一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法及苦味肽的应用

摘要

本发明公开了一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，包括：制备上清液；酶水解制备苦味肽粗液；饱和透明质酸配制；通过非牛顿流体分离制备苦味肽粗浓缩液。该方法分离或者去除苦味肽的效果好，简单易操作；所分离出的苦味肽可用于哮踹，心血管疾病的预防。

说明书

技术领域

本发明属于水产品深加工领域，具体涉及一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法及应用。

背景技术

由于苦味一般与毒性和药性相关，其不适的口感使人避之，但苦味也是人类长期进化适应生存的方式最重要的元素之一。食品苦味主要来源于蛋白水解肽所暴露的疏水性氨基酸基团。虽然苦味在食品中不易被接受，但在医学上却有广泛的应用，如许多苦味肽具有血管紧张素酶抑制作用。此外，苦味受体既存在于舌蕾细胞中，而且也存在于肺气管及肺支气管上皮细胞中，近年发现食源性苦味分子可成为肺气管和支气管上皮细胞苦味受体激动剂，从而可能用于抗哮喘药物的制备。鱼蛋白经酶水解后其溶解性、热稳定性以及营养特性都会得到极大地改善，然而由于疏水性氨基酸的暴露及空间结构的改变形成苦味肽，所以无论食品或者功能食品，或者药品的生产时常常需要分离苦味肽，或者去除苦味肽。虽然目前分离或者脱苦味方法很多，但通常带入很多副作用，比如最早使用的在酶解液中加入活性炭来进行选择性分离，会带入活性炭的特殊气味。而非常规方法则需要昂贵的仪器和繁琐的程序，从而限制食品或者功能食品的商业化程度。

透明质酸是一种食品添加剂，近年发现透明质酸具有许多新的生物学功能。比如，透明质酸被发现是动物细胞的CD44跨膜受体之配体，透明质酸调节许多正常细胞的活动，但也参与癌细胞的浸润和转移，与此同时由于癌细胞高表达透明质酸酶，故被用来药物的定向和缓释投递。透明质酸是一种从细菌到哺乳细胞内广泛存在的大分子多糖类物质，其分子量变化从几千至高达上百万，但对人体仍无抗原原性。透明质酸的生理功能和应用特性与其分子量、分子量分布等分子参数密切相关。此外，高锁水性使透明质酸显示非牛顿流体和粘弹性行为，其体内、体外流变学也正在受到广泛研究，许多新的应用正在开发，现已广泛用于药物缓释投递，用于癌细胞相当高表达的透明质酸酶的降解作用。近年，通过透明质酸的发酵制备，已广泛用于食品与化妆品等领域。透明质酸的早期制备是从鸡冠，或者动物一些器官制备，现在由于可以发酵生产，所以透明质酸得以进入食品领域。虽然人们对其物性还不是很清楚，但透明质酸的许多神奇效果、功能正在食品研究与制造中被发掘。现在透明质酸的非牛顿流体特性也被广泛用于骨关节炎及癌细胞的定向药物投递的研究，然而体外透明质酸的非牛顿流体物理特性以及与蛋白/肽的物理化学作用机理的了解仍然不清楚。除透明质酸分子量外，其温度，浓度和某些媒介分子等都影响其粘度和流变学性质，进而影响苦味肽的富集或者消除。

因此，有必要研究一种更有利的筛选苦味肽的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，解决上述问题。

本发明的技术方案是：

一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备上清液：清洗大黄鱼，然后去鳞，再用去离子水清洗后，将所述大黄鱼切成鱼块，将所述鱼块与缓冲液放入高速组织捣碎机中打浆并离心，取上清液加热至内源性酶失活，备用；

(2)酶水解制备苦味肽粗液：在所述上清液中加入质量浓度为10g/L的胃蛋白酶，混合搅拌均匀，置于水浴锅中，将pH调至3.5，然后酶解、冷却，调回pH至7.0，定容，离心，上清液即为苦味肽粗液，取所述苦味肽粗液备用。

