一株孟加拉副球菌菌株及其应用

摘要

本发明涉及生物化学领域。目的是提供一种可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体氧化沼气中硫化氢(H

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一株可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体氧化沼气中硫化氢(H₂S)的孟加拉副球菌菌株及其应用。

背景技术

沼气，作为一种清洁可再生能源，对缓解我国能源危机，环境保护具有重要的意义。正因如此，以沼气为目标产物的厌氧发酵技术得到了长足的发展。沼气是一种通过厌氧生物发酵生物原料产生的生物燃料，上述生物原料主要包括畜禽粪便、秸秆、能源植物、有机废水等废弃物。因发酵底物的差异，沼气中H₂S气体成分约占0.1～2％不等。H₂S是一种强腐蚀性、强臭味的气体。在使用过程中，混有H₂S的沼气会严重腐蚀管道设备，严重降低其使用寿命。同时，H₂S经O₂氧化后转化成的硫氧化合物是形成酸雨的重要成分。因此，为了安全利用沼气能源，必须在使用前进行有效的脱硫处理。

当前，应用到沼气脱硫工程的主要方法包括物化法和生物法。物化脱硫需要大量的化学试剂，能耗和运行成本较高,同时还存在二次污染等问题。而生物脱硫法，具有沼气脱硫效率较高且经济环保的优点，目前正不断扩大工程应用，逐步取代物化法。

现在，生物脱硫法主要根据需氧量的多少，分为好氧脱硫和缺氧脱硫。好氧脱硫法主要是通入适当的氧气作为电子受体，将H₂S氧化成单质硫或硫酸盐从而加以去除。如，李亚新等2002年发表与《城市环境与城市生态》上的“无色硫细菌氧化SRB还原硫酸盐产品硫化氢生产单质硫”，实现了用无色硫细菌对硫化氢的脱除。但氧气的调控比较困难，存在易燃易爆的风险；而且，在供氧的同时会引入的N₂，稀释沼气，降低其热值。

而在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体，可达到安全温和脱硫的效果。因此，在缺氧条件下，以硝酸盐为电子受体，替代氧气作为电子受体的沼气生物脱硫法正成为研究热点，为我国沼气脱硫技术提供一条新的技术途径。

目前，我国的缺氧生物脱硫技术还多停留在实验室研究阶段，获得具有高效专性功能的微生物菌株，是进行沼气缺氧生物脱硫大规模推广应用的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体氧化沼气中硫化氢(H₂S)的孟加拉副球菌菌株及其应用方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体氧化沼气中硫化氢(H₂S)的孟加拉副球菌菌株及其应用方法。

优选的，一株孟加拉副球菌菌株，Paracoccus bengaiensis，其DNA序列如SEQ IDNO 1所示。

相应的，一株孟加拉副球菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13320。

优选的，上述的孟加拉副球菌菌株，其生物生化特征为：菌株呈短杆状，较小，菌株呈乳黄色，表面湿润；经生理生化鉴定为革兰氏阴性菌；能以硝酸盐、亚硝酸盐为电子受体营厌氧生长；菌株可在15～45℃范围生长，最适生长温度30～35℃；可在pH＝7.0～7.5范围内生长，最适生长pH＝7.0。

相应的，上述的孟加拉副球菌菌株在废水脱硫脱氮处理中的应用。

优选的，上述孟加拉副球菌菌株在废水脱硫脱氮处理中的应用，具体步骤如下：

(1)用固体活化培养基对所述孟加拉副球菌进行活化；

(2)将活化后的菌液接种至液体发酵培养基，得到接种菌液；

(3)将活化后的接种菌液按10％的接种比例接种至含废水的生物滴滤塔反应器中，进行废水脱硫脱氮处理。

优选的，上述孟加拉副球菌菌株在废水脱硫脱氮处理中的应用，所述各培养基为：

(1)固体活化培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>31.0，MgCl₂·6H₂O>4·7H₂O>

(2)液体发酵培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>31.0，MgCl₂·6H₂O>4·7H₂O>

所述微量元素(g/L)是：EDTA>4·7H₂O>4·7H₂O>2·4H₂O>3BO₃>2·6H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O>2MoO₄·H₂O>

相应的，上述孟加拉副球菌菌株在去除沼气中H₂S处理中的应用。

优选的，上述孟加拉副球菌菌株在去除沼气中H₂S处理中的应用，包括如下步骤：

(1)用固体活化培养基对所述孟加拉副球菌进行活化；

(2)将活化后的菌液接种至液体发酵培养基，得到接种菌液；

(3)将活化后的接种菌液按10％的比例接种于含有脱硫培养基的生物滴滤塔反应器中，培养2d；

(4)设置滴滤液流速0.5L/min，环境温度30℃，持续通入含有H₂S的沼气，进行去除沼气中的H₂S处理。

优选的，上述孟加拉副球菌菌株在去除沼气中H₂S处理中的应用，所述各培养基为：

(1)固体活化培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>31.0，MgCl₂·6H₂O>4·7H₂O>

