一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法

摘要

本发明公开了一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，属于环境中有机物分析领域，包括水样预处理、新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB富集浓缩、UPLC‑MS/MS测定孕激素浓度、标准曲线的绘制及上机测定五个步骤，采用新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB作为环境水样的预处理技术，既提高了对待测物的选择性，也大大增加了富集倍数和降低了基质效应，并且以超高液相‑质谱连用仪为检测定量工具，同时测定了水环境中11种不同孕激素，与普通的检测方式相比，实现了对孕激素的高选择性和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快、使用范围广等优点。

说明书

技术领域

本发明属于环境水体中有机物分析技术领域，具体涉及一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法。

背景技术

在过去半个世纪，孕激素对人类和野生动物赖以生存的自然环境造成了严重的危害，已经成为全球范围内共同亟待解决的环境污染问题，引起了人们的广泛关注。孕激素作为一种常见的内分泌干扰物可长期蓄积在环境与人体内，代谢缓慢，可通过扩散、对流转移至大气、土壤，水域沉积物等各种环境介质中。一旦进入机体，不仅可以扰乱机体正常的内分泌激素的合成与代谢，影响生长发育和性别分化，还能引起神经、内分泌、免疫等多系统发育异常和生殖障碍，甚至致畸和致癌等。因此，建立快速、高效、准确、灵敏的环境水体中孕激素分析检测方法非常重要。

由于环境样品形态多样、成分复杂而且孕激素含量较低的特点，难以直接对其进行分析检测。为了减少样品基底的干扰和提高分析检测灵敏度，在进行样品分析前必须进行合适的样品预处理才能进行各种仪器分析。环境样品中环境激素预处理技术的传统方法有超声波提取、索氏提取、微波萃取等。但超声波提取溶剂消耗量大、索氏提取时间长，且需要回流操作；微波萃取后需要过滤，难以与仪器联机。目前，随着科技的发展，很多新型的样品预处理技术应运而生，如SPE、SPME。SPME技术作为一种新型的样品前处理技术，随着其应用领域的不断扩大，但其萃取纤维本身的一些局限性导致新问题不断出现，回收率和重复性得不到保证。而SPE可以作为环境激素预处理的一种新型技术，其回收率较高和重现性较稳定，但由于环境样品形态多样、成分复杂而且待测物含量较低的特点，对SPE技术提出了更高的要求。Oasis PRiME HLB作为一种新型反相固相萃取吸附剂，能够简化和加速SPE流程，它可以在更短的时间内提供更洁净的样品，使液相色谱和液质联用系统的分析更为轻松。Oasis PRiME HLB柱还可以和多孔板可简化萃取流程并加快萃取速度，确保获得一致、可重现的液相和液质联用分析结果。相比于使用其它萃取技术制备样品，分析实验室现在能够更快速地处理样品，速度提升最高40％，而样品洁净度的提高可达70％，并且液质联用的基质效应更小。同时较其它样品前处理方法能够获得更洁净的萃取物。Oasis PRiME HLB是一款非常成功的新一代反相SPE产品，它能够通过更简单的方案、更短的处理时间获得更洁净的提取物，能有效的富集浓缩环境水体中的孕激素，能够作为一种处理环境水体中孕激素的预处理方法。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，能有效的去除环境水体杂质，大大降低了基质效应。

本发明的技术方案为：一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，将待测样品经过新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB预处理后，再用UPLC-MS/MS检测，包括以下步骤：

(1)水样预处理

将采集的水样采用三种不同孔径的滤膜进行三级过滤，精确量取过滤后的水样0.2-2L，并利用浓度为0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0-7.2；

(2)新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB富集浓缩

将步骤(1)处理过的水样直接过Oasis PRiME HLB固相萃取小柱进行富集，流速控制在7-9mL/min，待富集结束后使用超纯水分两次淋洗所述固相萃取小柱，然后将淋洗后的固相萃取小柱在真空干燥箱中干燥1-3h，干燥温度为25-35℃，利用乙酸乙酯对干燥后的固相萃取小柱进行三次洗脱，得到含目标化合物的洗脱液，将所述洗脱液移至氮气吹干仪中，用流速为1.5-2m/s的氮气吹扫30-60min，得到残渣备用；