(3)饱和透明质酸配制：将透明质酸钠盐加入至装有无菌水的器皿中，充分搅拌至形成透明粘性液体,在器皿口覆盖保鲜膜。

(4)通过非牛顿流体分离制备苦味肽粗浓缩液：在容器中加入所述苦味肽粗液，再加入与所述苦味肽粗液等体积的透明粘性液体，此时溶液的上层为所述透明粘性液体，下层为所述苦味肽粗液，将所述溶液经过离心或者静置的离心管收集组分，然后通过感官评定确定苦味肽的组分位置，收集苦味肽组分，获得苦味肽粗浓缩液。

进一步的，步骤(1)中所述鱼块为100g。

进一步的，步骤(1)中所述鱼块与缓冲液的质量比为1：5，所述缓冲液为0.1XPBS。

进一步的，步骤(1)中所述打浆的时间为5-10min，所述离心的转速为6000r/min，时间为5min，所述上清液加热的时间为5min，温度为90℃。

进一步的，步骤(2)中所述水浴锅中水浴的温度为50-60℃，酶解时间为4h，酶解后升温至95℃灭酶15min，所述离心的转速为12000r/min，时间为10min。

进一步的，步骤(2)中所述pH通过1M的HCL调节。

进一步的，步骤(2)完成后，还进行苦味肽粗液感官评定，所述感官评定与步骤(4)中的感官评定的方式相同：由6-9名感官评定人，参加苦味肽的标准曲线建立，即单盲法依次判断出高、中、低苦味浓度，然后依次测试5-100mg咖啡因的感官苦味强度，以形成自身的苦味标准曲线。

进一步的，步骤(3)中所述透明粘性液体含有质量浓度为20g/L的透明质酸。

进一步的，步骤(4)中所述离心的转速为15000r/min，温度为4℃，时间为30min。

上述方法所制备的苦味肽能够运用于制作治疗哮喘疾病的食物。

本发明的优点是：

(1)分离或者去除苦味肽的效果好，方法简单易操作；

(2)所分离出的苦味肽可用于哮踹，心血管疾病的预防。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为由Mocca咖啡制备的感官评定标准曲线图；

图2为不同酶水解大黄鱼蛋白产生的苦味肽分析图；

图3为马尔文流变仪分析图及电子显微镜图；

图4为通过感官评定法分析有切力作用与非切力作用下的透明质酸非牛顿流体媒介的苦味肽扩散图；

图5为Bradford法分析有切力作用与非切力作用下的2％透明质酸非牛顿流体媒介的苦味肽扩散图；

图6为透明质酸非牛顿流体切力作用与非切力作用下收集管蛋白的SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

本发明提供一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，包括以下步骤：

(1)制定苦味标准；

(2)制备上清液；

(3)酶水解制备苦味肽粗液；

(4)饱和透明质酸配制；

(5)通过非牛顿流体分离制备苦味肽粗浓缩液。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，包括：

步骤一：制定苦味标准；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：根据国标法GB/T 12315-2008感官分析方法学排序法，6-9名感官评定人，参加苦味肽的标准曲线建立，即单盲法依次判断出高、中、低苦味浓度，然后依次测试5-100mg(咖啡因)的感官苦味浓(强)度，以形成自身(储存于大脑无型)的苦味标准曲线；

步骤二：清洗大黄鱼，然后去鳞，再用去离子水清洗后，将所述大黄鱼切成鱼块，将所述鱼块与缓冲液放入高速组织捣碎机中打浆并离心，取上清液加热至内源性酶失活，备用；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：冲洗舟山大黄鱼，去鳞，酶解条件为：去离子水清洗后，经切块、称重100g，按鱼块与缓冲液的质量比是1：5的比例加入0.1XPBS缓冲液，在DS-1高速组织捣碎机上打浆5-10min，6000r/min离心5min，取上清液,并加热90℃，5分钟，使内源性酶失活；

步骤三：酶水解制备苦味肽粗液：在所述上清液中加入质量浓度为10g/L的胃蛋白酶，混合搅拌均匀，置于水浴锅中，将pH调至3.5，然后酶解、冷却，调回pH至7.0，定容，离心，上清液即为苦味肽粗液，取所述苦味肽粗液备用。

