蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用

摘要

本发明公开了蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的蛋白质OsZFP213为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。实验证明，在水稻品种中花10号中过表达OsZFP213基因，得到转OsZFP213基因水稻；与水稻品种中花10号相比，转OsZFP213基因水稻的抗逆性增强。因此，蛋白质OsZFP213在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

土壤盐碱化已成为影响农业生产的严重问题，利用基因工程手段改良作物的耐盐碱能力，提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度对植物响应盐碱等逆境胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对盐胁迫的耐逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用。

上述应用中，所述蛋白质OsZFP213可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质；

a4)与序列表中序列2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于植物且与植物抗逆相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由210个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述应用中，使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列表中序列2所示的氨基酸序列具有80％，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的氨基酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质OsZFP213的DNA分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsZFP213的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由633个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述应用中，使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种中花10号。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为培育转基因植物方法一，包括向受体植物中导入提高所述蛋白质OsZFP213表达和/或活性的物质，得到转基因植物甲的步骤；所述转基因植物甲与所述受体植物甲相比抗逆性提高。

上述培育转基因植物方法一中，所述“向受体植物中导入提高所述蛋白质OsZFP213表达和/或活性的物质”可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子实现。

上述培育转基因植物方法一中，编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质OsZFP213的DNA分子；

b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsZFP213的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由633个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

上述方法中，使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述培育转基因植物方法一中，所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的过表达载体pUN-ZFP213(正义)。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为培育转基因植物方法二，包括向受体植物中导入抑制所述蛋白质OsZFP213表达和/或活性的物质，得到转基因植物乙的步骤；所述转基因植物乙与所述受体植物相比抗逆性降低。

上述培育转基因植物方法二中，所述“向受体植物中导入抑制所述蛋白质OsZFP213表达和/或活性的物质”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质OsZFP213的核酸分子的反向互补序列得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的过表达载体pUN-ZFP213(反义)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，具体可为植物育种方法一，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。

上述植物育种方法一中，所述“增加植物中所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性的效果。

本发明所提供的植物育种方法，具体可为植物育种方法二，包括如下步骤：降低植物中所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性，从而降低植物的抗逆性。

上述植物育种方法二中，所述“降低植物中所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低所述蛋白质OsZFP213的含量和/或活性的目的。

上述任一所述方法中，所述抗逆性可为抗盐性。

上述任一所述方法中，所述受体植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)水稻；c5)水稻品种中花10号。

实验证明，在水稻品种中花10号中过表达OsZFP213基因，得到转OsZFP213基因水稻；与水稻品种中花10号相比，转OsZFP213基因水稻的抗逆性增强。因此，蛋白质OsZFP213在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤三中PCR扩增产物甲的琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为过表达载体pUN-ZFP213(正义)和表达载体pUN-ZFP213(反义)的结构示意图。

图3为实施例2步骤三中2的实验结果。

图4为实施例2中步骤三的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

中花10号(李梅芳.水稻花培品种—中花10号，农业科技通讯，1998年第1期第26页)为一水稻品种，公众可从中国科学院植物研究所获得，以重复本实验。中花10号以下简称ZH10。

DNA凝胶回收试剂盒为AxyPrep公司的产品。载体pBI121为北京拜尔迪生物技术有限公司的产品，产品目录号为MP-091。载体pUC19为北京百泰克生物技术有限公司的产品，产品目录号为DP7801。RT-PCR试剂盒为Promega公司的产品。Trizol试剂为Invitrogen公司的产品。载体pCAMBIA1301为Biovector Co.，LTD公司的产品，产品目录号为Biovec-11。EasyJecT Plus电激仪为英国EquiBio公司的产品。LA Taq、2×GC buffer和dNTPs均为TaKaRa公司的产品。

离心管规格均为1.5mL。

MS液体培养基：将NH₄NO₃>3>2PO₄170mg、MgSO₄·7H₂O>2·2H₂O>4·7H₂O>2EDTA>4·4H₂O>4·7H₂O>3BO₃>2MoO₄·2H₂O>4·5H₂O>2·6H₂O>1>6>

