一种细菌靶向纳米粒子的制备及其抑杀细菌的应用

摘要

本发明公开了一种细菌靶向纳米粒子的制备及其抑杀细菌的应用。该细菌靶向纳米粒子通过结构如式(Ⅰ)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物进行自组装制备得到。本发明通过使用光敏剂和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯制备聚(N,N‑二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)‑共聚‑聚光敏剂，再以此为大分子链转移剂和甲基丙烯酸正丁酯为疏水单元进行第二嵌段的聚合，并可将其羧基活化与细菌靶向肽连接，通过自组装形成在水中可溶的纳米粒子。得到的纳米粒子可以通过细菌靶向肽选择性的与细菌结合，提高材料的安全性；光动力和物理作用联合抗菌方式提高材料的抗菌活性，同时还不易使细菌产生耐药性，可广泛的应用于抑菌、杀菌领域。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料抗菌技术领域，具体涉及一种细菌靶向纳米粒子的制备及其抑杀细菌的应用。

背景技术

细菌无处不在，无孔不入，其中病原微生物更是种类繁多，变异迅速，它们的传播和蔓延严重威胁着人民的健康。由于病原微生物易变异，使用靶点单一的抗生素疗法面临着很大的挑战。在抗生素和病原微生物的博弈中，抗生素已经不再具有压倒性的优势，以前对抗生素敏感的病原微生物出现了耐药现象，导致病原体引发的感染越发严重。虽然科研人员一直在研发新的抗生素，但是研发速度远远赶不上病原微生物的变异速度；更严峻的是耐药性问题丝毫没有得到解决，反而变的愈来愈严重，甚至出现了对多种新抗生素具有耐药性的多药耐药性的“超级细菌”，引起全世界的恐慌。因此研究出新的能够对抗耐药菌且不会使细菌产生耐药性的抗菌药物迫在眉睫。

当前病原微生物产生多药耐药性是通过突变实现的，这些突变的产生是由于其质粒中耐药基因的积累。其耐药机制通常包括：(1)产生一种药物修饰的酶对药物进行修饰；(2)产生一种药物降解的酶对药物进行降解；(3)药物排出泵将进入细菌内部的药物清除出去。传统抗生素作用靶点和抗菌机制单一，易使细菌产生耐药性，因此需要发展多靶点，多种抗菌机制的药物来克服耐药性问题。

光动力抗菌疗法是结合光敏剂分子和氧气在光照射下产生的活性氧，坏破病原微生物蛋白，核酸等大分子，导致病原微生物死亡的一种抗菌方法。一般中性或者带负电荷的光敏剂对革兰氏阳性菌有抗菌作用，但是对革兰氏阴性菌作用很弱，抗菌作用的差异主要是由于它们细胞壁的结构不同造成的。因此需要联合物理抗菌方法来增强光动力抗菌效果。

物理抗菌方法是抗菌肽或聚合物，通过静电相互作用与膜结合并进行共组装，使细菌膜去极化，导致细菌质膜紊乱，内溶物外流，最终使细菌死亡的一种机械性的抗菌方法。抗菌肽物理破坏细菌虽不会使细菌产生耐药性，但抗菌肽毒性大，易被蛋白酶降解等缺点限制了抗菌肽应用于临床。发展一种低毒性、高稳定性的两亲性高分子聚合物来代替抗菌肽是很有必要的。物理破坏作用先使细菌细胞膜破坏，再联合光动力快速使细菌蛋白、脂质、核酸等大分子失活，因此物理和光动力联合抗菌方式能够解决细菌耐药性问题。

总而言之，发展一种物理和光动力联合抗菌方式同时能够靶向细菌降低材料毒性的药物来克服细菌耐药性问题是非常有意义的。

发明内容

针对上述问题，本发明的发明人发现，将光敏剂与N,N-二甲基氨基乙酯甲基丙烯酸酯(DMAEMA)进行高效聚合，形成亲水片段，形成的亲水片段再与疏水单体甲基丙烯酸正丁酯(BMA)进行聚合，形成两亲性嵌段聚合物，最后再连接细菌靶向肽，最终带靶向肽的两亲性聚合物在水溶液中进行自组装后，可形成能够靶向细菌并且通过光动力和物理破坏联合抗菌的纳米粒子，这种联合抗菌纳米粒子可以克服细菌耐药性问题。