(3)UPLC-MS/MS测定孕激素浓度

配制标准溶液：分别精确称取1mg所检测孕激素的标准品，并分别使用甲醇定容于100mL的容量瓶中，混合后得到10mg/L的混标储备溶液，于-20℃冰箱中储存；

配制工作溶液：精密量取甲醇溶液500μL溶解步骤(2)中的所述残渣，涡旋后，用玻璃滴管定容1mL并用0.22μm滤膜过滤，再用甲醇溶液进行稀释，得到不同浓度的工作溶液；

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序；流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为10μL；其中所述梯度洗脱程序如下所示：

时间(min)A(％)B(％)010900.5604036535670306.5100081090

质谱条件：采用多反应检测模式，离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为2.5kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为900L/hr；扫描时间为0.1s；

(4)标准曲线的绘制

以步骤(3)中所述混标储备溶液浓度(mg/L)为横坐标，响应值为纵坐标绘制孕激素的标准曲线；

(5)上机测定

将步骤(3)中所述的工作溶液使用UPLC-MS/MS仪器检测，得到实际样品的典型色谱图，将所述实际样品典型色谱图与所述标准曲线进行比对进行定性检测；再使用UPLC-MS/MS仪器的调谐功能，确定各个物质的母离子、子离子、碰撞电压和毛细电压，使用上述参数对工作溶液中的孕激素进行定量检测。

进一步地，所述孕激素分别为米非司酮、氯地孕酮、安宫黄体酮、屈螺酮、孕酮、甲炔诺酮、去氢孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、孕酮-d9、炔诺酮-d6。

进一步地，所述环境水体为污水处理厂进水、出水和河水，两种水源人体接触率高，代表性更强。

更进一步地，所述步骤(1)中当所述水样为污水处理厂进水水样时采集量为200-500mL，当水样为污水处理厂出水水样时采集量为300-500mL,当水样为河水时采集量为1-2L。

进一步地，步骤(2)中所述Oasis PRiME HLB固相萃取小柱内部含有复合吸附填料，所述复合吸附填料为质量比为2:1:1的聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂、三油酸甘油酯纤维球、核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球，所述聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性；所述三油酸甘油酯纤维球具有较强的亲脂性，对孕激素这种类脂类化合物吸附力强且性能稳定；所述核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球具有高度亲水性，富集分离效果良好。

进一步地，所述Oasis PRiME HLB固相萃取小柱不用进行活化和平衡，大大节省了操作时间和溶剂。

进一步地，步骤(1)中所述滤膜的孔径分别为10μm、1μm和0.45μm，梯度过滤，可最大化减小杂质影响分析结果。

进一步地，步骤(2)中所述超纯水与乙酸乙酯的用量均为所述固相萃取小柱体积的1-2倍。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明采用新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB作为环境水样的预处理技术，能有效的去除环境水体杂质，大大降低了基质效应。并结合UPLC-MS/MS作为检测器，能够快速精准的检测环境水体孕激素含量，检测结果准确、可靠。

(2)本发明采用新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB既提高了对待测物的选择性，也大大增加了富集倍数和降低了基质效应，为前处理技术的开发应用提供了新思路，也为对环境中痕量药物残留的提取、浓缩与分离增加了新方法。

(3)本发明以超高液相-质谱连用仪为检测定量工具，同时测定了水环境中11种不同孕激素，与普通的检测方式相比，实现了对孕激素的高选择性和高灵敏度的有效结合，且具有分析速度快、使用范围广等优点。

附图说明

图1为实施例2的固相萃取小柱种类对9种孕激素回收率的影响；

图2为实施例2的不同pH对9种孕激素回收率的影响；

图3为实施例2的不同淋洗液对9种孕激素的影响；

图4为实施例2的不同洗脱液对9种孕激素回收率的影响；

图5.1-5.3为实施例2的11种孕激素提取离子流图。

具体实施方式

实施例1

一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，其中，所述孕激素分别为米非司酮、氯地孕酮、安宫黄体酮、屈螺酮、孕酮、甲炔诺酮、去氢孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、孕酮-d9、炔诺酮-d6。将待测样品经过新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB预处理后，再用UPLC-MS/MS检测，包括以下步骤：