MS固体培养基：向MS液体培养基中加入琼脂，使琼脂在培养基中浓度为8g/L得到的培养基。

N6D2培养基：含300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、30g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基。

N6D2S1培养基：含25mg/L潮霉素和600mg/L头孢霉素的N6D2培养基。

N6D2S2培养基：含50mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素的N6D2培养基。

分化培养基(1)：含300mg/L水解酪蛋白、50mg/L潮霉素、1mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L ZT、0.25mg/L NAA、30g/L蔗糖和30g/L山梨醇的N6D2培养基。

分化培养基(2)：含300mg/L水解酪蛋白、50mg/L潮霉素、1mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L ZT、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和20g/L山梨醇的N6D2培养基。

生根壮苗培养基：含1mg/L多效唑和0.5mg/L NAA的1/2MS固体培养基。

木村B培养液记载与如下文献中：Ma JF，Goto S，Tamai K，Ichii M.Role of roothairs and lateral roots in silicon uptake by rice.Plant Physiol.2001；127：1773-1780)，其配方详见表2，pH值为5.8。

表2

实施例1、OsZFP213基因的获得

一、引物的合成

人工合成引物F1：5’-CGGGATCCATGGAGGCTCCCCCTTCTCT-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)和引物R1：5’-GGGGTACCGAGCTTCAGGTTGAGATCAACCTGC-3’(下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点)。

人工合成引物F2：5’-CGGGATCCGAGCTTCAGGTTGAGATCAACCTGC-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)和引物R2：5’-GGGGTACCATGGAGGCTCCCCCTTCTCT-3’(下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点)。

二、模板的获得

提取中花10号三叶期的幼苗的总RNA，然后将该总RNA反转录出第一链cDNA。具体步骤如下：

1、取中花10号三叶期的幼苗100mg，液氮研磨，得到冻干粉。

2、完成步骤1后，将所述冻干粉转移至装有1mL Trizol试剂的离心管中，充分混匀后，25℃静置5min。

3、完成步骤2后，取所述离心管，加入0.2mL新鲜氯仿，剧烈振摇15s，25℃温育2-3min；然后4℃、12000rpm离心15min。

4、完成步骤3后，将上清(约0.5mL)转移至离心管中，加入0.5mL异丙醇，25℃静置10min；然后4℃、12000rpm离心15min。

5、完成步骤4后，弃上清，将沉淀用1mL 75％(v/v)乙醇水溶液清洗2次，超净台吹至半干；然后用50mL DEPC-ddH₂O重悬，60℃水浴10min，得到RNA溶液。

6、完成步骤5后，按照RT-PCR试剂盒说明书的操作步骤进行反转录，得到第一链cDNA。具体如下：

(1)取RNA溶液(含2μgRNA)，加入1.0μg Oligo dT引物，然后用DEPC-ddH₂O补充至15μL，混匀，70℃变性5min，冰浴5min。

(2)向完成步骤(1)的体系中加入25μL反转录混合物(由5μL M-MLV 5×ReactionBuffer、6μL dNTP Mixture(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.5mM)、1μL M-MLVReverse Transcriptase、0.5μL RNase Inhibitor和12.5μL DEPC-ddH₂O组成)，混匀，42℃水浴1h(目的为进行反转录)，然后75℃水浴10min(目的为使反转录酶失活)，得到第一链cDNA。

Oligo dT引物、M-MLV 5×Reaction Buffer、dNTP Mixture、M-MLV ReverseTranscriptase和RNase Inhibitor均为RT-PCR试剂盒中的组件。

三、PCR扩增反应

1、以步骤二得到的第一链cDNA为模板，采用引物对甲(由引物F1和引物R1组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物甲。

反应体系(20μL)：0.2μL LA Taq(浓度为5U/μL)、10μL 2×GC buffer、1.8μLdNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.5mM)、0.5μL引物F1(浓度为10μM)、0.5μL引物R1(浓度为10μM)和7μL ddH₂O组成。