本发明的首要目的在于提供一种能通过光动力和物理作用靶向抑杀细菌且不会使细菌产生耐药性的纳米粒子，即所述细菌靶向纳米粒子。

本发明的另一目的在于提供上述细菌靶向纳米粒子的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述细菌靶向纳米粒子的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种细菌靶向纳米粒子，其通过结构如式(Ⅰ)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物进行自组装制备得到：

式(Ⅰ)中，各个R₁独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；各个R₂独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；R₃为细菌靶向肽，优选为Ubiquicidin(以下简称UBI)、HLFpeptides、hNP-1或Depsipeptide；PS为光敏剂，优选为吩噻嗪类光敏剂(phenothiazinium>R₄独立地为-C₆H₅、-CH₂C₆H₅、-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂OH或-CH₂OH；Q独立的为-CHCNCH₃CH₂CH₂COOH、或-CH₂CH₂COOH；m＝2-200；n＝2-200；g＝2-200；h＝1-10；i＝1-10。

本发明所述的吩噻嗪类光敏剂包括亚甲基蓝(methyleneblue)玫瑰红(rosebengal)或甲苯胺蓝(toluidine blue O)等；

所述的机染料类光敏剂包括曙红(eosin)或罗丹明B(rodamine B)等；

所述的卟啉类(porplyrin)光敏剂结构式为

所述的酞菁类(phthalocyanine)光敏剂结构式为

本发明所述的细菌靶向肽UBI的氨基酸序列为TGRAKRRMQYNRR(具体为Thr-Gly-Arg-Ala-Lys-Arg-Arg-Met-Gln-Tyr-Asn-Arg-Arg)；HLFpeptides的氨基酸序列如公开号CN101395180A中所公开的HLF肽序列；hNP-1的氨基酸序列为

ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC[Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys(Disulfide bridges Cys2-Cys30,Cys4-Cys19,and Cys 9-29)]；hNP-1和Depsipeptide(中文名称为：N-(11,23-二异丁基-14-异丙基-7-甲基-5,9,12,15,21,24-六氧代二十二氢-7H,17H-二哒嗪并[6,1-c:6,1-i][1,4,7,10,13,16]氧杂五氮杂十九环-8-基)-2-(甲酰氨基)-3-甲基戊烷酰胺)可从市场上直接购买得到。

优选的，h＝2，i＝2，P’为C₆H₅CSS-，此时，所述细菌靶向纳米粒子通过结构如式(II)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物进行自组装制备得到：

式(II)中R₁、R₂、R₃、PS、S、m、n以及g的定义与式(Ⅰ)相同，即：各个R₁独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；各个R₂独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；R₃为细菌靶向肽，优选为UBI、HLFpeptides、hNP-1或Depsipeptide；PS为光敏剂，优选为吩噻嗪类光敏剂、有机染料类光敏剂、卟啉类光敏剂或酞菁类光敏剂等；Q独立的为-CHCNCH₃CH₂CH₂COOH、或-CH₂CH₂COOH；m＝2-200；n＝2-200；g＝2-200。

优选的，式(Ⅰ)中P’为C₆H₅CSS-，Q为-CHCNCH₃CH₂CH₂COOH，并且PS为曙红；此时所述细菌靶向纳米粒子通过结构如式(Ⅲ)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物进行自组装制备得到：

式(Ⅲ)中，R₁、R₂、R₃、h、i、m、n以及g的定义与式(Ⅰ)相同，即：各个R₁独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；各个R₂独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；R₃为细菌靶向肽，优选为UBI、HLFpeptides、hNP-1或Depsipeptide；g＝2-200；m＝2-200；n＝2-200；i＝1-10；h＝1-10。

优选的，R₁、R₂为H，h＝2，i＝2，P’为C₆H₅CSS-，Q为-CHCNCH₃CH₂CH₂COOH，PS为曙红，并且细菌靶向肽R₃为UBI时，所述细菌靶向纳米粒子通过结构如式(Ⅳ)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物进行自组装制备得到：