(2)液体发酵培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>31.0，MgCl₂·6H₂O>4·7H₂O>

(3)脱硫培养基(g/L)：KNO₃>2PO₄>3>2·6H₂O0.5，FeSO₄·7H₂O>

所述微量元素(g/L)是：EDTA>4·7H₂O>4·7H₂O>2·4H₂O0.03，H₃BO₃>2·6H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O>2MoO₄·H₂O>

本发明具有以下有益效果：

(1)提供了一种新的可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体氧化沼气中硫化氢(H₂S)的孟加拉副球菌菌株；

(2)孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320是从四川省某污水处理厂污泥中筛选得到的，不会对周围环境和生态平衡造成危害，符合生态安全法规；

(3)能够实现在缺氧条件下，高效、环境友好地对沼气进行脱硫处理，有效避免了传统以氧气为电子受体进行沼气脱硫时所带来的爆炸隐患及降低沼气热值的缺点；

(4)能够高效同步进行废水中的脱硫脱氮处理。

附图说明

图1是孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320在平板培养基中的菌落形态；

图2是用于模拟废水脱硫脱氮和沼气脱硫实验的生物滴滤塔反应器。

具体实施方式

实施例一

筛选得到孟加拉副球菌菌株

(1)制备培养基

富集培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

分离培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

(2)分离纯化菌株

取四川成都市某污水处理厂厌氧污泥，将采集的污泥在厌氧条件下用富集培养基进行驯化，15～20天后分别进行10^-2、10^-4、10^-6、10^-8、10^-10的梯度稀释，从各稀释梯度下分别吸取0.1mL稀释后的菌液，于分离培养基平板涂布，挑出出现在平板表面的单个菌落，重新稀释涂布，重复数次。最终获得能够以硝酸盐为电子受体脱除沼气中H₂S的纯化菌株。

(3)菌株形态特征和生物生化特征的鉴定

取上述菌株在显微镜下观察(如图1所示)，菌株呈短杆状，较小，菌株呈乳黄色，表面湿润。经生理生化鉴定为革兰氏阴性菌。能以硝酸盐、亚硝酸盐为电子受体营厌氧生长。菌株可在15～45℃范围生长，最适生长温度30～35℃；可在pH＝7.0～7.5范围内生长，最适生长pH＝7.0。

(4)16S rDNA序列分析鉴定

1)用购买于天根生化科技(北京)有限公司的DP302细菌试剂盒提取纯化菌株的总DNA。

2)以通用引物17F/1429R进行16S rDNA序列扩增，扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计检测浓度与纯度，当紫外灯投射下观察到的条带与对应的marker条带对比，条带位置一致且较清晰时，初步判断扩增的PCR产物浓度合格；当OD260/OD280比值在1.7～1.9时，表明扩增的PCR产物纯度合格。

3)浓度和纯度都合格的条件下，对扩增的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。将测序得到的16S rDNA序列在NCBI上进行Blast比对，获知与孟加拉副球菌(Paracoccus bengaiensis)的序列同源性高达98％以上，确定纯化菌株的分类学地位。其16rDNA序列如SEQ ID NO 1。

(5)确定纯化菌株的种名

综合纯化菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定该纯化菌株为孟加拉副球菌(Paracoccus bengaiensis)。

菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期2016年11月18日，保藏编号CGMCC No.13320。

实施例二

孟加拉副球菌CGMCC No.13320应用于模拟废水中硫氮的去除。

(1)模拟废水及接种菌液的制备

模拟废水：Na₂S·9H₂O>3>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

固体活化培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

液体发酵培养基(g/L)：Na₂S₂O₃·5H₂O>3>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

脱硫培养基(g/L)：KNO₃>2PO₄>3>2·6H₂O>4·7H₂O>

上述微量元素(g/L)是：EDTA>4·7H₂O>4·7H₂O>2·4H₂O>3BO₃>2·6H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O>2MoO₄·H₂O>

将孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320接种到固体活化培养基中，活化培养1d后待用；将活化的菌种接入液体发酵培养基中，30℃下静止培养1～3d得到接种菌液，菌液浓度107～108CFU/ml，待用。

(2)模拟废水中硫氮的去除

将接种物按10％的接种比例接种至10L含模拟废水的生物滴滤塔反应器(如图2所示)中；同时做不接种菌液的对照实验；控制滴滤速度0.5L/min，控制环境温度30℃。

2d后测定模拟废水中硫化物和硝酸盐浓度，测定结果见表1。

表1模拟废水中硫化物和硝酸盐的去除率

由上表可知，温度为30℃时，接种孟加拉副球菌菌株CGMCCNo.13320的实验组对模拟废水中硫化物和硝酸盐污染物去除效果显著，对硫化物去除率达100％，对硝酸盐去除率达70％。而对照组分别仅能达到20％和8％的去除率。说明孟加拉副球菌菌株CGMCCNo.13320能同步进行废水脱硫脱氮处理，达到以废治废的目的。

