一种与食管胃交界腺癌相关的生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种与食管胃交界腺癌相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为NFIB。本发明公开了NFIB在食管胃交界腺癌诊断中的应用，以及NFIB在预判胃食管交界区腺癌淋巴结转移、TNM分期和预后中的应用；本发明同时提供了一种诊断食管胃交界腺癌的试剂盒，以及预判食管胃交界腺癌淋巴结转移、TNM分期、预后的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与食管胃交界腺癌相关的生物标志物及其应用，具体的所述生物标志物为NFIB。

背景技术

食管胃交界腺癌是一种特殊类型的恶性肿瘤，其发病率呈逐渐上升的趋势。现已成为西方发达国家发病率增长最快的恶性肿瘤之一。因此，对食管胃交界腺癌的研究已日益受到全球的重视。由于临床上80％以上就诊的食管胃交界腺癌患者均为中晚期，中晚期患者5年生存率较低，且预后极差。在既往的研究中，曾把食管胃交界癌归为食管腺癌或者胃癌，但近来发现，其与胃癌和食管癌相比具有独特的分子特征、病例演变以及临床表现。目前，食管胃交界腺癌的首选治疗方法仍然是手术治疗。由于其组织学为腺癌或粘液腺癌，放射治疗几乎无效，化学治疗效果也甚微。目前尚缺乏敏感性强、特异性高的标志物用于食管胃交界腺癌的诊断和治疗。

NFI家族转录因子是具有特异性结合位点的DNA结合蛋白，又被称为CTF或CAAT盒转录因子。NFI家族转录因子包括NFIA、NFIB、NFIC和NFIX四个成员，这四种NFI基因人基因组中呈现出特异性表达。NFI转录因子家族可调控病毒基因组DNA复制和多种细胞基因表达。除此以外，NFI蛋白还和细胞生长状态变化及一系列肿瘤的发生发展相关。

NFIB(NuclearFactorI/B)是NFI家族成员之一，此基因在脊椎生物中具有很高的转录活性，已有研究证实NFIB基因可以调控100多个基因的表达，这些基因表达在脑、肺脏、肝脏和小肠中，NFIB基因在肺脏发育成熟过程中可以调控细胞的增殖和分化。其异常表达参与多种肿瘤的发生发展过程，在白血病细胞系HL-60中，miR-21能够靶向NFIB，并且NFIB能够负向调控miR-21的表达，因此其相互作用能够调控HL-60细胞的存活。有研究表明NFIB在某些肿瘤中发挥癌基因的作用，如小细胞肺癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、星型细胞瘤、骨肉瘤中，NFIB能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。

目前NFIB在食管胃交界腺癌中的功能未见报道，探讨NFIB在食管胃交界腺癌中的生物学功能，对于食管胃交界腺癌的临床治疗以及基础研究具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种敏感性高的生物标志物应用于食管胃交界腺癌的诊断，以及预判食管胃交界腺癌的淋巴结转移和预后。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了如下任一项所述应用：

a)检测NFIB水平的试剂在制备诊断食管胃交界腺癌的产品中的应用；

b)检测NFIB水平的试剂在制备预判食管胃交界腺癌淋巴结转移的产品中的应用；

c)检测NFIB水平的试剂在制备预判食管胃交界腺癌TNM分期的产品中的应用；

d)检测NFIB水平的试剂在制备预判食管胃交界腺癌预后的产品中的应用。

其中，a、当NFIB高表达时，患者患有食管胃交界腺癌或者存在患食管胃交界腺癌的风险；

b、当NFIB高表达时，食管胃交界腺癌存在淋巴结转移；

c、当NFIB高表达时，食管胃交界腺癌TNM分期高；

d、当NFIB高表达时，食管胃交界腺癌预后较差，生存期和无病生存期较短。

进一步，所述试剂包括检测NFIB mRNA水平的试剂，或检测NFIB蛋白水平的试剂。

进一步，所述检测NFIB mRNA水平的试剂包括特异性识别基因的探针，或特异性扩增基因的引物。

进一步，所述检测基因蛋白水平的试剂包括NFIB蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质NFIB的受体、结合蛋白质NFIB的凝集素、针对蛋白质NFIB的抗体、针对蛋白质NFIB的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。