式(Ⅳ)中，TGRAKRRMQYNRR为细菌靶向肽UBI的氨基酸序列，m＝2-200；n＝2-200；g＝2-200。

上述细菌靶向纳米粒子的自组装方法：将式(Ⅰ)所示的带有靶向片段的两亲性聚合物溶于有机溶剂中，快速加入搅拌的去离子水中，然后通过透析或者超滤法除去有机溶剂即得；所述有机溶剂优选是二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或多种。

优选的，所述带有靶向片段的两亲性聚合物通过以下步骤制备得到：将两亲性嵌段聚合物溶于有机溶剂，用甲苯共沸除水0.5-2h后，与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)以1：2：2的当量真空反应6-24h，再加入细菌靶向肽，反应6-48h，最后通过无水乙醚沉淀制得；所述有机溶剂优选为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种；所述细菌靶向肽优选为UBI、HLFpeptides、hNP-1或Depsipeptide，最优选为UBI。

更优选的，所述两亲性嵌段聚合物通过以下步骤制备得到：使甲基丙烯酸丁酯单体与大分子链转移剂在有机溶剂中以及引发剂存在下，在50-120℃温度下反应1-100h，然后通过石油醚沉淀制得所述两亲性嵌段聚合物；所述引发剂优选为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种，最优选为AIBN；所述有机溶剂优选为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种；其中所述甲基丙烯酸丁酯单体的结构如式(1)所示，所述大分子链转移剂的结构如式(2)所示：

式(2)中：各个R₂独立地为H、CH₃或CH₂CH₃；各个P’独立地为R₄独立地为-C₆H₅、-CH₂C₆H₅、-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂OH或-CH₂OH；Q独立的为-CHCNCH₃CH₂CH₂COOH、或-CH₂CH₂COOH；n＝2-200；g＝2-200。

更为优选的，所述大分子链转移剂通过以下步骤制得：将小分子链转移剂、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯和光敏剂在有机溶剂中，以及引发剂存在下，在50-120℃温度下反应1-100h，然后通过石油醚沉淀制得；所述引发剂优选为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种，最优选为AIBN；所述有机溶剂优选为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃和甲苯中的一种或多种；其中所述小分子链转移剂的结构如式(3)所示，所述甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯的结构如式(4)所示，所述光敏剂为吩噻嗪类光敏剂、有机染料类光敏剂、卟啉类光敏剂或酞菁类光敏剂；

在大分子链转移剂的制备过程中，如使用的光敏剂不具备能够进行聚合反应的官能团(如双键，三键，羟基，羧基等)，需预先将光敏剂使用一些小分子化合物(例如曙红需要预先使用对氯甲基苯乙烯修饰，等)进行修饰，然后再将修饰后的光敏剂与甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯聚合；如使用的光敏剂本身具备能够进行聚合反应的官能团则不需要对其进行预先修饰。光敏剂的修饰方法一般使用本领域的常规技术即可。

更为优选的，式(2)所示大分子链转移剂，即聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)-共聚-聚光敏剂，其分子量为420-40300，即n＝2-200，g＝2-200。

在其中一个优选的实施方案中，所述两亲性嵌段聚合物结构式如式(Ⅴ)所示：

其中m＝2-200，n＝2-200，g＝2-200。

本发明提供的细菌靶向纳米粒子在抑菌或杀菌领域中的应用。

本发明利用可逆加成断裂链转移聚合方法(RAFT)将光敏剂与甲基丙烯酸N,N二甲基乙酯共聚(DMAEMA)得到含光敏剂的亲水性聚合物(P(DMAEMA-co-PS))；再次利用可逆加成断裂链转移聚合方法(RAFT)将疏水性化合物甲基丙烯酸正丁酯(BMA)与上述合成的亲水性聚合物进行聚合得到含光敏剂的两亲性嵌段聚合物(P(DMAEMA-co-PS)-b-PBMA)，并且最后用细菌靶向肽对两亲性嵌段聚合物进行修饰。最终通过自组装的方法将细菌靶向肽修饰后得到的带有靶向片段的两亲性聚合物组装为纳米粒子，它可以通过光动力和物理破坏作用靶向抑杀细菌并且不会使细菌产生耐药性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)将光敏剂用共价连接的方式与亲疏水化合物聚合，并自组装成纳米粒子，这样不仅可以使光敏剂稳定，而且可以使光敏剂聚集，同时产生更多的ROS，高效杀死细菌。

