一种金纳米棒鬼臼毒素脂质体及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种金纳米棒鬼臼毒素脂质体及其制备方法和用途，其中金纳米棒鬼臼毒素脂质体是将金纳米棒通过聚电解质修饰后结合到含有羧基的鬼臼毒素脂质体的外表面所得到的纳米复合物。所述金纳米棒鬼臼毒素脂质体是典型的囊泡形状，颗粒直径约129.8nm，ζ电位为+15.7mV，具有较高的消光系数(8.08Lg

说明书

技术领域

本发明涉及一种金纳米棒鬼臼毒素脂质体及其制备方法和用途，属于纳米生物医药技术 领域。

背景技术

鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物中提取分离得到的一种芳基萘内酯类木脂素，具有很强 的生物活性，如杀虫，抗真菌，抗病毒，抗炎，免疫抑制，抗风湿，抗痉挛，降血脂等。近 年来，鬼臼毒素的抗癌活性亦受到越来越多的关注，其抗癌作用的主要机制是与微管蛋白结 合，然后在细胞分裂的G2/M期内阻止有丝分裂纺锤体的形成。然而，鬼臼毒素用于癌症治 疗的实际应用由于其水溶性差，癌细胞选择性不足以及严重的副作用而不能令人满意。

在过去几十年中，为提高化疗药物的效率，基于脂质体的纳米药物递送系统已被成功设 计和制备。例如，与游离多柔比星相比，聚乙二醇化多柔比星脂质体(Doxil)显示出循环时 间延长和副作用减少的特点，因此，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床治疗 卵巢癌和卡波西氏肉瘤。类似地，脂质体也可以应用于鬼臼毒素的运输，以改善药物生物利 用度。然而，传统脂质体存在一定的问题，仍待解决，例如：相对较低的靶向作用；血液循 环中药物释放不受控制；单纯的化疗无法达到满意的治疗效果，甚至引起药物耐受作用。在 外部物理刺激的帮助下，例如温度，磁力，pH值，超声波和光照等，药物能够以可控的方式 从载体中释放出来。由于血液和水的吸附量低，组织散射小，650-900nm范围内的近红外光 (NIR)可以深入穿透生物组织，而不会损害正常细胞，成为药物输送系统的不错的刺激源。

对于光热治疗，需要具有强照射吸光度和热转换效率的安全物质。纳米金棒(Goldnanorods，GNRs)具有良好的光学特性，在很窄的光谱带宽下具有较高的等离子体共振强度， 比其他金属材料相比，其在肿瘤光热治疗方面有着更强的光热转换优势。金纳米棒虽具有加 强的光热特性，但其光热稳定性较差，无法实现循环治疗，并且其表面附着有十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB)，具有较强的细胞毒性。

发明内容

为了避免上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种金纳米棒鬼臼毒素脂质体及其制备 方法和用途，通过聚电解质对金纳米棒进行层层包覆明显加强了其光热稳定性，并显著降低 其细胞毒性，提高了生物安全性。

本发明金纳米棒鬼臼毒素脂质体，是将金纳米棒通过聚电解质修饰后结合到含有羧基的 鬼臼毒素脂质体的外表面所得到的纳米复合物。

本发明金纳米棒鬼臼毒素脂质体，是典型的囊泡形状，颗粒直径约129.8nm，ζ电位为+ 15.7mV，有效吸收近红外光(消光系数8.08Lg^-1cm^-1)，并具有极优的光热转换效率(46.1％)。

本发明金纳米棒鬼臼毒素脂质体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金纳米棒的修饰

将金纳米棒(常规种子生长法制备)依次通过聚电解质聚苯乙烯磺酸钠(PSS)和聚L- 赖氨酸(PLL)对金纳米棒进行逐层修饰，获得双层修饰的金纳米棒；

步骤2：鬼臼毒素脂质体的制备

将鬼臼毒素、脂质以及羧基化聚乙二醇(DSPE-PEG2000-COOH)加入茄型瓶中，加入溶剂并混合均匀，于37℃旋转蒸发成膜，干燥去除残留的溶剂，随后加入5mL去离子水于旋蒸仪上水化，再置于超声波细胞粉碎机下冰浴超声10min，功率140W，过滤并灭菌后得到鬼臼毒素脂质体，于4℃储存备用。