(1)水样预处理

选取污水处理厂进水、出水和河水为水样，两种水源人体接触率高，代表性更强。将采集的水样采用10μm、1μm和0.45μm三种不同孔径的滤膜进行三级过滤，精确量取过滤后的水样，其中，污水处理厂进水水样为200mL，污水处理厂出水水样为300mL,河水采集量为1L，并利用浓度为0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7.0；

(2)新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB富集浓缩

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱不用进行活化和平衡，大大节省了操作时间和溶剂，将步骤(1)处理过的水样直接过Oasis PRiME HLB固相萃取小柱进行富集，流速控制在7mL/min，待富集结束后使用超纯水分两次淋洗所述固相萃取小柱，然后将淋洗后的固相萃取小柱在真空干燥箱中干燥1h，干燥温度为25℃，利用乙酸乙酯对干燥后的固相萃取小柱进行三次洗脱，其中，所述超纯水与乙酸乙酯的用量均为所述固相萃取小柱体积的1倍，得到含目标化合物的洗脱液，将所述洗脱液移至氮气吹干仪中，用流速为1.5m/s的氮气吹扫30min，得到残渣备用；其中，所述Oasis PRiME HLB固相萃取小柱内部含有复合吸附填料，所述复合吸附填料为质量比为2:1:1的聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂、三油酸甘油酯纤维球、核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球，所述聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性；所述三油酸甘油酯纤维球具有较强的亲脂性，对孕激素这种类脂类化合物吸附力强且性能稳定；所述核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球具有高度亲水性，富集分离效果良好。

(3)UPLC-MS/MS测定孕激素浓度

配制标准溶液：分别精确称取1mg所检测孕激素的标准品，并分别使用甲醇定容于100mL的容量瓶中，混合后得到10mg/L的混标储备溶液，于-20℃冰箱中储存；

配制工作溶液：精密量取甲醇溶液500μL溶解步骤(2)中的所述残渣，涡旋后，用玻璃滴管定容1mL并用0.22μm滤膜过滤，再用甲醇溶液进行稀释，得到不同浓度的工作溶液；

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序；流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为10μL；其中所述梯度洗脱程序如下所示：

时间(min)A(％)B(％)010900.5604036535670306.5100081090

质谱条件：采用多反应检测模式，离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为2.5kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为900L/hr；扫描时间为0.1s；

(4)标准曲线的绘制

以步骤(3)中所述混标储备溶液浓度(mg/L)为横坐标，响应值为纵坐标绘制孕激素的标准曲线；

(5)上机测定

将步骤(3)中所述的工作溶液使用UPLC-MS/MS仪器检测，得到实际样品的典型色谱图，将所述实际样品典型色谱图与所述标准曲线进行比对进行定性检测；再使用UPLC-MS/MS仪器的调谐功能，确定各个物质的母离子、子离子、碰撞电压和毛细电压，使用上述参数对工作溶液中的孕激素进行定量检测。

实施例2

一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，其中，所述孕激素分别为米非司酮、氯地孕酮、安宫黄体酮、屈螺酮、孕酮、甲炔诺酮、去氢孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、孕酮-d9、炔诺酮-d6。将待测样品经过新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB预处理后，再用UPLC-MS/MS检测，包括以下步骤：

(1)水样预处理

选取污水处理厂进水、出水和河水为水样，两种水源人体接触率高，代表性更强。将采集的水样采用10μm、1μm和0.45μm三种不同孔径的滤膜进行三级过滤，精确量取过滤后的水样，其中，污水处理厂进水水样为350mL，污水处理厂出水水样为400mL,河水采集量为1.5L，并利用浓度为0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7.1；

