用于免疫印迹分析的多单元板

摘要

本发明涉及一种多单元板，其中至少一个单元由膜(优选为硝化纤维素或PVDF膜)组成，与支撑结构相关联，可使膜进行电印迹转移。该多单元板适用于高通量免疫印迹分析(包括载通分析)。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫印迹分析领域，尤其是涉及用于高通量免疫印迹分析的装置和方法。本发明在一个应用中用于以多单元格式进行载通分析的多单元板和方法。

背景技术

本申请案主张2015年5月26日提交的编号为14/721,205的美国非临时专利申请的优先权。上述申请案在此通过引用的方式整体并入本文。

蛋白质分析是现代生物研究的基础。研究生物进程中关键蛋白质因子的表达和调控及其在制药和临床研究中的应用，为疾病发病机理及其预防、诊断和治疗的实验、药物和临床研究提供了重要信息。

最近获得专利的载通技术(US8293487、8563256和8722345)改进了基于免疫印迹分析的传统蛋白质分析方法。虽然在检测前应按传统的免疫印迹分析法分析蛋白质样品，但是在载通分析中还添加了另外的洗脱步骤，以确定测定的特异性。与相关联的抗原结合的抗体或抗体复合物会通过竞争分子特异性地释放到洗脱溶液中。洗脱溶液中洗脱的抗体或抗体复合物的量反映了待分析样品中相关联的抗原的量。洗脱抗体或抗体复合物的总量可直接在溶液中进行定量，这是载通分析相比传统免疫印迹分析方法的另一优点。

与传统的免疫印迹分析方法相比，载通分析针对高通量分析表现出了简单性和适用性的优点，但也对适用的装置提出新的需求，原因是用于传统免疫印迹分析方法的现有装置并非为了满足载通分析的需要(尤其是针对高通量目的)而设计的。

在传统的免疫印迹分析中(以蛋白质印迹分析为代表)，人们已使用了几种类型的膜并针对免疫印迹分析对此类膜进行优化。此类膜包括硝酸纤维素膜和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。

传统的免疫印迹分析需要在与膜上相关联的抗原相结合的抗体或抗体复合物所在的特定印迹上检测到信号。因而要求膜具有平滑性和连续性，以便进行检测结果比较。

相反，在载通分析中，抗体或抗体复合物可通过竞争分子，分别从与相关联的抗原相结合的抗体或抗体复合物所在的特定印迹上释放出来，以便进行定量。显然，在载通分析中，蛋白质样品中的膜不得具有连续性，须彼此分离，以便分别洗脱每个蛋白质样品的抗体或抗体复合物，从而防止信号彼此交叉干扰。

在载通分析中，就膜本身而言，对膜的形状或其他物理特性并无要求，原因是对每个样品信号的检测无需在膜上进行。

多孔板已广泛用于生物化学测定和免疫印迹分析测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA))。此类多孔板包括6、24、96孔板，甚至1536孔板，也可称为微量滴定板、微板或微孔板。

用于ELISA测定的多孔板通常具有小于1μg/cm2的蛋白结合能力。相比之下，用于传统免疫印迹分析的典型膜(硝酸纤维素或PVDF膜)，均具有100至200μg/cm2的蛋白结合能力。虽然ELISA板在ELISA测定中得以成功应用，但其低蛋白结合能力限制了其在载通分析中的应用。

在最初的免疫印迹分析的中，通过斑点印迹分析，可将抗原直接施用到膜上，并使膜在空气中长时间干燥。这种做法可能不是样品应用的最佳形式，至少在常规做法中，真空被应用于膜上以增加抗原与膜的结合。

在西式印迹分析中，抗原可在电泳阶段被捕获到聚丙烯酰胺凝胶中。将捕获的抗原通过电印迹转移方式(electroblotting)转移到膜上，进行印迹分析。

本发明中，多单元板可适用于载通分析以及将抗原电印迹转移到膜上。因此，本发明提供了针对免疫印迹分析的载通分析中独特需求的解决方案，尤其是在多单元板格式中的应用。同时还明显增加了在电印迹转移的步骤中，与膜结合的抗原的量。

发明内容

本文中所使用的“本发明”或“发明”涉及示例性实施例，但不一定涉及所附权利要求所涵盖的每个实施例。

本发明提供了包括载通分析在内的高通量免疫印迹分析的方法和装置及其变型。装置可互不相同，多单元板中的至少一个单元包括与支撑结构相关联的膜以用于免疫印迹分析中蛋白质样品的免疫印迹分析和电印过程。