(2)发明的纳米粒子首次联合光动力和物理两种作用机制不同的抗菌方式，不仅可以高效杀死耐药菌，而且不会使细菌产生耐药性，可以克服细菌耐药性问题。

(3)用细菌靶向肽作为靶向片段，使纳米粒子能选择性的靶向到细菌表面，特异性杀死细菌，而不对正常细胞产生毒性，可以提高材料的安全性。

附图说明

图1为实施例1制备的大分子链转移剂，即聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)-共聚-曙红P(DMAEMA-co-EOS)在氘代DMSO中的核磁共振氢谱(n＝～14)。

图2为实施例2的两亲性嵌段聚合物P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA在氘代DMSO中的核磁共振氢谱。

图3为实施例4的基于曙红光动力和物理靶向抑杀细菌纳米粒子的动态光散射和TEM表征的结果。

图4为实施例4的基于曙红光动力和物理靶向抑杀细菌纳米粒子(即UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆自组装得到的纳米粒子)在不同浓度时对金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠杆菌、铜绿假单胞菌活性的影响以及其在10μM时对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈的图片。

图5为实施例4的基于曙红光动力和物理靶向抑杀细菌纳米粒子选择性抑杀细菌，但不对正常细胞产生影响的共聚焦结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明涉及一类以聚甲基丙烯酸丁酯(PBMA)为疏水链、N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯和光敏剂共聚的高分子链为亲水链的两亲性嵌段聚合物，再连接细菌靶向肽。例如UBI-P(DMA-co-EOS)-b-PBMA的合成及其自组装得到的纳米粒子。本发明以光敏剂与N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)进行可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)后得到亲水性聚合物，再与甲基丙烯酸丁酯(BMA)进行聚合后得到两亲性嵌段聚合物P(DMAEMA-co-PS)-b-PBMA，最后可以通过活化羧基、脱水缩合的方式连接细菌靶向肽形成带有靶向片段的两亲性聚合物，最终形成的带有靶向片段的两亲性聚合物经过自组装后可以形成通过光动力和物理作用靶向抑杀细菌并且不会使细菌产生耐药性的纳米粒子。此类纳米粒子可高效并且靶向对抗细菌，解决了光敏剂分散，产生ROS不集中问题，同时克服抗菌材料毒性及其耐药性问题；具有高效广谱抗菌活性，对耐药菌也有抑杀能力，使用后细菌难以产生耐药性。属于药物化学和生物医用高分子领域。

在一个具体实施方案中，使用曙红光敏剂，先将曙红用对氯甲基苯乙烯修饰，然后与N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯单体共同聚合得到对氯甲基苯乙烯修饰的曙红两亲性聚合物(P(DMAEMA-co-EOS))，再使用该大分子链转移剂(P(DMAEMA-co-EOS))和甲基丙烯酸丁酯(BMA)制备通过物理和光动力联合抗菌的两亲性嵌段聚合物(P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA))，之后加入UBI制得带有靶向片段的两亲性聚合物(UBI-P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA)，最后将UBI-P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA自组装得到所述细菌靶向纳米粒子。在对氯甲基苯乙烯修饰的曙红(EOS)两亲性聚合物中，EOS单体的聚合度g以及聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)及聚(甲基丙烯酸丁酯)的聚合度n、m依据实验设定的聚合度和转化率而定，通常在g＝2-200、m＝2-200、n＝2-200的范围内。

在上述具体实施方案中，使用聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)-共-聚曙红(P(DMAEMA-co-EOS))作为大分子链转移剂，其通过使用RAFT聚合方法，对氯甲基苯乙烯修饰的曙红(EOS)与N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯单体共同聚合得到；所述大分子链转移剂P(DMAEMA-co-EOS)制备方法如反应式(a)所示的RAFT聚合反应：

式(a)的具体步骤为：使用小分子链转移剂(CTA)和N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯，二甲基亚砜作为有机溶剂，在引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)的存在下，温度控制在50-120℃，反应1-100h，然后通过石油醚沉淀，获得终产物。

