半壁江山：目前发现的有CBF2、cor15a、cor15b、ADH、LT178、At rd29A 6种冷诱导启动子，rd22，cor15，rab18、ABA5和AtNCED3ABA诱导启动子，Rd29A和AtNCED3干旱诱导启动子及Psy光诱导启动子。而烟草中有Nt HSP3A热诱导启动子、Nt Cel7生长素诱导启动子和PPP1,PPP2,PPP3病原微生物诱导启动子。除此之外，在大豆、棉花、豌豆、绿豆等双子叶植物中，也陆续发现了更多的诱导型启动子。

组成型启动子在表达外源基因方面取得了巨大的成功，现在仍然应用广泛。但特异性启动子在转基因食品和基因定时定位表达等方面也越来越重要。

丝状真菌是工业上很多重要产品例如各类抗生素，还有很多酶制剂的重要原料。这些工业产品的大量生产一方面说明了丝状真菌对于人类生活和工业的重要性，另一方面更说明了丝状真菌在表达其内源基因时非常巨大的表达量，其内源启动子非常强大，启动子资源非常丰富。如果能利用其启动子表达外源基因，这将为转基因工程提供更加丰富的资源。丝状真菌的分子研究普遍比较滞后，很多丝状真菌，尤其是尚无法离体培养的专性寄生真菌，遗传转化体系都尚未建立或完善。发现和利用真菌内源启动子，对构建真菌自身的遗传转化体系也非常有益。

针对以上现有技术的不足之处，本发明通过对橡胶树白粉菌基因组的深入研究，提供了一种橡胶树白粉菌内源启动子WY193。

本发明采取的技术方案如下：

一种橡胶树白粉菌内源启动子WY193，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；

c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选的，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。

进一步的，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。

进一步的，本发明还涉及一种重组载体，所述载体为本发明的启动子与pGEM-Teasy或PBI 121质粒经重组所得。

进一步的，本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。

优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。

进一步的，本发明还涉及一组引物对，所述引物对的两条引物分别含有SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的序列；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。

进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及所述启动子WY193或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子WY193，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择，也为橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建提供了一个有益的思路。

附图说明

图1为重组载体PBI121-WY193的质粒图谱。

图2为启动子WY193重组载体PBI121-WY193的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的GUS染色结果。

图中，WY193为PBI121-WY193转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK⁺(CaMV35S)：由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK^-(无菌苗)为未转化的三生烟无菌苗叶盘的GUS染色结果。

图3为WY193转基因三生烟各生长时期图；

图中，由左至右依次为共培养期、愈伤期、侧芽期、生根期、成株期。

图4为WY193调控GUS基因转基因三生烟的PCR扩增检测结果；

图中，M：Marker2000；WY193：WY193调控GUS基因转基因三生烟叶片DNA；CK⁺：转PBI121空载体的转基因三生烟；CK^-：野生型三生烟。

图5为启动子WY193重组载体PBI121-WY193的重组根癌农杆菌介导转化的水稻(日本晴)愈伤的GUS染色结果；

图中，WY193：PBI121-WY193转化水稻愈伤叶盘的GUS染色结果；CK⁺(CaMV35S)：由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化水稻愈伤的GUS染色结果；CK^-：未转化的日本晴水稻愈伤的GUS染色结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一、WY193启动子片段的PCR扩增

使用真菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA,D3390-01)提取橡胶树白粉菌(海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供)的基因组DNA，根据WY193启动子的序列，设计一对特异性扩增引物(上游引物WY193F，加限制性酶切位点HindⅢ和保护碱基，下游引物WY193R，加限制性酶切位点BamHⅠ和保护碱基)。以上述提取的橡胶树白粉菌的基因组DNA为模板，使用高保真Ex Taq聚合酶(TRANSGEN,AP122)进行PCR扩增。如表1所示。

表1基因启动子扩增的PCR体系

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸5min。

其中，上游引物WY193F：CCCAAGCTTGTGATTATGGGTTCAATCTCT，其中下划线代表HindⅢ酶切位点。下游引物WY193R：CGGGATCCTTTCGCGCTAAATTACCAA，其中下划线代表BamHⅠ酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为260bp左右的条带，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：D2500-01)进行纯化回收。

实施例二、pGEM-T easy-WY193重组载体的构建

将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pGEM-T easy质粒，PROMEGA，A1360)转化大肠杆菌(TRANSGEN,CD201)，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：10ul

pGEM-T Easy Vector(PROMEGA，A137A):1ul

2×Rapid ligation Buffer:5ul

PCR扩增产物(回收插入片段)：2ul

T4DNA ligase:1ul

ddH₂O:1ul

先置于室温1小时，然后于4℃连接过夜，得到pGEM-T easy-WY193重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgene,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pGEM-T easy-WY193重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(氨苄青霉素,IPTG,X-gal)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养12h～16h。获得含有pGEM-T easy-WY193克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-WY193。深圳华大基因科技有限公司对pGEM-T easy-WY193克隆载体中的WY193进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

