一种免清洗的细胞膜红色荧光成像试剂及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种免清洗的细胞膜红色荧光成像试剂及其制备方法和用途。该细胞膜成像试剂由两端分别修饰有胆固醇和吲哚菁染料的聚乙二醇高分子构成。该成像试剂制备简单、水溶性及生物相容性良好、成像快速且无需清洗操作。此外，该试剂还能够实现对斑马鱼胚胎表皮细胞的细胞膜的原位成像。该试剂将在细胞和生物活体层次的细胞膜成像方面发挥重要应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种免清洗的细胞膜红色荧光成像试剂及其制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

细胞膜作为细胞和环境之间的关键边界，为细胞提供一个相对稳定的内环境，同时对细胞与外界环境之间的物质运输、能量转换和信息传递过程也起着至关重要的作用。细胞膜的状态变化，可以反映细胞本身形貌和存活状态的变化。例如，即将发生凋亡的细胞往往会在细胞膜上分泌许多凋亡小泡，而细胞坏死时细胞膜上则会产生直径达数微米的大泡，并伴随细胞肿胀变圆等现象。细胞膜成像技术是生物医学领域的一项重要研究手段，利用荧光染料对细胞膜进行标记和示踪，可以揭示包括胞饮、胞吐、细胞分裂及凋亡在内的许多重要的生物学过程。然而，目前大多数细胞膜荧光探针所实现的成像效果并不理想。首先，商品化的细胞膜成像试剂(如DiD、CellMask等)易被细胞内吞，细胞膜成像时间相对较短，难以实现长时间范围内的观测。其次，目前大多数细胞膜染料都是发绿色荧光的，而生物样品在这一波段的自发荧光较强。这会导致信噪降低，并且容易对成像造成干扰。更重要的是，现有的细胞膜探针大多局限在体外的细胞膜成像应用，而在体内层面(如斑马鱼胚胎)的细胞膜成像应用则很少见报道。这是因为绝大多数的细胞膜成像试剂需要经过清洗操作，这在体外培养时是可行的，但在体内成像观察时清洗操作就无法实施，所以开发能够免清洗的细胞膜成像试剂是实现体内成像的关键。综上所述，开发一种发红色荧光、成像效果稳定且能够实现体内层面细胞膜成像的细胞膜荧光探针具有迫切的应用需求。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种免清洗的细胞膜红色荧光探针。该探针具有良好的水溶性，能够快速锚定到动物细胞的细胞膜上，并能够在较长时间内对细胞膜进行红色荧光成像。此外，该探针还能够实现对斑马鱼胚胎表皮细胞的细胞膜原位荧光成像。

技术方案：为了实现上述目的，本发明公开了一种免清洗的细胞膜红色荧光成像试剂，该成像试剂可通过聚乙二醇分子两端分别化学修饰胆固醇分子和吲哚菁染料分子获得。

优选的，所述的吲哚菁染料分子为Cy5或Cy7。

优选的，所述聚乙二醇的分子量为1000-10000。进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为1800-2200。更进一步优选的，所述聚乙二醇的分子量为2000。

进一步的，本发明还提供了一种制备用于免清洗细胞膜红色荧光成像的方法，包括以下步骤：

取N-羟基琥珀酰亚胺酯-吲哚菁染料分子，溶于磷酸缓冲液中，并迅速与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室温下反应，结束后，纯化，冷冻干燥，即得。

更具体的制备方法如下：

步骤1、称取N-羟基琥珀酰亚胺酯-吲哚菁染料分子，溶于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，并迅速与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子混合，室温下反应4小时以上，其中染料分子与胆固醇-聚乙二醇-氨基分子的摩尔比为(0.5-2.5)：1，优选为1.5：1；

步骤2、反应结束后，用预定截留分子量的透析袋在超纯水中对反应后溶液进行纯化，然后冷冻干燥，在-20℃中冷冻保存，备用。

进一步的，本发明还提供了所述细胞膜红色荧光成像试剂在细胞膜成像中的应用，所述试剂能够实现对体外培养细胞或体内细胞的细胞膜成像，例如实现对斑马鱼胚胎表皮细胞的细胞膜体内原位成像。

本发明所述的荧光探针由胆固醇分子、聚乙二醇和吲哚菁染料分子三部分组成。其中聚乙二醇和吲哚菁染料分子都具有极好的水溶性，而胆固醇分子为疏水单元，因此整个荧光探针是一个两亲性分子。在水溶液中，该探针会自组装形成具有胶束结构的纳米颗粒；当与细胞膜相互作用时，该纳米颗粒会解组装，胆固醇分子则疏水锚定至细胞膜的磷脂双分子层中，从而将荧光分子标记在细胞表面。与其他较疏水的荧光染料(如异硫氰酸荧光素)相比，吲哚菁染料分子不会对胆固醇插膜过程造成干扰，保证了整个成像试剂极好的细胞膜亲和性，并能成功实现无需清洗的细胞膜荧光成像。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

(1)免清洗成像：在对细胞染色后无需清洗即可直接进行观察，简化了染色步骤；

(2)红色荧光成像：相比于大多数市售的细胞膜绿色荧光探针，本发明所述的红色荧光探针能够有效提高成像的信噪比，提高成像质量；

(3)成像效果稳定：该荧光探针对细胞膜具有很强的亲和性，即使在很低浓度下也能够实现对细胞膜的高质量成像；此外，该探针成像时间较长，短时间内能够稳定锚定在细胞膜上而不易被细胞内吞；