步骤3：金纳米棒鬼臼毒素脂质体

在超声条件下，将步骤1获得的双层修饰的金纳米棒分散液滴加至步骤2制得的鬼臼毒 素脂质体中，超声反应10min后静置20min，得到金纳米棒鬼臼毒素脂质体。

步骤1中，金纳米棒的长度为60-90nm。

步骤1中，金纳米棒逐层修饰的过程如下：

将20mL浓度为160-260μg/mL的金纳米棒溶液在8000rpm下离心两次，每次20分钟，弃去上清液，向沉淀物中加入10mL去离子水重悬(溶液浓度为130-230μg/mL)，超声条件 下逐滴加入10mL浓度为2mg/mL的PSS溶液(溶剂为6mM的NaCl溶液)，超声反应10min 后静置20min，通过静电吸附作用使PSS结合到金纳米棒的表面，离心洗去多余的PSS，获 得PSS修饰的金纳米棒；向所得PSS修饰的金纳米棒中加入5mL去离子水重悬(溶液浓度 为100-200μg/mL)，超声条件下逐滴加入1-1.5mL浓度为1mg/mL的PLL溶液(溶剂为6mM 的NaCl溶液)，超声反应10min后静置20min，通过静电吸附作用使PLL结合到金纳米棒的 表面，离心洗去多余的PLL，获得双层修饰的金纳米棒。

步骤2中，鬼臼毒素与脂质的质量比为1:(15～15.8)；所述脂质为胆固醇和卵磷脂按照质 量比(3.6～4):40的比例混合构成；DSPE-PEG2000-COOH的添加质量为卵磷脂添加质量的 10％。

步骤2中，所述溶剂为甲醇和氯仿按照体积比1:2混合构成；加入溶剂后混合液的质量 体积比为3～3.5mg/mL，以脂质的质量计算(脂质包括胆固醇和卵磷脂)。羧基化聚乙二醇是 以溶液的形式添加(浓度为4mg/mL)，混合液中羧基化聚乙二醇的浓度为0.27mg/mL。

步骤2中，所述过滤并灭菌是采用220nm的针孔式微孔滤膜，该滤膜具有去除杂质和除 菌双重作用。

步骤3中，超声功率为300W。

步骤3中，双层修饰的金纳米棒分散液的浓度为60-160μg/mL；鬼臼毒素脂质体的浓度 为8mg/mL；双层修饰的金纳米棒分散液与鬼臼毒素脂质体的体积比为1:1。

本发明金纳米棒鬼臼毒素脂质体的用途，是在制备化疗-热疗协同治疗癌症的药物中的应 用。

工作原理：鬼臼毒素是一种疏水性药物，临床应用受到限制。脂质体的主要成分为磷脂 (也是细胞膜的主要成分)，与胆固醇一起构成脂质双分子层，能够包裹疏水药物和亲水药物， 从而提高药物的应用前景。羧基化聚乙二醇的添加能有效提高药物在体内的循环时间，因其 在表面形成一层水化膜，避免被巨噬细胞吞噬。金纳米棒表面附有一层带正电的CTAB，其 具有较强的细胞毒性，因此在其表面依次包覆呈负电性的PSS和呈正电性的PLL，既有效降 低细胞毒性，又提高了光热稳定性。修饰过的金纳米棒(GNRs@PSS@PLL)经静电吸附作 用结合到脂质体表面，在近红外光的照射下吸收光能转化为热能，温度的升高使得脂质体原 本排列紧密的凝胶态变成流动性强的液晶态，从而加速药物的释放。

