一种提高重金属有效性的细菌D10及其应用

摘要

本发明公开了一种提高重金属有效性的细菌D10及其应用。一种提高重金属有效性的细菌D10，分类命名为Sinorhizobium meliloti D10，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2016554。以D10菌株为原料，经培养基活化后制备成菌悬液。在矿区重金属污染土壤中，接种D10菌悬液可以增加促进能源植物生长，增加植物根际土壤提取态铜含量，提高植物根中铜含量和铜总吸收量。接种D10处理的苜蓿和黑麦草可以用于重金属污染土壤的固定修复，接种D10处理的甜高粱既可以进行固定修复又可以进行提取修复。并且接种D10菌悬液后，植物根际微生物产IAA含量增加，土壤肥力提升。

说明书

技术领域

本发明属于农业技术和环境污染治理应用领域，涉及一种提高重金属有效性的细菌D10及其应用。

背景技术

近年来由于矿山开采活动导致的农田重金属污染，对食品安全和人类健康造成了严重的影响。植物修复是一种能够实现对重金属污染治理的环境友好型治理措施。但是大部分的超富集植物由于其农业生产要求太苛刻而难以野外种植，同时生物产量亦比较小，从而限制了超富集植物大规模的农田实践应用。利用具有生物产量高、生长速度快、重金属耐受能力强的能源植物(如甜高粱)作为植物提取材料是可行的。

根瘤菌不仅能够与豆科植物共生固氮，为豆科植物提供氮素营养，还具有一般促生细菌的特性，如分泌IAA、铁载体、ACC脱氨酶，从而促进植物的生长。有些根瘤菌可以产生有机酸等物质活化土壤中的重金属，从而促进植物对重金属的吸收。已有研究主要利用根瘤菌-豆科植物共生固氮作用，例如Carrasco等(2005)研究发现，在重金属污染土壤中接种菌株Sinorhizobium meliloti Alf12后紫花苜蓿生长良好，氮素含量有所提高。Fan等(2012)发现在Cu胁迫下接种菌株S.meliloti CCNWSX0020，使苜蓿的生物量增加了78.2％，且植物体内重金属含量增加了39.3％。但草本苜蓿的生物总量小，不适合植物提取修复。

因此，在矿区废弃地、污染土壤等边际土壤上引种生物量大、能大面积栽种和推广的植物(如甜高粱、黑麦草等)，接种合适的植物促生根瘤菌，提高能源植物生产高生物量，固定或提取重金属，改良土壤质量，改善生态环境。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种提高重金属有效性的细菌D10及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种提高重金属有效性的细菌D10，分类命名为Sinorhizobium meliloti D10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月10日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2016554。菌落圆形，半透明，湿润，有粘液。菌体短杆状，无芽孢，产荚膜。能够利用葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、麦芽糖和乳糖为碳源，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶阳性，利用柠檬酸盐。好氧，最适生长温度为25-30℃，最适pH为6.5-7.5。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在促进能源植物生长和/或联合能源植物改良重金属污染土壤中的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在提高能源植物根际重金属有效性中的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在提高根际土壤肥力的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在提高能源根际土壤转化酶和脲酶中的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在提高能源土壤有机质含量的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10在增加能源植物根中铜含量的应用。

所述的植物促生细菌D10在增加能源植物吸收铜总量的应用。

所述的植物促生细菌D10在提高能源根际土壤微生物产IAA含量的应用。

所述的提高重金属有效性的细菌D10联合黑麦草或甜高粱在改良重金属污染土壤的应用。

有益效果

本发明筛选到一株不只能够促进苜蓿生长、吸收根际重金属的根瘤菌Sinorhizobium meliloti D10，而且该根瘤菌还能够促进在重金属污染土壤中生物量更大的甜高粱和黑麦草的生长、吸收根际重金属、提高土壤重金属的有效性。

本发明所述的Sinorhizobium meliloti D10菌株在促进植物生长和提高植物重金属含量的应用。与现有技术相比有如下优点：

(1)本发明所述的Sinorhizobium meliloti D10能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达54mg/L。

(2)Sinorhizobium meliloti D10菌株能够耐受150mg/L Cu²⁺、50mg/L>2+和750mg/L>2+离子。

(3)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿根和地上部的干重分别显著增加78.1％和72.2％(p<0.05)，甜高粱根和地上部干重分别显著增加28.6％和39.3％(p<0.05)。

(4)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的甜高粱根际土壤中DTPA态Cu含量增加显著了29.1％(p<0.05)。

(5)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿根际醋酸铵提取态Cu含量显著提高了32.9％(p<0.05)。

(6)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿根和地上部Cu总吸收量分别显著增加1.1倍和1.0倍，甜高粱根和地上部Cu总吸收量分别显著增加34.9％和30.0％。

(7)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿和黑麦草可以用于重金属污染土壤的固定修复，接种Sinorhizobium meliloti D10处理的甜高粱既可以进行固定修复又可以进行提取修复。

(8)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的黑麦草根际土壤中转化酶活性显著增加了35.2％。