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：上清液中加入胃蛋白酶1％(W/V)，混合搅拌均匀，置于50-60℃水浴锅中(根据具体的酶用其最佳温度)，酶解过程前用1M的HCl把pH调到3.5，酶解4h；升温至95℃，灭酶15min，冷却，调回pH7.0，定容，12000r/min离心10min，上清液为苦味肽粗液，备用。在水解过程中按设计的时间点进行取样和感官评定。

步骤四：饱和透明质酸配制：将透明质酸钠盐加入至装有无菌水的器皿中，充分搅拌至形成透明粘性液体,在器皿口覆盖保鲜膜。

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：称所需的食品级的高分子(百万级)透明质酸钠盐到所需无菌水，充分搅拌至透明粘性液体2％(W/V)，自然透明质酸钠pH为7.0，为避免对酶水解肽的影响，一直保鲜膜覆盖，保持自然pH，保持透明无汽泡状态。

步骤五：通过非牛顿流体分离制备苦味肽粗浓缩液：在容器中加入所述苦味肽粗液，再加入与所述苦味肽粗液等体积的透明粘性液体，此时溶液的上层为所述透明粘性液体，下层为所述苦味肽粗液，将所述溶液经过离心或者静置的离心管收集组分，然后通过感官评定确定苦味肽的组分位置，收集苦味肽组分，获得苦味肽粗浓缩液。

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：利用苦味肽的疏水基团和透明质酸高度亲水特性及非牛顿流体特性，自然沉降或者离心组分收集苦味肽。底层为感官评定好的苦味肽粗液，上层为与苦味肽粗液等体积的2％透明质酸，由于透明质酸的非牛顿流体特性，离心或者重力等剪切条件下，粘性分子作用缓慢扩散。扩散中的分子相互作用亲水分子进入流体相，而非亲水的苦味肽保留在水相。经15000RPM，4℃，30min离心后观察其分子扩散差异。经过离心或者静置的离心管收集组分，然后用感官评定确定其苦味肽的组分位置，收集苦味肽组分。布拉德福(Bradford)蛋白质定量法和SDS-PAGE进一步确证分子量大小等。

上述方法初步提纯的苦味肽可用于哮喘食物疗法。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

上述步骤一至五的性能测试请参阅图1至图6：

步骤一所得的苦味标准曲线请参阅图1，图1为由Mocca咖啡制备的感官评定标准曲线图，误差棒表示其标准误差。由于缺乏真正的仪器测量苦味度，目前感官评定的方法仍是最常用和有效的方法。其感官评价按Hyung Joo Suh等方法，将咖啡按实际咖啡因含量配成浓度分别为：0，0.025％，0.05％，0.1％，0.2％，0.3％等；其对应的评分值和苦味程度分别为：1–10(0：无苦味)。根据此评分标准，品尝者品尝蛋白质水解液的苦味并与标准比较进行评分，用最后得出平均值来表示苦味程度。如图1所示，由于参与人的个体差异感官标准曲线感官浓度低于实际浓度(R²＝0.9851)，这一方面可能是溶解度带来的误差，也包括感官的不敏感带来的系统误差。

虽然大豆蛋白的酶水解肽的除苦味已有成熟的工艺，但对鱼蛋白，特别是舟山大黄鱼蛋白的酶水解及苦味去除尚未报道。为此我们使用5种蛋白酶水解大黄鱼蛋白，其中步骤三所述的酶水解制备苦味肽粗液是通过胃蛋白酶水解大黄鱼蛋白，请参阅图2，图2为不同酶水解大黄鱼蛋白产生的苦味肽分析图。如图2所示，胃蛋白酶产生非常高的苦味(肽)，基本上是胰蛋白酶的5倍，这为透明质酸分离苦味肽创造了条件。实验也显示添加风味酶基本上没有产生苦味，而风味酶生成浓香味风味物质，使产品苦味有较大缓和，对动物采食有利，或者改进食品味觉，因此，在本发明所述的方法中，胃蛋白酶被选择用于高苦味肽的分离。