进一步，所述NFIB蛋白的特异性结合剂为NFIB的特异性抗体。

本发明提供了如下任一所示的试剂盒：

a)一种诊断食管胃交界腺癌的试剂盒，包括检测NFIB水平的试剂；

b)一种预判食管胃交界腺癌淋巴结转移的试剂盒，包括检测NFIB水平的试剂；

c)一种预判食管胃交界腺癌患者TNM分期的试剂盒，包括检测NFIB水平的试剂；

d)一种预判食管胃交界腺癌患者预后的试剂盒，包括检测NFIB水平的试剂。

进一步，所述试剂盒a中包括使用说明书a，使用说明书a记载如下内容：利用检测NFIB水平的试剂检测食管胃交界腺癌样本，当样本中的NFIB高表达时，患者患有食管胃交界腺癌或存在患有食管胃交界腺癌的风险；

所述试剂盒b中还包括使用说明书b，使用说明书b中记载如下内容：利用检测NFIB水平的试剂检测食管胃交界腺癌样本，当样本中NFIB高表达时，食管胃交界腺癌存在淋巴结转移；

所述试剂盒c中还包括使用说明书c，使用说明书c中记载如下内容：利用检测NFIB的试剂检测食食管胃交界腺癌样本，当样本中的NFIB高表达时，食管胃交界腺癌的TNM分期高；

所述试剂盒d中还包括使用说明书d，使用说明书d中记载如下内容：利用检测NFIB的试剂检测食食管胃交界腺癌样本，当样本中的NFIB高表达时，食管胃交界腺癌的预后较差。

进一步，所述试剂盒a、所述试剂盒b、所述试剂盒c、所述试剂盒d中，检测NFIB水平的试剂为用基因芯片检测时使用的试剂、用荧光定量PCR法检测时使用的试剂、用普通PCR法检测时使用的试剂、或用免疫测定法检测时使用的试剂。

进一步，所述免疫测定法为免疫组化法。

进一步，所述用基因芯片检测时使用的试剂为基因芯片，所述用荧光定量PCR法检测时使用的试剂为荧光定量PCR引物，所述用普通PCR法检测时使用的试剂为普通PCR引物，所述用免疫组化法检测时使用的试剂为所检测蛋白的特异性抗体。

进一步，利用免疫组化法检测的试剂还包括HRP标记二抗和组化试剂盒DAB显色剂。

附图说明

图1是利用免疫组化方法检测NFIA和NFIB在食管胃交界腺癌中的表达情况图；其中，图A是NFIA在食管胃交界腺癌癌旁组织、淋巴结转移和未转移的食管胃交界腺癌组织的免疫组化图，图B是NFIA和NFIB在食管胃交界腺癌组织与癌旁组织中的表达情况图，图C是NFIA和NFIB在发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移的食管胃交界腺癌组织中的表达情况图。

图2是NFIA和NFIB在食管胃交界腺癌患者总生存率和无病生存率中的Kaplan-Meier曲线图；其中，图A是NFIA在食管胃交界腺癌患者总生存率中的Kaplan-Meier曲线图，图B是NFIA在食管胃交界腺癌患者无病生存率中的Kaplan-Meier曲线图，图C是NFIB在食管胃交界腺癌患者总生存率中的Kaplan-Meier曲线图，图D是NFIB在食管胃交界腺癌患者无病生存率中的Kaplan-Meier曲线图。