测序结果表明，获得的pGEM-T easy-WY193克隆载体中WY193启动子序列正确。

实施例三、PBI121-WY193重组载体的构建

将上述构建获得的DH5α-WY193菌株挑取单菌落进行摇菌，37℃220rpm摇菌过夜，用OMEGA质粒小提试剂盒(D6943-01)提取质粒，然后用HindⅢ(NEB,R0104S)和BamHⅠ(NEB,R0136V)限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用OMEGA回收试剂盒(D2500-01)进行回收WY193启动子片段。

将上述得到的回收产物与PBI121质粒(TIANNZ，60908-750y)进行连接，然后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，T/A克隆的连接条件如下：

T/A连接体系：10ul

PBI121Vector:1ul

10×T4DNA Ligase Buffer:1ul

回收产物(WY193启动子片段)：6ul

T4DNA Ligase(Ta Ka Ra，D2011A)：0.5ul

ddH₂O:1.5ul

16℃连接过夜，得到PBI121-WY193重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgen,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即PBI121-WY193重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl 4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃200rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有PBI121-WY193克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-PWY193。深圳华大基因科技有限公司对PBI121-WY193克隆载体中的WY193进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

测序结果表明，获得的PBI121-WY193克隆载体中WY193启动子序列正确。

实施例四、重组根癌农杆菌LBA4404-WY193细胞的制备

将重组大肠杆菌DH5α-PWY193挑取单菌落在含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中摇菌，37℃200rpm，生长到OD₆₀₀为0.5左右，与含有协助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101和受体农杆菌LBA4404的感受态细胞等体积混匀，用涂抹棒涂布于不含有任何抗生素固体的LB培养基平板上，28℃培养过夜。用接种针将长出的菌落转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，28℃培养3到4天。将长出的单菌落再次转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，挑取单菌落用含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基摇菌，37℃200rpm，以引物对WY193F、WY193R进行菌落PCR验证，同时提取质粒用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切验证。条带为260bp左右的即为重组根癌农杆菌LBA4404-WY193细胞。

实施例五、重组根癌农杆菌介导转化三生烟

1)烟草无菌苗的获得

将三生烟种子装入1.5ml离心管(＜50粒/管)，加入1ml ddH₂O，放入4℃冰箱，浸泡2-3天进行春化。春化好的三生烟种子用移液枪吸出ddH₂O，加入1ml75％的无水乙醇浸泡2min，用移液枪吸出无水乙醇，用ddH2O反复洗3至5次，洗净种子，每次用ddH₂O>2O洗3至5次，最后用移液枪吸出ddH₂O。用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再用吸头将三生烟种子接种于MS固体培养基平板上进行萌发，每皿10—20粒，置于26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养一周，光照强度为2000lx(本发明的所有的光照培养均在此光照强度下进行)。三生烟长出幼苗后，转入装有新鲜MS固体培养基的组培瓶，每瓶(Φ6cm，H>

剪除三生烟无菌苗的叶片和根，将茎杆剪为带有腋芽的小段，每段长约2-3cm，用枪镊夹住将其形态学下端垂直插入含有新鲜MS固体培养基的组培瓶内。每瓶接种一个带有腋芽的茎段，26℃光照培养3-5周，此即待转化材料。

2)侵染菌液的制备

将重组根癌农杆菌LBA4404-WY193挑取单菌落转入含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基摇菌，28℃200rpm摇菌过夜。吸取少量菌液转入30倍体积的含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基，相同条件进行复摇。培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右，即为侵染菌液。

3)侵染

从培养3-5周的无菌三生烟苗上剪取较大的叶片，盛入装有少许ddH₂O的无菌培养皿中。

用直径约1cm的打孔器将烟草叶片打成叶圆盘，或者用无菌手术刀将烟草叶片切为边长约1cm的近似正方形的叶盘，放入另一个装有少许ddH₂O的无菌培养皿中。

用枪镊将烟草叶盘夹出，放入装有适量侵染菌液的无菌50ml离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10-25min，期间不断摇晃几次。捞出烟草叶盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4-10块叶盘，26℃暗培养2天。

4)筛选

暗培养结束的烟草叶盘转接到含有5-10ug/ml卡那霉素和1.0mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA和100ug/ml特美汀的MS固体培养基平板中，26℃光照培养。

培养2-4天后，取没有变白的叶盘进行GUS染色。37℃染色过夜后以75％乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。结果如图4所示，经含有启动子WY193的重组载体PBI121-WY193的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘经GUS染色后变蓝。结果显示本发明的WY193启动子在双子叶模式植物三生烟中对GUS基因具有调控作用。