(2)新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB富集浓缩

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱不用进行活化和平衡，大大节省了操作时间和溶剂，将步骤(1)处理过的水样直接过Oasis PRiME HLB固相萃取小柱进行富集，流速控制在8mL/min，待富集结束后使用超纯水分两次淋洗所述固相萃取小柱，然后将淋洗后的固相萃取小柱在真空干燥箱中干燥2h，干燥温度为30℃，利用乙酸乙酯对干燥后的固相萃取小柱进行三次洗脱，其中，所述超纯水与乙酸乙酯的用量均为所述固相萃取小柱体积的1.5倍，得到含目标化合物的洗脱液，将所述洗脱液移至氮气吹干仪中，用流速为1.8m/s的氮气吹扫45min，得到残渣备用；其中，所述Oasis PRiME HLB固相萃取小柱内部含有复合吸附填料，所述复合吸附填料为质量比为2:1:1的聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂、三油酸甘油酯纤维球、核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球，所述聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性；所述三油酸甘油酯纤维球具有较强的亲脂性，对孕激素这种类脂类化合物吸附力强且性能稳定；所述核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球具有高度亲水性，富集分离效果良好。

(3)UPLC-MS/MS测定孕激素浓度

配制标准溶液：分别精确称取1mg所检测孕激素的标准品，并分别使用甲醇定容于100mL的容量瓶中，混合后得到10mg/L的混标储备溶液，于-20℃冰箱中储存；

配制工作溶液：精密量取甲醇溶液500μL溶解步骤(2)中的所述残渣，涡旋后，用玻璃滴管定容1mL并用0.22μm滤膜过滤，再用甲醇溶液进行稀释，得到不同浓度的工作溶液；

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序；流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为10μL；其中所述梯度洗脱程序如下所示：

时间(min)A(％)B(％)010900.5604036535670306.5100081090

质谱条件：采用多反应检测模式，离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为2.5kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为900L/hr；扫描时间为0.1s；

(4)标准曲线的绘制

以步骤(3)中所述混标储备溶液浓度(mg/L)为横坐标，响应值为纵坐标绘制孕激素的标准曲线；

(5)上机测定

将步骤(3)中所述的工作溶液使用UPLC-MS/MS仪器检测，得到实际样品的典型色谱图，将所述实际样品典型色谱图与所述标准曲线进行比对进行定性检测；再使用UPLC-MS/MS仪器的调谐功能，确定各个物质的母离子、子离子、碰撞电压和毛细电压，使用上述参数对工作溶液中的孕激素进行定量检测。

实施例3

一种同时检测环境水体中多种孕激素的方法，其中，所述孕激素分别为米非司酮、氯地孕酮、安宫黄体酮、屈螺酮、孕酮、甲炔诺酮、去氢孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、孕酮-d9、炔诺酮-d6。将待测样品经过新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB预处理后，再用UPLC-MS/MS检测，包括以下步骤：

(1)水样预处理

选取污水处理厂进水、出水和河水为水样，两种水源人体接触率高，代表性更强。将采集的水样采用10μm、1μm和0.45μm三种不同孔径的滤膜进行三级过滤，精确量取过滤后的水样，其中，污水处理厂进水水样为500mL，污水处理厂出水水样为500mL,河水采集量为2L，并利用浓度为0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7.2；

(2)新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB富集浓缩

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱不用进行活化和平衡，大大节省了操作时间和溶剂，将步骤(1)处理过的水样直接过Oasis PRiME HLB固相萃取小柱进行富集，流速控制在9mL/min，待富集结束后使用超纯水分两次淋洗所述固相萃取小柱，然后将淋洗后的固相萃取小柱在真空干燥箱中干燥3h，干燥温度为35℃，利用乙酸乙酯对干燥后的固相萃取小柱进行三次洗脱，其中，所述超纯水与乙酸乙酯的用量均为所述固相萃取小柱体积的2倍，得到含目标化合物的洗脱液，将所述洗脱液移至氮气吹干仪中，用流速为2m/s的氮气吹扫60min，得到残渣备用；其中，所述Oasis PRiME HLB固相萃取小柱内部含有复合吸附填料，所述复合吸附填料为质量比为2:1:1的聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂、三油酸甘油酯纤维球、核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球，所述聚N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯大孔树脂通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性；所述三油酸甘油酯纤维球具有较强的亲脂性，对孕激素这种类脂类化合物吸附力强且性能稳定；所述核壳型葡萄糖聚合物-硅胶球具有高度亲水性，富集分离效果良好。