反应条件：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、以步骤二得到的第一链cDNA为模板，采用引物对乙(由引物F2和引物R2组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙。

反应体系(20μL)：0.2μL LA Taq(浓度为5U/μL)、10μL 2×GC buffer、1.8μLdNTPs、0.5μL引物F2(浓度为10μM)、0.5μL引物R2(浓度为10μM)和7μL ddH₂O组成。

反应条件同步骤1的反应条件。

将PCR扩增产物甲或PCR扩增产物乙进行0.8％(m/m)琼脂糖凝胶电泳。部分实验结果见图1(Marker为DNA Marker，1为PCR扩增产物甲)。结果表明，PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙的大小均为649bp。

采用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物甲或PCR扩增产物乙，然后进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙均含有序列表中序列1所示的核苷酸序列。将序列表中序列1所示的基因命名为OsZFP213基因，其编码的蛋白命名为OsZFP213蛋白或蛋白质OsZFP213，氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、OsZFP213蛋白在调控水稻抗盐性中的应用

一、重组质粒的构建

1、重组质粒pUN1301的构建

(1)提取玉米幼苗的基因组DNA并以其作为模板，以5’-GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG-3’(下划线为限制性内切酶HindIII的识别位点)和5’-CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(2)完成步骤(1)后，取PCR扩增产物，用限制性内切酶HindIII和BamHI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约2kb的DNA片段甲。

将DNA片段甲进行测序。测序结果表明，DNA片段甲中含有序列表中序列3所示的核苷酸序列。序列表中序列3所示的核苷酸序列为玉米泛素启动子(UbiPro)。

(3)取载体pBI121，用限制性内切酶SacI和EcoRI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约260bp的DNA片段乙(即Noster poly A)。

(4)取载体pUC19，用限制性内切酶SacI和EcoRI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约2686bp的载体骨架甲。

(5)将DNA片段乙和载体骨架甲进行连接，得到重组质粒pUC19-Noster。

(6)取重组质粒pUC19-Noster，用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约2700bp的载体骨架乙。

(7)将DNA片段甲和载体骨架乙进行连接，得到重组质粒pUN19。

(8)取重组质粒pUN19，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约2.3kb的DNA片段丙。

(9)取载体pCAMBIA1301，用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约11.8kb的载体骨架丙。

(10)将DNA片段丙和载体骨架丙进行连接，得到重组质粒pUN1301。

2、过表达载体pUN-ZFP213(正义)的构建

过表达载体pUN-ZFP213(正义)的结构示意图见图2中A(Ubi为玉米泛素启动子，NOS为Noster poly A)。

(1)取重组质粒pUN1301，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约14kb的载体骨架1。

(2)取实施例1中步骤三回收的PCR扩增产物甲，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约650kb的DNA片段1。

(3)将载体骨架1和DNA片段1进行连接，得到过表达载体pUN-ZFP213(正义)。

将过表达载体pUN-ZFP213(正义)进行测序。根据测序结果，对过表达载体pUN-ZFP213(正义)进行结构描述如下：将重组质粒pUN1301的限制性内切酶KpnI和BamHI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。过表达载体pUN-ZFP213(正义)表达序列表中序列2所示的OsZFP213蛋白。

过表达载体pUN-ZFP213(正义)具有一个表达盒A，表达盒A的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中序列表中序列4自5′末端起第1至1987位为玉米泛素启动子，第1994至2626位为OsZFP213蛋白的编码基因，第2639至2909位为Nos基因的终止子序列。

3、表达载体pUN-ZFP213(反义)的构建

表达载体pUN-ZFP213(反义)的结构示意图见图2中B(Ubi为玉米泛素启动子，NOS为Noster poly A)。

(1)取重组质粒pUN1301，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约14kb的载体骨架1。

(2)取实施例1中步骤三回收的PCR扩增产物乙，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒回收约650kb的DNA片段2。