本发明的有益效果体现在：

本发明中，经聚电解质修饰的金纳米棒，其具有较好的光热稳定性(在808nm的激光刺 激下，金纳米棒的形貌及紫外吸收均未有明显变化，而普通金纳米棒已出现明显的形貌变化， 并且在808nm处几乎没有吸收)，并且未包覆药物的金纳米棒脂质体(GL)安全性较高(GL 经808nm激光照射前后的细胞存活率接近100％)。在本发明中，成功设计和制备了一种稳定 的金纳米棒鬼臼毒素脂质体(GLP)纳米复合材料(GLP经808nm的激光反复照射四个循环， 升高温度仍能保持一致，说明其光热稳定性良好)，可作为具有光热和化疗双重功能的新颖有 效的抗癌物质。GLP具有典型的囊泡形状，其流体动力学尺寸约129.8nm，ζ电位为+15.7mV。 其具有较高的消光系数(8.08Lg^-1cm^-1)和光热转换效率(46.1％)。研究还发现，与化疗(4T1>

附图说明

图1为金纳米棒鬼臼毒素脂质体纳米复合物(GLP)和NIR介导的控制释放的合成示意 图。

图2为金纳米棒鬼臼毒素脂质体的透射电镜图。从图2中可以看出，金纳米棒鬼臼毒素 脂质体具有良好的形态，尺寸大小满足静脉注射要求。

图3为金纳米棒鬼臼毒素脂质体的药物释放图。从图3中可以看出，随着时间的延长， 近红外光照射组和非照射组的鬼臼毒素释放量均逐渐增加，12小时后释放趋于平缓。且近红 外光照射组鬼臼毒素的总释放量明显多于未照射组。

图4为金纳米棒鬼臼毒素脂质体的光热特性。从图4中可以看出，在一定范围内，金纳 米棒鬼臼毒素脂质体具有浓度依赖特性，随浓度增大，温度升高值增加。

图5为金纳米棒鬼臼毒素脂质体的光热稳定性图。从图5中可以看出，经过四次光热循 环后，温度变化不明显，说明金纳米棒鬼臼毒素脂质体具有良好的光热稳定性。

图6为金纳米棒鬼臼毒素脂质体溶血实验结果图。从图6中可以看出，金纳米棒鬼臼毒 素脂质体的溶血活性极低，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害。

图7为金纳米棒脂质体的细胞毒性图。从图7中可以看出，50μg/mL金纳米棒脂质体浓 度对人脐静脉内皮细胞和4T1乳腺癌细胞的细胞毒性分别为4.7％和3.5％，说明其对人体健 康细胞不会产生伤害。

图8为金纳米棒脂质体经近红外光照射后的细胞毒性图。从图8中可以看出，经近红外 照射后，50μg/mL的金纳米棒脂质体对4T1乳腺癌细胞的细胞毒性仅为4％，说明其细胞毒性 极小。

图9为金纳米棒鬼臼毒素脂质体的协同杀伤细胞毒性图。从图9中可以看出，浓度为 25μg/mL和50μg/mL的金纳米棒鬼臼毒素脂质体对4T1乳腺癌细胞的协同杀伤效果均高于其 他两组的加和，说明金纳米棒鬼臼毒素脂质体能有效抑制4T1乳腺癌细胞。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步分析说明。