2％透明质酸是加载于酶水解蛋白肽液的上部，由于2％透明质酸的锁水能力导致比重的微小差异而向下移动，由于其粘性和非牛顿流体特性，2％透明质酸经过离心30分钟，或者静置7-10分钟均可移动到底部，与此同时推动底部的酶解液向上浮动，所以酶解液向上移动也进入非牛顿流体，而牛顿流体的惰性与透明质酸对非亲水分子的排斥使一定量的疏水蛋白/肽向上移动。这一方面被感官评定，及随后的Bradford分析所证明。经实验展示，2％的透明质酸以非牛顿流体形式迁移，在10分钟离心(6000rpm，4℃)条件下完成透明质酸从上到底部的转位，伴随流体的有限扩散，牛顿流体(苦味肽)与非牛顿流体(2％透明质酸)发生位置置换。而0.5％透明质酸是以牛顿流体形式迁移，在30分钟离心(6000rpm，4℃)条件下完成透明质酸从上到底部的转位，伴随流体的有限扩散，但牛顿流体(苦味肽)与2％透明质酸发生简单的混合。由于2％透明质酸约重于水，离心和非离心都导致透明质酸从上到下的转位。其过程带动亲水肽(推出疏水肽)以脂筏(lipid raft)似运动方式驱动疏水性肽的移动。近年研究显示透明质酸分子的聚合度极大地影响细胞状态，如癌细胞，动脉粥样硬化斑块细胞及类风湿性关节炎中的细胞外层的透明质酸时常被透明质酸酶降解，或被氧化。与此同时透明质酸的受体CD44糖蛋白分子在淋巴细胞及癌细胞是高表达。动物细胞膜上的脂筏是包含透明质酸及富含胆固醇和糖苷脂的某些特定区域，它们携带G蛋白，或者其它膜因子转位，一般这样的从内到外的转位在15-30分钟完成。虽然没有定量流体跟踪，但透明质酸这种体内，体外的非牛顿流体的特性应该保持基本相同，既带有整体性，又保留扩散小分子的非牛顿流体功能。而0.5％透明质酸则主要体现分子扩散为主，基本上仍表现为牛顿流体特征。虽然离心有轻微的增加分子聚集，但与静置试管差异不大。所以在步骤四中选用2％透明质酸。

步骤五中通过非牛顿流体分离制备苦味肽精液的结果请参阅图3，图3为马尔文流变仪分析图及电子显微镜图。如图3A所示，通过马尔文流变仪分析，苦味肽与不同比例的2％透明质酸在流(切)变下粘度变化，如图3B所示，在扫描电子显微镜下其主要以纳米级颗粒存在。

酶水解液是被加到底部，但实验结果表明离心或者静置后苦味肽可以从底部穿过透明质酸层移动到上部。苦味肽主要由蛋白水解后的寡肽所暴露的疏水氨基酸组成，或者具有特定的空间结构，比如脯氨酸残基对肽的苦味贡献十分重要，所以在透明质酸比重重力从上部移动到底部时，由于透明质酸带负电荷的羧基与部分碱性氨基酸，或者碱性肽形成离子键而移到底部，而亲水的氨基酸/肽被透明质酸胶体吸附，结果导致疏水性肽移动到上层，即具有苦味的疏水氨基酸，或者苦味肽移到上部。请参阅图4，图4为通过感官评定法分析有切力作用与非切力作用下的透明质酸非牛顿流体媒介的苦味肽扩散图。从图4可知，为了观察牛顿或者非牛顿流体对酶水解液蛋白/肽的影响，使用考馬斯亮蓝(Bradford法)展示收集的10个组分的蛋白含量。请参阅图5，图5为Bradford法分析有切力作用与非切力作用下的2％透明质酸非牛顿流体媒介的苦味肽扩散图，从上到下收集的管号1-10用于蛋白/肽分析和感官评定。