具体的实施方式

本发明通过对已接受外科手术治疗的食管胃交界腺癌患者的临床病理资料进行整理研究，使用免疫测定方法中的免疫组织化学(IHC)检测NFI转录因子在癌组织和癌旁组织中的表达水平，并分析NFI转录因子的表达与食管胃交界腺癌患者临床分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移等临床病例因素的关系，通过构建Cox风险比例回归模型，进一步分析NFI转录因子在预判食管胃交界腺癌患者的预后中的意义，为食管胃交界腺癌的诊断及预后提供重要的理论依据。

检测试剂

“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记(Labeling)作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA(singlestrandedDNA)探针、双链DNA(doublestrandedDNA)探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测食管胃交界腺癌预后。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3’末端羟基(游离3’羟基)的核酸序列，它可以与互补模板(template)形成碱基对(basepair)并充当复制模板的起点。在本发明中，可以通过以下方式预测食管胃交界腺癌预后：通过进行使用本发明的标记多核苷酸的正向和反向引物的PCR扩增，所需的产物是否产生。可以基于本领域已知内容修改PCR条件和正向引物和反向引物的长度。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

如本文所用，“检测基因的表达水平”或“检测基因水平”指确定生物样品中标记基因的mRNA或蛋白存在及其表达水平以便预测胃癌预后的过程并且通过测量mRNA或蛋白的量可实现。

用于此确定样品中基因mRNA水平的分析方法是但不限于RT-PCR、竞争性RT-PCR(competitiveRT-PCR)、实时RT-PCR(Real-timeRTPCR)、RNA酶保护测定法(RPA；RNaseprotectionassay)、northern印迹法(northernblotting)、DNA微阵列芯片等。

用于确定样品中基因蛋白水平的分析方法是但不限于western印迹法(westernblotting)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射性免疫测定(Radioimmunoassay)、放射性免疫扩散法(Radioimmunodiffusion)、奥克特洛尼(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(Rocket)电泳法、组织免疫染色法、免疫沉淀测定法(immunoprecipitationassay)、补体结合测定法(completefixationassay)、FACS、蛋白质芯片(proteinchip)等。

术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势在于它们一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明的抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

试剂盒

试剂盒包括检测NFIB基因或蛋白的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

预后

“预后”指关于医学发展(例如，长期存活可能性、无疾病存活率等)的预期，包括积极预后或消极预后，所述消极预后包括疾病进展如复发，肿瘤生长、转移和耐药死亡率(mortality)，并且积极预后包括疾病缓解如无疾病状态，疾病改善如肿瘤消退或稳定(stabilization)。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的组织或材料，其可包括本发明的标志物。在本发明的具体实施例中，样品可以是肿瘤或肿瘤组织，并且可包括例如含有来自其的与肿瘤组织相关的细胞或标志物的任何组织或材料。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例免疫组织化学检测NFI的差异表达

1、样品收集

收集经病理确认为食管胃交界腺癌，其中食管胃交界腺癌26例，所有患者术前无化疗和放疗史，且没有同期肿瘤或多原异期肿瘤，组织样本的取得获得患者的知情同意，并且通过组织伦理委员会的同意。

2、免疫组织化学染色

(1)脱蜡：该步骤对于普通HE染色要求不太严格，免疫组织化学染色时则需要严格遵守以下步骤：切片于烤片灯下烘烤，正反两面各15min后，迅速移入二甲苯I中，20min；二甲苯II，20min；为保证脱蜡的效果，脱蜡过程中可偶尔在二甲苯中摇晃切片；

(2)水合：无水乙醇I，5min；无水乙醇II，5min；90％乙醇，5min；80％乙醇，5min；75％乙醇，5min；

(3)PBS溶液漂洗切片3次，每次5min；

(4)内源性过氧化酶阻断：采用3％过氧化氢甲醇溶液阻断内源性过氧化酶，阻断液配制方法如前，37℃恒温箱中孵育30min；阻断过程中上下晃动切片一次，可以去除气泡，增加阻断效果；