实施例三

孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320用于沼气中H₂S的去除。

(1)将孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320接种到固体活化培养基中，活化培养1d后待用；将活化的菌种接入液体发酵培养基中，30℃下静止培养1～3d得到接种菌液，菌液浓度107～108CFU/ml，待用。

(2)沼气中H₂S的去除

将脱硫培养基泵入生物滴滤塔反应器，而后将接种菌液按10％的接种量接种至生物滴滤塔反应器中，菌液培养2d。同时做不接种菌液的对照实验。

而后将含H₂S的沼气以0.4L/min的速率连续泵入含2000ppmH₂S浓度的沼气。设置滴滤液流速0.5L/min，控制环境温度30℃，连续测定沼气中H₂S的去除率。

测定结果见表2所示。

表2沼气中H₂S去除率

由上表可知，接种孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320实验组反应器对沼气中H₂S有明显的去除效果，对2000ppm浓度的沼气中H₂S的去除率可达97.2％。而对照组仅依靠非生物氧化仅能去除17.4％的H₂S。说明孟加拉副球菌菌株CGMCC>

实施例四

孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320用于沼气中H₂S的去除。

将脱硫培养基泵入生物滴滤塔反应器，而后将接种菌液按10％的接种量接种至生物滴滤塔反应器中，菌液培养2d。同时做不接种菌液的对照实验。

而后将含H₂S的沼气以0.4L/min的速率连续泵入含4000ppmH₂S浓度的沼气。设置滴滤液流速0.5L/min，控制环境温度30℃，连续测定沼气中H₂S的去除率。

测定结果见表3。

表3沼气中H₂S去除率

由上表可知，接种孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320实验组对沼气中H₂S有明显的去除效果，当沼气中H₂S浓度提高至4000ppm时去除率仍可达到96.0％。而对照组仅依靠非生物氧化作用仅能去除14.0％的H2S。说明孟加拉副球菌菌株CGMCC>2S浓度的变化，面对含有不同浓度H₂S的沼气，仍能高效的进行沼气脱硫处理。

实施例五

孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320用于沼气中H₂S的去除。

将脱硫培养基泵入生物滴滤塔反应器，而后将接种菌液按10％的接种量接种至生物滴滤塔反应器中，菌液培养2d。同时做不接种菌液的对照实验。

而后将含H₂S的沼气以0.8L/min的速率连续泵入含4000ppmH₂S浓度的沼气。设置滴滤液流速0.5L/min，控制环境温度30℃，连续测定沼气中H₂S的去除率。

测定结果见表4。

表4沼气中H₂S去除率

由上表可知，接种孟加拉副球菌菌株CGMCC No.13320实验组对沼气中H₂S有明显的去除效果，仍能达到92.9％的去除率。而不接种孟加拉副球菌菌株CGMCC>2S去除率降低至11.5％。说明孟加拉副球菌菌株CGMCC>

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株孟加拉副球菌菌株及其应用

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1142

<212>DNA

<213>孟加拉副球菌(Paracoccus bengaiensis)

<400>1

cgcaccttcg ggtgagcggc ggacgggtga gtaacgcgtg ggaatatgcc ctttggtacg60

gaatagtcct gggaaactgg gggtaatacc gtatgcgccc ttcgggggaa agatttatcg 120

ccaaaggatt agcccgcgtt ggattaggta gttggtgggg taatggccta ccaagccgac 180

gatccatagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact 240

cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttag acaatggggg caaccctgat ctagccatgc 300

cgcgtgagtg atgaaggccc tagggttgta aagctctttc agctgggaag ataatgacgg 360

taccagcaga agaagccccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggggc 420

tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggaccggaa agttgggggt 480

gaaatcccgg ggctcaaccc cggaactgcc ttcaaaacta tcggtctgga gttcgagaga 540

ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa atgctggtta gcgcacggcc gtcgggtaga 600

cccaactccc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 660

atgctgttcc gcgattacta gcgattccaa cttcatgggg tcgagttgca gaccccaatc 720

cgaactgaga tggcttttgg ggattaaccc actgtcacca ccattgtagc acgtgtgtag 780

cccaacccgt aagggccatg aggacttgac gtcatccaca ccttcctccg acttatcatc 840

ggcagttctt ccagagtgcc caaccaaatg atggcaactg gaagtgtggg ttgcgctcgt 900

tgccggactt aaccgaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 960

ccaggtcacc gaagtgaaag acccgtctcc gggccggtcc tgggatgtca agggttggta1020

aggttctgcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc1080

aattcctttg agttttaatc ttgcgaccgt actccccagg cggaatgctt aatccgttag1140

gt 1142