(9)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的甜高粱根际脲酶活性显著增加了22.4％。

(10)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿和甜高粱根际土壤中微生物产IAA的总量显著增加，增幅分别为74.2％和42.5％。

(11)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的甜高粱根际土壤中水溶性糖含量显著增加了22.6％。

(12)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿根际土壤中速效P含量显著增加了26.6％。

(13)接种Sinorhizobium meliloti D10处理的苜蓿和甜高粱根际土壤中有机质含量显著增加了18.5％和18.3％。

生物样品保藏信息

植物促生细菌D10，分类命名为苜蓿中华根瘤菌D10(Sinorhizobium melilotiD10)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2016年10月10日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2016554。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

以下实施例中除特例说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

实施例1

本发明耐重金属的植物促生细菌D10菌株从生长于重金属污染土壤的苜蓿(Medicogo sativa L.)根瘤中分离纯化得到，分离鉴定方法如下：

将苜蓿从土壤中轻轻拔出，抖落根部松散土壤并用水冲洗干净。选取主根上饱满、直径大的粉红色根瘤，用剪刀连根剪下。将剪下的根瘤放入去离子水中浸泡4-5min，去掉其残留的杂质，用75％乙醇浸泡消毒2-3min，水洗2-3次，3％NaClO溶液浸泡5min，最后用无菌去离子水清洗5-7次。在无菌操作条件下，将表面消毒的根瘤放入含有0.3％刚果红的YMA固体平板[甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>20.05g，Rh微量元素液4.0ml(H₃BO>3MoO₄>2O>2O>

将菌株接种于YMA培养液[甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgSO₄·7H₂O>40.5g，NaCl>2>3BO>3MoO₄>2O1000mL)，H₂O>

实施例2菌株D10的活化和菌悬液制备

将D10(CCTCC NO：M 2016554)斜面菌种接种于TY固体培养基(胰蛋白胨5.0g，酵母膏3.0g，CaCl₂>2>

实施例3菌株D10产IAA的能力

根据Gordon和Weber(1951)的测定方法，用试管分装TY液体培养基，每管4mL，121℃高温灭菌后加入过滤除菌的2.5mg/mL色氨酸溶液1mL，使培养基中色氨酸的终浓度为0.5mg/mL。将D10(CCTCC NO：M 2016554)接种于上述培养基中，30℃摇床振荡培养3d。发酵液于12000r/min离心5min，取上清液1mL，加入10mM的正磷酸50μL，再加2mL Sackowski's显色剂，充分混合，黑暗下25℃显色30min，于530nm波长下测定吸光值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、40、60mg/L的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。结果表明D10(CCTCC NO：M 2016554)能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达54mg/L。

实施例4菌株D10对重金属的抗性

将过滤除菌的10g/L的重金属母液加入到TY液体培养基中，配制成含有不同重金属浓度的液体试管。重金属浓度(单位mg/L)设置为：Cu²⁺：50、100、150、200；Cd²⁺：25、50、75、100；Pb²⁺：150、250、500、750。将实施例2所得的菌悬液按2％接种量接入试管中，28℃摇床培养5-7d，待菌株长出后观察并比较其生长情况。

表1菌株D10对重金属的抗性

注:+表示能够生长,-表示死亡.

实施例5菌株D10促进植物生长和吸收重金属的作用

采用盆栽实验。土壤采用汤山铜矿废弃地重金属污染土壤，将风干过筛土壤分装，每盆2.0kg，种植前5天浇水，以土壤充分吸水湿润为宜。选取大小、色泽、饱满度一致的苜蓿、黑麦草和甜高粱种子，用75％的无水乙醇表面消毒2min、3％的NaClO消毒5min，用无菌水漂洗5-7次。将表面消毒后的种子浸润在实施例2所得的菌悬液中4h，以灭菌的菌悬液作为对照组(CK)。将处理好的种子播种于盆钵中，出苗后进行第一次间苗，接种菌悬液于植物根部，每盆20ml，出苗1-2周后进行第二次间苗和接种，每个处理3组重复。实验过程中，定期定量浇水，不定期锄草、捡去落叶，90d后采样处理，处理前3天不浇水。

土壤和植物样品的采集：松动盆钵土壤，将植物小心取出，轻轻抖动植物以抖去与植物根部附着不紧密的土壤，收集与根部附着紧密的土壤即为根际土壤。将根际土壤分别分装两份带回实验室，一份放置于4℃冰箱保存，一份进行风干处理。

植物生物量测定：沿着植物根茎结合处分离植物，分为根部和地上部。将植物根部浸泡在0.01M EDTA-Na₂溶液中10min，以去除根部表面的重金属，用去离子充分漂洗干净。将植物样品于105℃烘箱中杀青1h后80℃条件下烘干至恒重，称取植物干重。

植物样品Cu含量分析：采用微波消解法进行消解，ICP-OES测定溶液中Cu含量。植物铜的转移系数＝C_S/C_R，其中，C_S和C_R分别为植物地上部和根部的Cu含量。