实施例1：

本实施例中金纳米棒鬼臼毒素脂质体，是将金纳米棒通过聚电解质修饰后结合到含有羧 基的鬼臼毒素脂质体的外表面所得到的纳米复合物。

本实施例中金纳米棒鬼臼毒素脂质体的制备方法如下：

1、金纳米棒的修饰

将20mL浓度为200μg/mL的金纳米棒溶液在8000rpm下离心两次，每次20分钟，弃去上清液，向沉淀物中加入10mL去离子水重悬(溶液浓度为160μg/mL)，超声条件下逐滴加 入10mL浓度为2mg/mL的PSS溶液(溶剂为6mM的NaCl溶液)，超声反应10min后静置 20min，通过静电吸附作用使PSS结合到金纳米棒的表面，离心洗去多余的PSS，获得PSS 修饰的金纳米棒；向所得PSS修饰的金纳米棒中加入5mL去离子水重悬(溶液浓度为 100μg/mL)，超声条件下逐滴加入1.5mL浓度为1mg/mL的PLL溶液(溶剂为6mM的NaCl 溶液)，超声反应10min后静置20min，通过静电吸附作用使PLL结合到金纳米棒的表面，离 心洗去多余的PLL，获得双层修饰的金纳米棒。

2、鬼臼毒素脂质体的制备

称取鬼臼毒素3mg、胆固醇3.6mg、大豆卵磷脂40mg以及DSPE-PEG2000-COOH 4mg于茄型瓶中，溶于15ml体积比为1:2的甲醇-氯仿溶液中，置于旋转蒸发仪于37℃旋转蒸发成膜，过夜干燥去除残留有机溶剂，随后加入5mL去离子水于旋蒸仪上水化，置于旋转蒸发仪于37℃旋转蒸发成膜，过夜干燥去除残留有机溶剂，加5mL去离子水于旋蒸仪上水化，置超声波细胞粉碎机下，冰浴超声10min，功率140W，过滤并灭菌后得到鬼臼毒素脂质体，于 4℃储存备用。所述过滤并灭菌是采用220nm的针孔式微孔滤膜，该滤膜具有去除杂质和除菌双重作用。

3、金纳米棒鬼臼毒素的制备

在超声条件下，将步骤1获得的双层修饰的金纳米棒分散液滴加至步骤2制得的鬼臼毒 素脂质体中，300W下超声反应10min后静置20min，得到金纳米棒鬼臼毒素脂质体。

双层修饰的金纳米棒分散液的浓度为80μg/mL；鬼臼毒素脂质体的浓度为8mg/mL；双层 修饰的金纳米棒分散液与鬼臼毒素脂质体的体积比为1:1。

实施例2：金纳米棒鬼臼毒素脂质体的电位及粒径检测

取对原溶液稀释10倍的金纳米棒鬼臼毒素脂质体样品，利用激光粒度仪(NanoZS-90， 英国)在633nm He-Ne激光下进行Zeta电位及粒径的测量。将样品注入镀金电极U形管中， 置于激光粒度仪中，于室温下对其电位进行平行三次测定。将样品注入一次性聚苯乙烯管中， 以同样的方法来测量样品粒径。实验所测得的金纳米棒鬼臼毒素脂质体的Zeta电位为 +15.7mV，粒径为129.8nm。

实施例3：金纳米棒鬼臼毒素脂质体的电镜观测

取GNRs@PSS@PLL及金纳米棒鬼臼毒素脂质体样品分别滴到铜网上，静置干燥，利用 透射电子显微镜(TEM ht7700、日立、日本)在加速电压100kV下对样品进行TEM观测分析，检测结果见图2。

实施例4：金纳米棒鬼臼毒素脂质体包封率和载药率的测定

测量包封率(EE)和载药率(DL)的方法：将鬼臼毒素脂质体(LP)以12000rpm的速度离心10分钟。在测定鬼臼毒素之前，取离心前后的脂质体各100μL，分别用900μL甲醇(1:9，v/v)溶解脂质体，过滤样品，用0.45μm的有机过滤膜除去杂质，用装有紫外检测器的高效液相色谱(HPLC)系统(1260系列，Agilent，美国)和带有预柱的C18柱(25cm×4.6mm， 5μm)以测量鬼臼毒素的浓度。流动相由甲醇和水(60:40，v/v)组成(所用流动相均需过滤 并超声排除气泡)，待基线平稳后开始进样，进样量为20μL，并以1.0mL/min的流速洗脱鬼 臼毒素。将290nm设定为检测波长，POD的保留时间约为5.6分钟。包封率(EE)和载药率 (DL)由以下公式计算：