该支撑结构用于在多单元板内将各单元的膜彼此分离且不干扰电印迹转移过程，可为任何形状。

在载通分析中，用于单个样品的膜可为一片膜或多单元板的一个单元内的所有多片膜。在洗脱步骤中洗脱膜以便对单个样品进行定量。

对膜的形状、结构，甚至是多单元板的单个单元内膜的连续性均无限制。若在多单元板的一个单元内，多个膜可视为一个膜。

载通的一种分析方法是使用具有至少一个由膜和支撑结构组成单元的多单元板，以便进行电印迹转移和免疫印迹分析。若一个单元的膜与多单元板中的其他单元分离，且允许进行电印迹转移过程，则膜可以任何形式与支撑结构相关联。

该支撑结构的一个示例是中空突起，开口设于多单元板的单个单元两端，且膜与该突起相关联。膜可位于中空突起内的任何位置，可位于中空突起内的中间或任一端，包括覆盖中空突起的任一端。

该中空突起可具有设于单元侧壁上的开口，以便有效地洗涤膜。单元的侧壁上可具有多个开口；本发明的一个实施例中，中空结构中间的整个部分可能缺失，其中空结构的分离部分可通过杆状结构连接。本发明的另一实施例中，中空突起可变型为环形结构，旁边连接有杆状结构以形成多单元板；膜与环结构相关联。

本发明的一个实施例中，支撑结构与膜直接接触的边缘是封闭的。本发明的另一实施例中，该边缘是开放的。优选地，边缘的形状是圆形。但若多单元板可装配到多孔板中，则边缘可为其他形状。

本发明可与一个常规的多孔板组合，以完成载通分析。多孔板的单孔壁可用作物理屏障，以防止洗脱溶液彼此交叉污染。

多单元板可通过典型的免疫印迹分析方法进行处理，之后进行载通分析的洗脱步骤，该多单元板与多孔板结合以便从多单元板的单个单元中洗脱抗体。

多单元板在洗脱步骤前可单独处理，也可成批处理。尽管如此，在洗脱步骤中，多单元板必须与相匹配的多孔板单独使用。

优选地，本发明中板的多个单元包括以2n乘3n阵列排列的6n个单元，其特征在于n是大于0的整数，优选地，单元以矩形填充方式排列。优选的单元数是公知的单元数，例如，6、24、96、384和1536个单元。更优选的板为96个单元和384个单元的板，原因是此类格式最为流行，且具有许多可用附件，包括流体处理机器人等的流体处理附件。

本发明的一个实施例中，多单元板中的单个单元可单独寻址。

本发明中多单元板可由膜和任何合适的非导电材料制成。合适的材料包括但不限于陶瓷、弹性体、环氧树脂、玻璃、玻璃陶瓷、塑料、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、橡胶、硅、氧化硅和硅橡胶。

只要膜可以结合相关联的样品，对多单元板中使用的膜的形状或三维结构无限制。本发明的实施例中，多单元板的一个单元中的膜表面可为平滑。本发明的另一实施例中，单个膜的表面可为不光滑。

本发明的一个实施例中，可在点样之前或之后处理单个膜，以增加蛋白质结合效率。

本发明的一个实施例中，多单元板与多孔板的组合可用于分析传统免疫印迹分析中的样品。将相关联的样品点于本发明中多单元板的单个单元的膜，在将膜置于传统多孔板中，使用酶标仪和适当的试剂进行检测之前，该膜应经过电印迹转移、洗涤、抗体孵化并洗涤步骤。

本发明的其他方面将部分地在下文的详细说明书、附图以及后附的所有权利要求中进行说明，或在本发明的实践中得到学习。应当理解，上文的概述和下文的详细说明仅为示例性和说明性，并不限制于所公开的发明。

附图说明

图1是多单元板实施例的示意图。1A-多单元板的顶视图；1B-多单元板的侧视图；1C-多单元板的横截面图；1D-多单元板中单个单元的结构；包括单个单元的侧视图和横截面图；1E-1H-多单元板中单个单元的几个实施例；1I-1J-与膜直接接触的支撑结构边缘的实施例；1K-图1J-具有边缘的单个单元的侧视图；101-本发明中的多单元板；102-多单元板的整体支撑结构；103-与多单元板的整体支撑结构相关联的膜；104-包括单个单元和膜的支撑结构的多单元板中的单个单元；105-单个单元的支撑结构；106-与单个单元的支撑结构相关联的膜；107-与膜接触的单独单元支撑结构的封闭边缘；108-与膜接触的单个单元支撑结构的开口边缘；109-将中空结构的两部分连接在一起的杆状结构；110-多单元板中单个单元侧壁上的开口。