在上述具体实施方案中，所述的通过物理和光动力联合抗菌的两亲性嵌段聚合物即P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA的制备方法如反应式(b)所示的RAFT聚合：

式(b)的具体步骤为：使用大分子链转移剂(P(DMAEMA-co-EOS))和甲基丙烯酸丁酯(BMA)，二甲基亚砜和1,4-二氧六环为有机溶剂，在引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)的存在下，温度控制在50-120℃，反应1-100h，然后通过石油醚沉淀，获得终产物。

在上述具体实施方案中，所述的带有靶向片段的两亲性聚合物即UBI-聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)-共聚-聚曙红-嵌段-聚甲基丙烯酸丁酯(UBI-P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA)的制备方法如反应式(c)所示：

式(c)的具体步骤为：先将通过物理和光动力联合抗菌的两亲性嵌段聚合物(P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA))溶于DMSO中，甲苯共沸除水0.5-2h，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)将羧基活化6-24h，再与细菌靶向肽UBI(氨基酸序列TGRAKRRMQYNRR)脱水缩合反应，常温下反应6-48h，然后用石油醚沉降，得到终产物。

在上述具体实施方案中，所述细菌靶向纳米粒子采用“自下而上”的自组装方法制备得到：将UBI-P(DMAEMA-co-EOS)-b-PBMA溶于有机溶剂中，将去离子水加入到其中，搅拌一段时间，通过透析或者超滤法除去有机溶剂。

以下实施例中所用原料说明如下：

曙红(Eosin-y)、对氯甲基苯乙烯购自Sigma-Aldrich公司，使用时未进一步纯化。N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)购自Sigma-Aldrich公司，使用前使用碱性Al₂O₃柱子处理纯化；甲基苯烯酸酯(BMA)购自Sigma-Aldrich公司，使用前减压蒸馏纯化。偶氮二异丁腈(AIBN)购自Acros，并用95％乙醇重结晶纯化。三乙胺通过5A分子筛干燥。二氯甲烷用氢化钙干燥，然后蒸馏纯化。四氢呋喃用钠丝干燥回流，蒸馏后使用。石油醚、无水乙醚、乙酸乙酯等其他试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司，未进一步纯化直接使用。实验中所用的超纯水均由Milli-QSP智能超纯水系统制备，电阻率为18.4MΩ·cm。式(3)所示的小分子链转移剂参考文献方法制得(Lei>

以下实施例将对本发明作进一步说明，实施例1-7采用，R₁和R₂＝-CH₃，R₃＝-CH₂CH₃，并且i＝2，h＝2。其目的仅在于更好地理解本发明，而不是限制本发明的保护范围。

实施例1：P(DMAEMA-co-EOS)大分子链转移剂的制备

参照上述反应式(a)，将式(3)所示的小分子链转移剂CTA(13.9mg，0.05mmol)、N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA，353.7mg，2.25mmol)、对氯甲基苯乙烯修饰的曙红(EOS，191mg，0.25mmol)和偶氮二异丁腈AIBN(1.64mg，0.01mmol)在安瓿瓶中溶于1.5mL 1,4-二氧六环。将安瓿瓶置于液氮中冷冻后用油泵抽气，然后密闭安瓿瓶，恢复到室温使反应混合物融化，然后再冷冻抽气，如此冻融循环反复操作三次，然后在真空下密封，70℃下搅拌反应20h后用液氮中止聚合反应，打开反应瓶，将反应后混合物在石油醚中沉淀，离心，再溶解在二氯甲烷中并用大量石油醚沉淀，反复三次，最终产物在真空干燥箱中室温过夜干燥，得到红色黏稠固体(366mg，产率67.2％)。图1显示了本实施例制备的P(DMAEMA-co-EOS)的核磁共振氢谱，经过对比计算链转移剂中苯环上的质子在7.0ppm以上处的积分面积与甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯中N上甲基的质子在2.3ppm处的积分面积，得到DMAEMA的聚合度为20，EOS的聚合度为0.8，其分子式表示为P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)，其结构式如式(d)所示。