因金纳米棒是通过静电吸附作用结合到脂质体的表面，所以对金纳米棒鬼臼毒素脂质体 的包封率应该没有明显影响。因此计算得到的鬼臼毒素脂质体包封率(5.6％)和载药率 (93.6％)可看作是金纳米棒鬼臼毒素脂质体的结果。

实施例5：金纳米棒鬼臼毒素脂质体药物释放实验

将两组金纳米棒鬼臼毒素脂质体样品分别转移至透析袋中(MWCO为3500)，而后浸入 含10mLPBS(0.01M，pH＝7.4)的离心管内，离心管放入摇床中振荡(100rpm，37℃)。随后，将其中一组金纳米棒鬼臼毒素脂质体以预定的时间间隔(0.5，1，2，4，6，8和12小时) 暴露于近红外光下5分钟(1.0W/cm²)，另外一组不予照射近红外光。在每个时间点，移除缓>

实施例6：金纳米棒脂质体的光热特性实验

金纳米棒脂质体(GL)的光热特性通过NIR照射(1.0W/cm²，808nm)下的温度变化来反映。将GL用去离子水稀释至不同浓度，并暴露近红外光下5分钟，然后每30秒手动记录>2)>

实施例7：金纳米棒鬼臼毒素脂质体溶血性实验

用生理盐水(NS)稀释收集到的健康人的新鲜全血。1mLDIW和1mL NS分别作为阳性对照组和阴性对照组。此外，将溶解在生理盐水的1mL浓度为50μg/mL的GL作为实验组。 所有组(n＝3)在37℃摇床内孵育30分钟后加入20μL稀释后的血液。继续在37℃下孵育 60分钟，再以2500rpm的速度离心5分钟，并通过UV-Vis光谱法在545nm处检测所有上清 液的吸收值。通过以下方程将获得的OD值用于计算样品的溶血度。

溶血百分比(％)＝(OD_样品-OD_阴性对照)/(OD_样品-OD_阳性)*100

结果如图6所示，表明金纳米棒鬼臼毒素脂质体(GLP)溶血活性极低，不易引起人体 红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此有利于进一步的开发应用。

实施例8：金纳米棒脂质体生物安全性

将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和4T1癌细胞在含有1％抗生素和20％胎牛血清的DMEM 中培养，并以每孔104个细胞的密度接种在96孔板中。采用MTT测定法检测金纳米棒脂质 体的细胞毒性。将HUVEC和4T1细胞置于各种浓度的金纳米棒脂质体中。孵育24小时后，将细胞洗涤3次，MTT终浓度为0.5mg/mL时再培养4小时。最后加入100μLDMSO溶解细 胞中沉淀的甲瓒晶体，用分光光度法酶标仪(Elx800，BioTek，USA)检测490nm处的吸光 度。结果见图7。

实施例9：光热后的金纳米棒脂质体生物安全性

将4T1癌细胞在含有1％抗生素和20％胎牛血清的DMEM中培养，并以每孔104个细胞 的密度接种在96孔板中。采用MTT测定法检测金纳米棒脂质体经近红外光照射 (808nm,1W/cm²)后的细胞毒性。将4T1细胞置于各种浓度的金纳米棒脂质体中。孵育24>

实施例10：金纳米棒鬼臼毒素脂质体的协同杀伤实验

将4T1癌细胞在含有1％抗生素和20％胎牛血清的DMEM中培养，并以每孔104个细胞 的密度接种在96孔板中。采用MTT测定法检测金纳米棒鬼臼毒素脂质体有无近红外光照射 (808nm,1W/cm²)对癌细胞的杀伤以及未包裹药物的金纳米棒脂质体经近红外光照射后对癌>

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构 思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。