图2是多单元板中单个单元的其他几个实施例示意图；2A-单元的前视图；2B-单个单元的侧视图；图2C是多单元板中单个单元另一实施例的示意图。

具体实施方式

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的本发明中的含义相同。

本发明提供了包括载通分析的免疫印迹分析的装置。载通分析在简单性和多单元格式适用性方面，有别于传统的免疫印迹分析分析(包括西式印迹分析)。载通分析中的洗脱步骤要求单个样品的洗脱溶液相互进行物理分离，以避免交叉污染。换言之，应将每个样品点在单个膜上，单个样品的洗脱溶液须限于多单元板中单个单元内的膜。

本发明的实施例中，附图展示了用于载通分析的装置的一种形式。多单元板101包括整个支撑结构102和膜103。优选地，膜103为PVDF或硝酸纤维素膜。

单个单元104包括支撑结构105和膜106。该支撑结构105内部中空，两端具有开口。将待分析样品直接点在单个单元104内的膜106上。

本发明的一个实施例中，如图1E所示，膜106位于单个单元104中空支撑结构105的底部。本发明的另一实施例中，如图1F所示，膜位于单个单元104中空支撑结构105的中间。本发明的另一实施例中，膜位于单个单元104中空支撑结构105的顶部。本发明的一个实施例中，单个单元104中空支撑结构105的侧壁上可具有开口110。本发明的另一实施例中，单个单元104支撑结构的侧壁上可具有多个开口110。

本发明的一个实施例中，如图1I所示，与膜106直接接触的单个单元支撑结构的边缘107是封闭的。本发明的另一实施例中，如图1J和1K所示，与膜106直接接触的单独单元支撑结构的边缘108是开放的。

本发明的另一实施例中，中空支撑结构105侧壁上部和下部之间的整个部分缺失，且支撑结构的上部和下部通过中间的杆状结构109连接。本发明的另一实施例中，如图2C所示，膜可连接到环形结构，该环形结构可通过杆状结构109连接到多单元板。

优选地，本发明中板的覆盖区域与标准多孔板相同，因此多单元板可放置于典型多孔板内。优选地，本发明中板的多个单元包括以2n乘3n阵列排列的6n个单元，其特征在于n是大于0的整数，优选地，单元以矩形填充方式排列。优选的单元数是公知的单元数，例如，6、24、96、384和1536个单元。更优选的板为96个单元和384个单元的板，原因是此类格式最为流行，且具有许多可用附件，包括流体处理机器人等的流体处理附件。

膜103的表面可为平滑，或可为粗糙；膜的表面也可具有突起。

将抗原直接施用在多单元板中至少一个单元的膜上，以便进行电印迹转移。本领域技术人员应了解到膜可通透，以便进行电印迹转移过程。本领域技术人员应了解到，尽管膜的孔可变化，但须限制相关联的抗原自由通过膜。

多单元板的支撑结构102可由任何合适的非导电材料制成。合适的材料包括但不限于陶瓷、弹性体、环氧树脂、玻璃、玻璃陶瓷、塑料、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、橡胶、硅、氧化硅和硅橡胶。

完成典型的免疫印迹分析方法之后，将带有结合在板104中单个单元膜106上免疫复合物的多单元板101插入典型的多孔板中。将含有竞争分子的洗脱溶液加入到多孔板的单孔中，以便从膜106中洗脱抗体或抗体复合物，进行信号定量。

板104中单个单元的膜106可由任何合适材料制成，该材料应具有与硝酸纤维素或PVDF膜相当的蛋白结合能力。本发明的整个板可由一种材料制成，也可由多种不同材料制成(例如，多层)。

本文中所使用的“膜”可视为广义的膜。膜可为表面具有足够孔隙的任何材料，从而可允许检测抗体进入，且表面具有适当的亲和力以便结合抗原。所有此类材料可以合适的形状使用，或可涂覆、粘结、层压，或简单地附着到合适的支撑材料(例如，纸、玻璃、塑料材料)上，只要不干扰电印迹转移过程。例如，膜可为但不限于硝酸纤维素膜或PVDF膜。