请参阅图6，图6为透明质酸非牛顿流体切力作用与非切力作用下收集管蛋白的SDS-PAGE电泳分析图。如图6所示，由于SDS-PAGE是非常敏感的分析技术，SDS-PAGE展示了酶水解蛋白/肽在非牛顿流体作用下从底部移动到上层，而且部分也仍然滞留在管的中下部，所以分子扩散仍然发挥一定作用。与Bradford分析和感官评定结果也基本一致。当然透明质酸的扩散作用，非牛顿流体的惰性与惯性，在有切力与无切力的作用还有许多非蛋白因子如透明质酸本身是无法用SDS-PAGE来展示。带1-5，2％透明质酸(离心)来自于收集管1(上)，3，5，7，9(底)，带6-10，2％透明质酸(未离心)来自于收集管1，3，5，7，9。

实施例一

本实施案例按如下步骤展示一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法制备苦味肽：

冲洗舟山大黄鱼，去鳞，酶解条件为：去离子水清洗后，经切块、称重100g，按1：5的蛋白质量比加入0.1XPBS缓冲液，在DS-1高速组织捣碎机上打浆5-10min，6000r/min离心5min，取上清液，并加热90℃，5min，使内源性酶失活；上清液分别加入1％(W/V)的所需胃蛋白酶，混合搅拌均匀，置于50-60℃水浴锅中(根据具体的酶用其最佳温度)，酶解过程前用1M的HCl把pH调到3.5，酶解4h；升温至95℃，灭酶15min，冷却，调回pH7.0，定容，12000r/min离心10min，取上清液酶水解苦味肽备用。在水解过程中按设计的时间点进行取样和感官评定。

称量所需的食品级的高分子(百万级)透明质酸钠盐到无菌水中，充分搅拌至透明粘性液体(2％),自然透明质酸钠pH为7.0，为避免对酶水解肽的影响，一直保鲜膜覆盖，保持自然pH，保持透明无汽泡状态。

利用苦味肽的疏水基团，和透明质酸高度亲水特性及非牛顿流体特性，及自然沉降或者离心与组分收集苦味肽。底层加感官评定好的酶水解苦味肽，上层加等体积的2％透明质酸，由于透明质酸的非牛顿流体特性，离心，或者重力都帮助剪切条件下的粘性分子作用下的缓慢扩散。扩散中的分子相互作用亲水分子进入流体相，而非亲水的苦味肽保留在水相。经15000r/min，4℃，30min离心后观察其分子扩散差异。经过离心或者静置的离心管被收集组分，然后用于感官评定确定其苦味肽的组分位置，收集苦味肽组分。

综上所述，本发明公开了一种胃蛋白酶制备苦味肽的方法，本研究展示了胃蛋白酶水解大黄鱼蛋白产生最明显的苦味。在利用透明质酸富集苦味肽(酶解液)中发现2％透明质酸本身，以及在等体积酶解液中保持非牛顿流体特性，即切力惰性和粘度使其蛋白/肽的扩散缓慢，但在离心与重力作用下透明质酸同样穿过酶解液，由于非牛顿流体的粘应力引起了阻力的增加，导致液体的表观粘度增大了，酶解液移到上部时而避免分子扩散，形成一定的蛋白富集，如图5，但同时又由于其亲水作用和疏水基团的排斥实现在管的上部富集了疏水的苦味肽如图4。与之相比，0.5％透明质酸在与酶解液混合中主要呈现迅速扩散，也就是应力与应变速率成正比的牛顿流体特征。由于蛋白/肽在非牛顿流体中复杂的扩散系数等的摸索超出本研究的范围，无法公式化分析，但蛋白与苦味肽的移动展示出简单快速分离苦味肽的可能性，为透明质酸在食品工业的应用摸索了初步条件。此外，虽然透明质酸在试管里的转位与细胞膜脂筏完全不同，但其非牛顿流体特性与体内透明质酸相似，即分子的游动特征能促进自身及相互作用的分子的移动。与静置试管相比，实际上我们实验表明透明质酸亲水而排斥疏水的苦味肽的分离方法不需要离心，重力(切力)移动路径可以根据亲水，疏水特性排除苦味肽，而有效地达到富集苦味肽的目的。从以上实验结果，经近一步的测试，比如分析分子量大小改变其锁水作用，进而改变流体特性，透明质酸与酶水解液的柱径比等等，都可能增加苦味肽的迁移和富集。所以，此方法有可能成为分离，或者去除苦味肽的最佳工艺条件的基础。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。