GUS染色液配方：

0.25mM>3Fe(CN)₆,0.25mM>4Fe(CN)₆,64mM>2HPO₄·12H₂O,36mM>2PO₄，10mMNa₂EDTA,0.1％Trition>3OH,2.5mg/ml>

实施例六、转基因烟草中GUS基因的表达

取部分上述转化过的三生烟叶盘继续光照培养，约两周后继代，约四周后出现丛生芽。

当丛生芽生长到1-2cm时，用灭菌过的手术刀切下，接种到含有5-10ug/ml卡那霉素和100ug/ml特美汀的1/2MS培养基中，每瓶1-4株。26℃光照培养约2周。取生根状况良好的烟草小苗，在培养箱里打开组培瓶的盖子，炼苗2-3天。

剪除转基因烟草小苗的大部分叶片，小心洗掉根部大部分培养基，移栽到灭过菌的土壤里，进行盆栽。生长约2-3周，取长出的新叶提取DNA进行PCR扩增验证。扩增引物为WY193F、WY193R。扩增产物经1％琼脂糖电泳，结果如图5显示，得到了一条约250bp的条带，与WY193大小一致，转PBI121空载体的阳性对照和三生烟野生型无菌苗则无条带。

实施例七、水稻愈伤组织的诱导和转化

诱导水稻愈伤组织，用重组根癌农杆菌LBA4404-WY193转化所述愈伤组织。

1)水稻种子灭菌

将成熟的日本晴水稻种子手工去壳。加70％乙醇处理1-2min，倒净乙醇，用无菌水冲洗三次。加0.1％HgCl₂浸泡15min，用无菌水冲洗三次。晾干，备用。

2)水稻愈伤组织的诱导和继代

将消毒后的含胚米粒接种到N6D培养基上，29℃生化培养箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生。

将长出的水稻愈伤组织从种子上剥离，转接到新的N6D培养基上，继代培养。大约每两周继代一次。

3)农杆菌LBA4404-WY193的活化及转化菌液制备

挑选黄白色，干燥的活跃愈伤组织，接种到新的N6D培养基上培养三天。

挑取重组根癌农杆菌LBA44O4-WY193的单菌落，在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的液体YM/YEP/LB培养基上中，28℃，250rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。

吸取1ml培养好的菌液加入50ml含50ug/ml的卡那霉素的YM/YEP/LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。4℃，4000rpm离心，沉淀菌体，然后用含适量MS重悬菌液至OD₆₀₀＝0.5左右，备用。

4)转化

将继代培养的水稻愈伤组织放入灭菌培养皿中，将LBA4404-WY193重悬液倒入培养皿，浸泡水稻愈伤组织15-30min。将水稻愈伤组织移出放在灭菌滤纸上，滤掉多余液体。N6共培养基上放一张灭菌滤纸。将水稻愈伤组织放到滤纸上，密封培养，28℃暗培养48-60小时。

5)筛选

将受感染的水稻愈伤组织用1％的甘露醇溶液清洗3-4次，然后用无菌水振荡清洗3-4次，直到上清液变澄清。最後用300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的无菌水溶液清洗3-4次。将愈伤组织放在无菌滤纸上，除去多余水分。最後将愈伤组织接种到含有5-10ug/ml的卡那霉素和300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的N6培养基上，密封，29℃暗培养，约两周继代一次。

实施例八：日本晴水稻愈伤组织中的GUS基因的表达

将用LBA4404-WY193转化的水稻愈伤组织进行GUS染色。

GUS染色液的配方(1ml)：

0.25mM>3Fe(CN)₆,0.25mM>4Fe(CN)₆,64mM>2HPO₄·12H₂O,36mM>2PO₄，10mMNa₂EDTA,0.1％Trition>3OH,2.5mg/ml>

用LBA4404-WY193转化的水稻愈伤组织于37℃浸泡在GUS染色液中，过夜。

拍照，结果如图5所示，含有重组载体PBI121-WY193的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织GUS染色后变蓝色。不含重组载体PBI121-WY193的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织GUS染色后颜色不变。结果表明，本发明的WY193启动子对GUS基因的表达具有调控作用。

表2 MS培养基配方

pH调至5.8，121℃灭菌20min。

表3 N6培养基配方

pH调至5.2，121℃灭菌20min。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 海南大学

<120> 橡胶树白粉菌内源启动子WY193及其用途

<141> 2017-12-25

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgattatgg gttcaatctc tgcagctaat gacttttgtg ccgtgacaag cgcgctagag 60

ggtacaagtt caaagtgcta tttttctcgg agtggatgta ccaggttttt aagagataaa 120

aatttcttgc gtcaaaataa cgtgttggac ttgttgatcc tctcgacaat ctgtcaggca 180

agactttcgg atgcgaaaag aagaaagttg ttaaaataat cgtgcatcgg aattggtaat 240

ttagcgcgaa a 251

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgattatgg gttcaatctc t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcgcgcta aattaccaa 19