(3)将载体骨架1和DNA片段2进行连接，得到表达载体pUN-ZFP213(反义)。

将表达载体pUN-ZFP213(反义)进行测序。根据测序结果，对表达载体pUN-ZFP213(反义)进行结构描述如下：将重组质粒pUN1301的限制性内切酶KpnI和BamHI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子的反向互补序列。

二、T₀代拟转OsZFP213水稻的获得

1、T₀代拟转OsZFP213水稻(正义)的获得

(1)采用EasyJecT Plus电激仪将过表达载体pUN-ZFP213(正义)转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为EHA105/pUN-OsZFP213(正义)。

(2)完成步骤(1)后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pUN-OsZFP213(正义)导入中花10号的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N6D2S1培养基上，筛选1代(2周)。

(3)完成步骤(2)后，将所述愈伤组织转移至N6D2S2培养基上，筛选2代，每代2周。

(4)完成步骤(3)后，将生长旺盛的抗性愈伤组织先转移至分化培养基(1)上，在分化培养箱(12小时光周期，光照强度为8000lux；白天28℃，夜晚25℃)中培养7d；再转移至分化培养基(2)上，在分化培养箱(12小时光周期，光照强度为8000lux；白天28℃，夜晚25℃)中培养至长出再生苗。

(5)完成步骤(4)后，将再生苗在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10c m左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3d，然后将小苗移入人工气候室栽培。

经过上述步骤，获得10个株系共60棵T₀代拟转OsZFP213水稻(正义)。

2、T₀代拟转OsZFP213水稻(反义)的获得

按照上述步骤1，将“EHA105/pUN-OsZFP213(正义)”替换为EHA105/pUN-OsZFP213(反义)，其它步骤均不变，获得10个株系共100棵T₀代拟转OsZFP213水稻(反义)。

EHA105/pUN-OsZFP213(反义)的制备方法如下：采用EasyJecT Plus电激仪将表达载体pUN-ZFP213(反义)转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌乙，将重组农杆菌乙命名为EHA105/pUN-OsZFP213(反义)。

3、T₀代拟转空载体水稻的获得

按照上述步骤1，将“EHA105/pUN-OsZFP213(正义)”替换为EHA105/pUN1301，其它步骤均不变，获得T₀代拟转空载体水稻。

EHA105/pUN1301的制备方法如下：采用EasyJecT Plus电激仪将重组质粒pUN1301转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌丙，将重组农杆菌丙命名为EHA105/pUN1301。

三、T₀代拟转OsZFP213水稻的鉴定

1、GUS组织化学染色

GUS染色液：含0.1％(v/v)Triton X-100、10mM EDTA、0.5mM亚铁氰化钾、0.5mM铁氰化钾和1mg/mL X-Gluc的pH7.0、100mM Na₃PO₄缓冲液。

A、T₀代拟转OsZFP213水稻(正义)的GUS组织化学染色

(1)分别将步骤二中1获得的10个株系共60棵T₀代拟转OsZFP213水稻(正义)的根段(长约2-3mm)置于GUS染色液，抽气几分钟；然后37℃温育过夜，用70％(v/v)乙醇水溶液脱色，进行如下判断：如果根段呈蓝色，则相应的T₀代拟转OsZFP213水稻(正义)为T₀代转OsZFP213水稻(正义)。

经GUS组织化学染色鉴定，共获得6个株系50棵T₀代转OsZFP213水稻(正义)。

(2)将步骤(1)鉴定为T₀代转OsZFP213水稻(正义)转移至温室栽培，然后按照不同株系收种，得到T₁代转OsZFP213水稻(正义)的种子。将T₁代转OsZFP213水稻(正义)的种子经过繁种，得到T₂代纯合转OsZFP213水稻(正义)。

取T₀代转OsZFP213水稻(正义)的株系3(简称为OE3)和株系7(简称为OE7)的T₂代纯合种子作为实验材料，进行后续实验。

B、T₀代拟转OsZFP213水稻(反义)的GUS组织化学染色

(1)分别将步骤二中1获得的10个株系共100棵T₀代拟转OsZFP213水稻(反义)的根段(长约2-3mm)置于GUS染色液，抽气几分钟；然后37℃温育过夜，用70％(v/v)乙醇水溶液脱色，进行如下判断：如果根段呈蓝色，则相应的T₀代拟转OsZFP213水稻(反义)为T₀代转OsZFP213水稻(反义)。