(4)安全性良好：该染料对细胞的毒性较低，在染色过程中不会影响细胞活性；

(5)体内成像应用：相比于市售的细胞膜荧光染料，本发明所述的荧光探针不仅能够实现离体动物细胞的细胞膜成像，还能够原位地对斑马鱼胚胎表皮细胞的细胞膜进行成像，具有广阔的体内成像应用前景。

附图说明

图1是本发明的分子结构示意图。

图2是本发明试剂对人肺癌细胞的染色效果图。

图3是本发明试剂与人肺癌细胞孵育不同时间后的染色效果图。

图4是本发明试剂对人肺癌细胞的毒性评价结果。

图5是本发明试剂对斑马鱼胚胎的表皮细胞的细胞膜染色效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下实施例中，原料N-羟基琥珀酰亚胺酯-Cy5和胆固醇-聚乙二醇-氨基(cholesterol-PEG2000-NH₂)均可以通过市售获得。

实施例1

所述的免清洗细胞膜红色荧光探针合成过程如下：

步骤1、首先称取N-羟基琥珀酰亚胺酯-Cy5(NHS-Cy5)染料分子1mg，溶于pH＝7.4的磷酸缓冲液中。随后迅速与1.96mg的胆固醇-聚乙二醇-氨基(cholesterol-PEG2000-NH₂)分子混合，室温下反应4小时以上；

步骤2、反应结束后，用预定截留分子量的透析袋在超纯水中对溶液进行纯化，然后冷冻干燥，在-20℃中冷冻保存，备用。

上述方法所得的试剂记为胆固醇-聚乙二醇-Cy5，分子结构式见图1。

实施例2

将实施例1中的荧光分子换为NHS-Cy7，其他反应参数与实施例1中的相同。

实施例3

观察实施例1所制得的胆固醇-聚乙二醇-Cy5对人肺癌细胞(A549)质膜的染色情况，其方法如下：

A549细胞于8孔板中培养24小时后，将胆固醇-聚乙二醇-Cy5按浓度2μg/mL分散于DMEM完全培养基并加入8孔板(200μL/孔)中，于37℃、5％CO₂环境中孵育10分钟后进行观察。

共聚焦荧光显微镜成像观测：胆固醇-聚乙二醇-Cy5在638nm的激发光下发出红色荧光，结果见图2。由图可见，胆固醇-聚乙二醇-Cy5非常均一地分布于细胞膜上。虽然成像前没有经过PBS缓冲液清洗，但成像信噪比仍然非常高，背景中没有红色荧光干扰。因此，胆固醇-聚乙二醇-Cy5能够实现免清洗的细胞膜红色荧光成像。

实施例4

观察实施例1所制得的胆固醇-聚乙二醇-Cy5与A549细胞孵育不同时间后的成像效果，其方法如下：

A549细胞在8孔板中培养24小时后，将含有2μg/mL胆固醇-聚乙二醇-Cy5的DMEM完全培养基加入8孔板(200μL/孔)中。细胞在37℃、5％CO₂环境中分别孵育10分钟、2小时和4小时后，在共聚焦显微镜下进行观察。

结果见图3(a-c)。由图可见，胆固醇-聚乙二醇-Cy5在与细胞孵育2小时内都能够实现良好的细胞膜成像效果而不被细胞内吞，在孵育4小时后有部分探针进入到细胞内部。因此，该荧光探针能够实现至少2小时的细胞膜特异性成像，优于目前商品化的细胞膜染料。

实施例5

评价实施例1所制得的胆固醇-聚乙二醇-Cy5的细胞暗毒性，步骤如下：将A549细胞按5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，培养24小时后，再与不同浓度的胆固醇-聚乙二醇-Cy5避光孵育24小时，最后利用MTT检测法评价该探针的细胞毒性，结果见图4。实验结果表明，该细胞膜荧光探针在较高的浓度下也几乎没有细胞毒性。

实施例6

观察实施例1所制得的胆固醇-聚乙二醇-Cy5对斑马鱼胚胎的表皮细胞染色情况，步骤如下：选取正常发育的斑马鱼卵进行染色实验。在斑马鱼胚胎发育到60hpf时，将胚胎暴露于含有2μg/mL胆固醇-聚乙二醇-Cy5的培养液中，染色15分钟。随后，将胚胎小心吸出并转移至共聚焦培养皿中，实验中可使用少量麻醉剂MS222对胚胎进行麻醉，将其调整到适当的方位。利用共聚焦显微镜对胚胎进行逐层扫描，最后对所得图像进行三维重建。

共聚焦成像结果(图5)表明，胆固醇-聚乙二醇-Cy5能够实现对斑马鱼胚胎表皮细胞的细胞膜进行荧光成像，可以清晰地观察到胚胎表皮细胞的分布及形态。此外，该荧光探针染色过程方便，仅需简单浸泡即可，并且染色时间快(15分钟)，染色完成后无需清洗。由于活体生物在绿光波段具有较强的自发荧光，该红色荧光探针能够有效提高成像的信噪比。因此，该荧光探针具有优异的体内成像效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。