本领域技术人员应了解如何制备用于免疫印迹分析的样品。该样品包括但不限于化学分子、肽分子、蛋白质分子、RNA分子、DNA分子、传统抗体(例如，两条重链和两条轻链)、重组抗体或片段、细胞、病毒颗粒和包含可交联上述任何两种或多种的产物的混合物。该样品可通过适当的样品缓冲液而带有电荷。

本领域技术人员应了解如何处理膜，以便进行免疫印迹分析。该做法包括但不限于将样品直接点在膜上，或用乙醇或甲醇将膜预处理后再点样。膜上经过点样的多单元板可在空气中干燥，然后经过包括电印迹转移等典型免疫印迹分析过程进行处理。，

本领域技术人员应了解如何进行电印迹转移(electrobloting)。经过点样的膜可在适当的电流下置于转移缓冲液内，以增加结合到膜上的蛋白质量。

本文中所使用的“常规多孔板”可视为广义的多孔板；常规多孔板可为本发明中内部可放置多单元板的任何板，以使多单元板中单个单元彼此物理分离。

本领域技术人员应了解如何处理表面上点样后的单个膜，以便进行免疫印迹分析。该步骤包括用封闭缓冲液封闭各个膜、用一抗孵化、洗涤、用二抗孵化并再次洗涤，以消除非特异性地结合到膜上的抗体。

本发明的另一实施例中，本发明的多单元板可用于传统的免疫印迹分析，包括ELISA分析、斑点印迹分析、细胞免疫印迹分析和蛋白质阵列分析。由于电印迹转移明显增加了膜的结合能力以及结合效率，因此适用于高通量免疫印迹分析。

将蛋白质样品点到本发明中多单元板单个单元的膜上。将膜置于常规多孔板中之前，膜须经过电印迹转移和一系列典型的免疫印迹分析步骤(包括封闭、用一抗孵化、洗涤、用二抗孵化并洗涤步骤)。通过向含有本发明中多单元板的多孔板单孔中加入合适的检测试剂，可使用酶标仪来检测本发明中多单元板单个单元的膜上结合的抗体的量，该信号可直接在包含本发明中多单元板的多孔板单孔中进行检测，或可将溶液从包含本发明中多单元板的多孔板单孔转移到另一多孔板，以便使用酶标仪进行定量。

虽然本发明的若干实施例已在附图中示出，且上文的说明书已对其进行了详细说明，但应当理解，本发明并不限于所公开的实施例。本领域的技术人员应清楚了解多种替代、修改和变型。因此，本发明旨在要求包括所附权利的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变型。

使用本发明方法的以下示例进一步说明了本发明的性质。应当理解，本发明不限于此。

示例1

使用4XSDS缓冲液(Laemmli缓冲液)制备相关联的样品。本发明的96单元板的每一个单元带有6μl的HEK-293细胞的全细胞裂解物。

将多单元板进行电印迹转移20分钟。

使用本发明的多单元板进行典型的免疫印迹分析方法，包括封闭、用一抗孵化、洗涤、用二抗孵化并洗涤的步骤。二抗用辣根过氧化物酶标记，作为免疫印迹分析的报告酶。

将多单元板置于含有竞争分子洗脱缓冲液或100μl/孔TBS的多孔板中，持续15分钟，以便将抗体复合物从多单元板的膜中释放。

将洗脱缓冲液转移到常规96孔板中，以便使用带有酶标仪的典型化学发光报告测定试剂盒(微孔过滤器)进行信号定量。

示例2

使用4XSDS缓冲液(Laemmli缓冲液)制备相关联的样品。本发明的96单元板的单个单元带有6μ1的HEK-293细胞的全细胞裂解物。

将多单元板进行电印迹转移转移20分钟。

使用本发明的多单元板进行典型的免疫印迹分析方法，包括封闭、用一抗孵化、洗涤、用二抗孵化并洗涤的步骤。二抗用辣根过氧化物酶标记，作为免疫印迹分析的报告酶。

将多单元板置于多孔板中。将40μl的TBS与制备的ECL溶液(微孔过滤器)以1:1的比例混合，并加入到用于固定本发明中多单元板多孔板的单孔中。

10分钟后，将ECL溶液从上述多孔板转移到新的多孔板中，60μl/孔，以便用酶标仪进行定量。