经GUS组织化学染色鉴定，共获得8个株系80棵T₀代转OsZFP213水稻(反义)。

(2)将步骤(1)鉴定为T₀代转OsZFP213水稻(反义)转移至温室栽培，然后按照不同株系收种，得到T₁代转OsZFP213水稻(反义)的种子。将T₁代转OsZFP213水稻(反义)的种子经过繁种，得到T₂代纯合转OsZFP213水稻(反义)。

取T₀代转OsZFP213水稻(反义)的株系1(简称为AS1)和株系3(简称为AS3)的T₂代纯合种子作为实验材料，进行后续实验。

C、T₀代拟转空载体水稻的GUS组织化学染色

(1)分别将步骤二中1获得的T₀代拟转空载体水稻的根段(长约2-3mm)置于GUS染色液，抽气几分钟；然后37℃温育过夜，用70％(v/v)乙醇水溶液脱色，进行如下判断：如果根段呈蓝色，则相应的T₀代拟转空载体水稻为T₀代转空载体水稻。

(2)将步骤(1)鉴定为T₀代转空载体水稻转移至温室栽培，然后按照不同株系收种，得到T₁代转空载体水稻的种子。将T₁代转空载体水稻的种子经过繁种，得到T₂代纯合转空载体水稻。

取T₂代纯合转空载体水稻的种子作为实验材料，进行后续实验。

2、半定量PCR

A、T₂代纯合转OsZFP213水稻(正义)的半定量PCR

待测水稻幼苗为OE3幼苗(OE3的T₂代纯合种子萌发得到)、OE7幼苗(OE7的T₂代纯合种子萌发得到)、转空载体水稻幼苗(T₂代纯合转空载体水稻的种子萌发得到)或中花10号幼苗(中花10号种子萌发得到)。

1、提取待测水稻幼苗的mRNA，然后反转录获得cDNA。

2、采用半定量PCR法检测各个待测水稻幼苗中OsZFP213基因的相对表达量(以TUBULIN基因作为内参基因)。

检测OsZFP213基因的引物为5’-ATGGAGGCTCCCCCTTCTCT-3’和5’-GAGCTTCAGGTTGAGATCAACCTGC-3’。检测TUBULIN基因的引物为5’-TCAGATGCCCAGTGACAGGA-3’和5’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’。

检测OsZFP213基因的反应程序：94℃预变性30s；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，27个循环；72℃延伸10min。

检测TUBULIN基因的反应程序：94℃预变性30s；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸10min。

实验结果见图3中A(WT为中花10号)。实验结果表明，与中花10号幼苗相比，OE3幼苗和OE7幼苗中OsZFP213基因的相对表达量均显著增加，而转空载体水稻幼苗中OsZFP213基因的相对表达量则无显著差异。因此，在OE3幼苗和OE7幼苗中，OsZFP213基因在转录水平已经成功表达。

B、T₂代纯合转OsZFP213水稻(反义)的半定量PCR

待测水稻幼苗为AS1幼苗(AS1的T₂代纯合种子萌发得到)、AS3幼苗(AS3的T₂代纯合种子萌发得到)、转空载体水稻幼苗(T₂代纯合转空载体水稻的种子萌发得到)或中花10号幼苗(中花10号种子萌发得到)。

1、提取待测水稻幼苗的mRNA，然后反转录获得cDNA。

2、采用半定量PCR法检测各个待测水稻幼苗中OsZFP213基因的相对表达量(以TUBULIN基因作为内参基因)。

检测OsZFP213基因的引物为5’-ATGGAGGCTCCCCCTTCTCT-3’和5’-GAGCTTCAGGTTGAGATCAACCTGC-3’。检测TUBULIN基因的引物为5’-TCAGATGCCCAGTGACAGGA-3’和5’-TTGGTGATCTCGGCAACAGA-3’。