由表2可知，在重金属污染土壤中菌株D10对供试植物的促生效果表现为苜蓿>甜高粱>黑麦草，可使苜蓿根和地上部的干重分别显著增加78.1％和72.2％(p<0.05)，使甜高粱根和地上部干重分别显著增加28.6％和39.3％(p<0.05)，但仅能促进黑麦草地上部干重增加，不能促进黑麦草根干重增加。

表2菌株Sinorhizobium meliloti D10对植物的促生作用

由表3可知，三种植物的根比地上部积累较多重金属Cu。与对照相比，接种菌株D10显著增加苜蓿和甜高粱根部Cu含量，增加率分别为18.3％和16.7％。由于接菌处理后苜蓿和甜高粱的生物量显著增加，Cu总吸收量也显著增加。D10促进苜蓿根和地上部Cu总吸收量分别显著增加1.1倍和1.0倍。接种D10后甜高粱根和地上部Cu总吸收量分别显著增加34.9％和30.0％，总量分别达到530.3μg/盆和499.8μg/盆。可见甜高粱对重金属Cu的富集能力较强。在实际应用过程中，苜蓿和黑麦草可以用于重金属污染土壤的固定修复，甜高粱既可以进行固定修复又可以进行提取修复。

表3接菌处理对植物吸收铜的影响

实施例6菌株D10可以增加植物根际Cu有效性

采用实施例5中的土壤样品，分别测定土壤中提取态和交换态Cu含量：按土水比1:4的比例分别加入DTPA和1mol/L NH₄Ac提取液，震荡，离心，ICP-OES测定上清液中Cu含量。

植物根际土壤中重金属的生物有效性是制约植物提取效率的关键因素之一。而土壤中重金属的存在形态决定了重金属的生物利用率。由表4可知，接种菌株D10能够提高植物根际土中DTPA提取态Cu的含量(7.1％-29.1％)，其中甜高粱根际土壤中DTPA态Cu含量增加显著(p<0.05)。接种D10后苜蓿根际醋酸铵提取态Cu含量显著提高了32.9％(p<0.05)，黑麦草和甜高粱根际醋酸铵提取态Cu含量增加不显著。

表4菌株D10对植物根际土壤有效态Cu含量(mg/kg)的影响

实施例7菌株D10可以促进植物根际土壤酶活性和IAA含量

采用实施例5中的土壤样品，参考关松萌《土壤酶及其研究方法》(1986)，使用3,5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性，利用靛酚比色法测定土壤中脲酶活性。按土水比1:10的比例加入无菌水，震荡30min，取0.1ml土壤悬液加入到实施例3中的含色氨酸的培养基中，按照实施例3的方法测定土壤微生物产IAA含量。

转化酶又名蔗糖酶，可以增加土壤中易溶性营养物质，利于植物对营养的吸收，从而促进植物的生长。一般来说，蔗糖酶活力越高，土壤肥力越强。脲酶广泛存在于土壤中，在尿素的转化过程中起到了重要作用，其酶促产物氨是植物主要氮源之一。由表5可知，接菌处理后黑麦草根际土壤中转化酶活性要明显高于苜蓿和甜高粱根际转化酶活性。与对照组相比，接种菌株D10处理使得黑麦草根际土壤中转化酶活性显著增加了35.2％，并显著提高了甜高粱根际脲酶活性，增幅为22.4％。其它处理组的转化酶和脲酶活性的变化达不到显著差异水平。土壤中微生物产IAA的总量可以间接反应根际土壤中促生菌的数量和活性。接种菌株D10显著增加了苜蓿和甜高粱根际土壤中微生物产IAA的总量，增幅分别为74.2％和42.5％。

表5菌株D10对植物根际土壤酶活性和微生物产IAA含量的影响

实施例8菌株D10可以改良植物根际土壤肥力

采用实施例5中的土壤样品，参考王学奎《植物生理生化实验原理和技术》(2006)，使用苯酚法测定土壤中水溶性糖含量。按土水比1:4的比例加入1mol/L NH₄Ac提取液，震荡，离心，取上清液过0.45μm滤膜，ICP测定溶液中P、K含量。参考鲍士旦《土壤农化分析》(2005)，利用重铬酸钾法测定土壤中有机质含量。

土壤肥力是衡量土壤能够提供植物生长所需的各种养分的能力，养分(有机质)、养分有效状态(速效P和速效K含量)都是土壤肥力评价指标。由表6可知，黑麦草和甜高粱根际土壤中水溶性糖含量明显高于苜蓿根际水溶性糖含量。接种菌株D10后甜高粱根际土壤中水溶性糖含量显著增加了22.6％。土壤中P、K元素是植物生长所需的主要营养元素。由表6可知，接种菌株D10后苜蓿根际土壤中速效P含量显著增加了26.6％，其它处理组均无显著性差异。各处理组的根际速效K含量均无显著性差异。苜蓿和甜高粱根际土壤中有机质含量显著增加了18.5％和18.3％。说明菌株D10可以提高苜蓿、黑麦草和甜高粱的根际土壤肥力，有利于植物生长，并对矿区废弃地贫瘠土壤具有一定的改良作用。

表6菌株D10对植物根际土壤有机质、水溶性糖、速效P和速效K含量的影响