(5)PBS溶液漂洗3次，每次5min；

(6)抗原修复：采用柠檬酸修复液进行高压修复，修复盒中加满抗原修复液后置于高压锅中，待高压锅开始冒气后计时2min。修复完毕后，置于室温环境中缓慢降温；

(7)PBST溶液漂洗切片3次，每次3min；

(8)滴加一抗：通过预实验确定最佳浓度，按照最佳浓度稀释适量抗体(Abcam公司，兔NFIA/NFIB抗体)；擦拭干净切片周围残余水珠，用免疫组化套圈笔在组织周围画出一圈，添加适量一抗后置于湿盒中4℃过夜；

(9)取出湿盒，室温复温30min；

(10)PBST溶液漂洗切片3次，每次5min；

(11)滴加二抗：按1∶100的比例稀释鼠兔通用二抗，方法同一抗，37℃孵育30min；

(12)PBST溶液漂洗切片3次，每次5min；

(13)DAB显色：配制DAB显色液，滴加适量DAB显色液覆盖切片，镜下观察，显色适度后自来水终止显色反应；

(14)苏木精溶液中染切片10s后在盐酸酒精中进行分化，切片放入盐酸酒精后立即取出；

(15)温水蓝化，流水冲1h；

(16)脱水透明：75％酒精5min；80％酒精5min；90％酒精5min；无水乙醇I，5min；无水乙醇II，5min；二甲苯I 20min；二甲苯II，20min；

(17)烘干切片后，二甲苯树脂溶液封片。

3、免疫组织化学结果判读

采用半定量计分方式对染色结果进行了记分，方法如下：阴性染色标记为0分，＜25％细胞阳性为1分，26％-50％细胞阳性为2分，51％-75％细胞阳性为3分，＞75％细胞阳性标记为4分；染色强度记分：淡黄色标记为1分，黄色为2分，棕黄色至棕色为3分。两记分相乘为总分，0-3为低表达，4-12为高表达。

4、统计学分析

数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理，采用卡方检验分析NFIA和NFIB与临床之间的相关性；采用非参数Mann-whitnet U-检验分析不同组之间非分类变量之间的差异；应用Kaplan-meier进行生存分析，生存率的比较采用Log-rank检验，采用Cox比例风险回归模型分析判定独立于后不良因素，均以P＜0.05为统计学上有显著性差异。

5、结果

1)NFIA和NFIB在食管胃交界腺癌组织中的表达情况如图1所示，从图(图A)中可以看出，NFIA染色阳性信号主要定位于细胞核和细胞浆；NFIB染色阳性信号主要定位于细胞核，呈现浅棕色或棕色颗粒状。与癌旁组织相比，NFIB在食管胃交界腺癌组织中显著性高表达(P＜0.01)，而NFIA在食管胃交界腺癌组织中则无明显差异(图B)；NFIB在淋巴结转移的食管胃交界腺癌组织中高表达(P＜0.01)，而NFIA则无明显差异(图C)。

2)NFIA和NFIB的表达水平与食管胃交界腺癌患者临床病理学特征之间的相关性分析结果如表1所示，从表中可以看出NFIB的高表达与食管胃交界腺癌淋巴结转移(P＝0.014)、高TNM分期(P＝0.036)有关。

3)食管胃交界腺癌患者的生存曲线结果如图2所示，从图中可以看出，与NFIA低表达的患者相比，NFIB高表达的患者总生存率及无病生存率较低，差异具有统计学意义；而NFIA高表达的患者总生存率及无病生存率则无显著性差异。

4)对食管胃交界腺癌患者的总体生存期和无病生存期进行Cox比例风险回归分析，结果如表2所示，发现NFIB是食管胃交界腺癌总生存期和无病生存期的独立预后因子。

表1 NFIA/NFIB的表达水平与食管胃交界腺癌患者临床病理学特征之间的相关性

表2 多变量Cox回归分析食管胃交界腺癌患者的风险因子

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。