检测OsZFP213基因和TUBULIN基因反应程序均如下：94℃预变性30s；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。

实验结果见图3中B(WT为中花10号)。实验结果表明，与中花10号幼苗相比，AS1幼苗和AS3幼苗中OsZFP213基因的相对表达量均显著下降，而转空载体水稻幼苗中OsZFP213基因的相对表达量则无显著差异。因此，在AS1幼苗和AS3幼苗中，OsZFP213基因在转录水平已经成功表达且使内源OsZFP213基因转录本表达量减少。

四、T₂代纯合转OsZFP213水稻的抗盐性鉴定

光暗交替培养的参数如下：光照周期16h/8h，温度30℃，光照强度10000μmol/m²/s。

待测水稻种子为AS1的T₂代纯合种子、AS3的T₂代纯合种子、OE3的T₂代纯合种子、OE7的T₂代纯合种子、T₂代纯合转空载体水稻的种子或中花10号种子。

实验重复4次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取待测水稻种子24粒，分装种子于牛皮纸袋中，28℃―30℃浸种48h。

2、完成步骤1后，28℃―30℃催芽24h(催芽过程中需保持种子湿润)，获得已催芽的种子。

3、完成步骤2后，取96孔板，每孔剪去部分下缘，然后每孔放入1粒已催芽的种子(胚芽向上、胚根向下)。

4、完成步骤3后，将所述96孔板(其上有已催芽的种子)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使已催芽的种子浸于木村B培养液，光暗交替培养3周，得到生长至三叶期阶段的水稻幼苗。光暗交替培养期间，每隔7d需更换木村B培养液。

5、完成步骤4后，将所述96孔板(其上有生长至三叶期阶段的水稻幼苗)置于盛有含200mM NaCl的木村B培养液的塑料盒上并使根部完全浸于含200mM NaCl的木村B培养液，光暗交替培养下高盐胁迫11d(高盐胁迫期间，每隔2d更换一次含200mM NaCl的木村B培养液)。

6、完成步骤5后，将所述96孔板(其上有水稻幼苗)置于盛有木村B培养液的塑料盒上并使根部完全浸于木村B培养液，光暗交替培养下恢复14d。

观察水稻幼苗的生长状态并统计存活率。存活率＝存活的水稻幼苗数/24×100％。

水稻幼苗的生长状态见图4中A。存活率统计结果见图4中B。

结果表明，高盐胁迫前，各个水稻幼苗的生长状态无显著差异；高盐胁迫后，AS1幼苗(AS1的T₂代纯合种子萌发得到)、AS3幼苗(AS3的T₂代纯合种子萌发得到)、转空载体水稻幼苗(T₂代纯合转空载体水稻的种子萌发得到)和中花10号幼苗(中花10号种子萌发得到)的叶片大部分变白，OE3幼苗(OE3的T₂代纯合种子萌发得到)和OE7幼苗(OE7的T₂代纯合种子萌发得到)的叶片症状较轻，多数呈绿色。高盐胁迫后，与中花10号幼苗的存活率(存活率为29％)相比，OE3幼苗和OE7幼苗的存活率显著增强(分别为51％和55％)，AS1幼苗和AS3幼苗的存活率降低(分别为26％和22％)，转空载体水稻幼苗的存活率无显著差异。