(3)UPLC-MS/MS测定孕激素浓度

配制标准溶液：分别精确称取1mg所检测孕激素的标准品，并分别使用甲醇定容于100mL的容量瓶中，混合后得到10mg/L的混标储备溶液，于-20℃冰箱中储存；

配制工作溶液：精密量取甲醇溶液500μL溶解步骤(2)中的所述残渣，涡旋后，用玻璃滴管定容1mL并用0.22μm滤膜过滤，再用甲醇溶液进行稀释，得到不同浓度的工作溶液；

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱程序；流速为0.3mL/min；柱温为40℃，进样量为10μL；其中所述梯度洗脱程序如下所示：

时间(min)A(％)B(％)010900.5604036535670306.5100081090

质谱条件：采用多反应检测模式，离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为120℃，锥孔电压：30V，提取离子电压为2.5kV，毛细管电压为3kV，脱溶剂气温度为450℃，脱溶剂气流速为900L/hr；扫描时间为0.1s；

(4)标准曲线的绘制

以步骤(3)中所述混标储备溶液浓度(mg/L)为横坐标，响应值为纵坐标绘制孕激素的标准曲线；

(5)上机测定

将步骤(3)中所述的工作溶液使用UPLC-MS/MS仪器检测，得到实际样品的典型色谱图，将所述实际样品典型色谱图与所述标准曲线进行比对进行定性检测；再使用UPLC-MS/MS仪器的调谐功能，确定各个物质的母离子、子离子、碰撞电压和毛细电压，使用上述参数对工作溶液中的孕激素进行定量检测。

结果分析

以下是实施例3的上机测定结果分析：

(一)定性检测

其中，以信噪比的3倍为方法的检测限，则检测限为0.1-0.8ng/L，灵敏度高；且线性相关系数均在0.99以上，线性关系良好。各工作溶液的标准曲线范围、相关系数、检测限等结果如表1所示：

表1方法学检测结果

(二)定量检测

再使用UPLC-MS/MS仪器的调谐功能，确定各个物质的母离子、子离子、碰撞电压和毛细电压，使用上述参数对工作溶液中的孕激素进行定量检测。其中，11种孕激素定量分析质谱参数如表2所示：

表2 11种孕激素的质谱条件

(三)基质效应计算

A：将内标和标准溶液加入按上述步骤(1)处理的水样中，按照步骤(2)对上述孕激素进行提取并按照步骤(3)进行检测，结果定义为C_m；

B：相同的水样，不加内标和标准溶液，按照步骤(2)对上述孕激素进行提取，从提取液中取100μL，氮气吹干，然后加入100μL孕激素混标溶液(50μg/L)，得到的结果定义为C_m+100；

C：孕激素的混标溶液(50μg/L)的标准溶液按照步骤(3)分析，结果定义为C₁₀₀；则基质效应(ME％)的计算结果为ME％＝[(C_m+100-C_m)/C₁₀₀]×100％，结果如表3所示：

表3孕激素基质效应(ME％)

(四)加标回收率计算

D：取污水处理厂进水和出水以及河水水样，加入一定浓度的各待测物的标准溶液按上述步骤(1)处理的水样中，按上述步骤(2)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到相应结果定义为C_a；

E：将一定浓度的各待测物的标准溶液，不经处理，按上述步骤(3)测样得到相应结果C_b；则回收率(RE％)的计算公式为：RE％＝C_a/C_b×100％

本发明考察了3个浓度的回收率，其结果如表4所示，各待测物质的回收率较高，满足分析要求。

表4各待测物在污水处理厂进出水及河水的回收率

(五)含量分析

取污水处理厂进水和出水以及河水水样，加入一定浓度的各待测物的内标溶液按上述步骤(1)处理的水样中，按上述步骤(2)富集浓缩后，按上述步骤(3)测样，得到孕激素含量(ng/L)如表5；

表5污水处理厂和河水中孕激素含量(ng/L)

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。