上述结果表明，T₂代纯合转OsZFP213水稻(正义)的抗盐性大大提高。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 蛋白质OsZFP213在调控植物抗逆性中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

atggaggctc ccccttctct ttccatcgtc gacgaagacg gcttcgtcat cgacctctcg 60

ctgacgctgg gcctgacatc gcctccgccc tctccaggcg gcgcgtctcc ttccattcct 120

ccgggaagag gcggcggcgg cggcacgagt ggtggtgaca acaacagagg cagcagaggt 180

ggtggcaatg gtggtggtgg tggtggtgtg aggctcttcc cttgcctctt ctgcaacaag 240

aagtttctca agtcgcaggc gctaggggga caccagaatg cacacaagaa ggagaggagc 300

gtcgggtgga acacccacct ctacctcccg gccggcgtcg ccgccgccac gacgacgacg 360

acgacgacga cggcgatggc cgtccctgac atggtcggca tgcccaccca ccagatgtcc 420

tccatggcgt tgcactcctg ccggcctcac cagggctccc atgtcaccgc cgccgacatc 480

gccacgctgg ctgcgccgcc acattacacc gtcgaccatg gcgttgccgg catcgccagc 540

ggcggtggtg acagctcggt ggggtggcgc caaaggcaaa gggaggccgg cggcgagaag 600

cagaggcagg ttgatctcaa cctgaagctc tag 633

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

Met Glu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Ile Val Asp Glu Asp Gly Phe Val

1 5 1015

Ile Asp Leu Ser Leu Thr Leu Gly Leu Thr Ser Pro Pro Pro Ser Pro

202530

Gly Gly Ala Ser Pro Ser Ile Pro Pro Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly

354045

Thr Ser Gly Gly Asp Asn Asn Arg Gly Ser Arg Gly Gly Gly Asn Gly

505560

Gly Gly Gly Gly Gly Val Arg Leu Phe Pro Cys Leu Phe Cys Asn Lys

65707580

Lys Phe Leu Lys Ser Gln Ala Leu Gly Gly His Gln Asn Ala His Lys

859095

Lys Glu Arg Ser Val Gly Trp Asn Thr His Leu Tyr Leu Pro Ala Gly

100 105 110

Val Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Met Ala Val

115 120 125

Pro Asp Met Val Gly Met Pro Thr His Gln Met Ser Ser Met Ala Leu

130 135 140

His Ser Cys Arg Pro His Gln Gly Ser His Val Thr Ala Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ala Thr Leu Ala Ala Pro Pro His Tyr Thr Val Asp His Gly Val Ala

165 170 175

Gly Ile Ala Ser Gly Gly Gly Asp Ser Ser Val Gly Trp Arg Gln Arg

180 185 190

Gln Arg Glu Ala Gly Gly Glu Lys Gln Arg Gln Val Asp Leu Asn Leu

195 200 205

Lys Leu

　210

<210> 3

<211> 1987

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 3

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttactt 1987

<210> 4

<211> 2909

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

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cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840

gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900

ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960

cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020

ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080

ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140

ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200

gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260

agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320

atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380

tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440

tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500

aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560

cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620

gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680

acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740

gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800

tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860

tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920

catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980

gttacttgga tccatggagg ctcccccttc tctttccatc gtcgacgaag acggcttcgt 2040

catcgacctc tcgctgacgc tgggcctgac atcgcctccg ccctctccag gcggcgcgtc 2100

tccttccatt cctccgggaa gaggcggcgg cggcggcacg agtggtggtg acaacaacag 2160

aggcagcaga ggtggtggca atggtggtgg tggtggtggt gtgaggctct tcccttgcct 2220

cttctgcaac aagaagtttc tcaagtcgca ggcgctaggg ggacaccaga atgcacacaa 2280

gaaggagagg agcgtcgggt ggaacaccca cctctacctc ccggccggcg tcgccgccgc 2340

cacgacgacg acgacgacga cgacggcgat ggccgtccct gacatggtcg gcatgcccac 2400

ccaccagatg tcctccatgg cgttgcactc ctgccggcct caccagggct cccatgtcac 2460

cgccgccgac atcgccacgc tggctgcgcc gccacattac accgtcgacc atggcgttgc 2520

cggcatcgcc agcggcggtg gtgacagctc ggtggggtgg cgccaaaggc aaagggaggc 2580

cggcggcgag aagcagaggc aggttgatct caacctgaag ctctagggta ccgagctcga 2640

atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 2700

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 2760

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 2820

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 2880

tgtcatctat gttactagat cgggaattc 2909