实施例2：P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆两亲性嵌段聚合物的制备

参照上述反应式(b)，将实施例1所制备的大分子链转移剂P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)(302mg，0.075mmol)、甲基丙烯酸丁酯(BMA，213mg，1.5mmol)和偶氮二异丁腈AIBN(2.46mg，0.015mmol)在安瓿瓶中溶于1.1mL>20-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆，其结构式如式(e)所示。

实施例3：(UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆)的制备

参照上述反应式(c)，将实施例2所制备的两亲性嵌段聚合物P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆(31.5mg，0.005mmol)加入到5mL的安瓿瓶中溶于1mLDMF，加入3mL甲苯，甲苯共沸除水0.5h后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，1.9mg，0.01mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(1.2mg，0.01mmol)常温下密封搅拌反应12h，即将两亲性嵌段聚合物P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆未端羧基活化，再加入细菌靶向肽(UBI，6.76mg，0.004mmol)常温下密封搅拌反应24h后，将反应后混合物在乙醚中沉淀，离心，再溶解在DMF中并用大量石油醚沉淀，反复三次，最终产物在真空干燥箱中室温过夜干燥，得到红色黏稠固体，其结构式如式(f)所示。本实施例加入的细菌靶向肽UBI序列为：TGRAKRRMQYNRR。

实施例4:基于曙红光动力和物理靶向抑杀细菌纳米粒子的构建

将1mg实施例3制备的UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆充分溶于0.5mL>

通过自组装形成的细菌靶向纳米粒子采用粒度仪对其在水相中的尺寸进行了表征，UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆自组装得到的细菌靶向纳米粒子的平均直径约为28.2nm，PDI为0.39。如图3所示，使用TEM对细菌靶向纳米粒子进行了表征，进一步验证了该结果。并且透射电镜TEM的结果略小于动态光散射的结果。这是由于采用粒度仪对该细菌靶向纳米粒子在水相中的尺寸进行表征时，胶束外面形成一层水化层，造成粒径略大于TEM结果的现象。

实施例5:细菌靶向纳米粒子的抗菌性能的评价

抗菌实验选取了金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和耐甲氧西林葡萄球菌MRSA(ATCC43300)作为革兰氏阳性菌的典型代表，大肠杆菌(ATCC 25922)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)作为革兰氏阴性菌的典型代表。以金黄色葡萄球菌为例，首先将金黄色葡萄球菌的一个单菌落接种到MH肉汤培养基上，进行37℃摇床过夜培养。将菌液使用MH肉汤培养基进行稀释至OD600达到0.1，之后再重新接种至MH肉汤培养基中进行培养直到达到中度对数期。最后将菌液稀释至OD600＝0.001对应的菌液浓度约为5×10⁵CFU>-1，在96孔板中将调整好的100μL菌液加入到提前使用灭菌去离子水进行系列2倍稀释好的各种细菌靶向纳米粒子溶液100μL中。使用培养基Broth与细菌进行孵育的作为对照组。用酶标仪测定各个孔的OD600值作为0h的值。37℃摇床培养12h，再次测定各个孔的OD600值。计算出在不同浓度药物下对细菌活性的影响。

细菌的活性％＝[DrugOD600_12h-DrugOD600_0h]/[BrothOD600_12h-BrothOD600_0h]×100％

其中DrugOD600_0h和DrugOD600_12h分别表示细菌靶向纳米粒子处理组在0h和12h的OD600值。BrothOD600_0h和BrothOD600_12h分别表示培养基空白组在0h和12h的OD600值。

如图4所示，UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆细菌靶向纳米粒子对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA)、大肠杆菌和铜绿假单胞菌均有强的抗菌活性。UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆自组装得到的细菌靶向纳米粒子对其的最低抑菌浓度MIC如表1所示。

表1 UBI-P(DMAEMA₂₀-co-EOS_0.8)-b-PBMA₁₆自组装得到的细菌靶向纳米粒子最低抑菌浓度

实施例6:共聚焦实验验证细菌靶向纳米粒子选择性靶向细菌，而不损伤正常细胞

先将铜绿假单胞菌置于摇床，37℃活化培养12h后，3000r/min离心5min,用PBS洗涤两次，用PBS将细菌稀释到1×10⁸CFU，加500μL菌液含有1×10⁵个细菌的共聚焦皿，加入500μL含10％血清的DMEM培养基，置于4℃冰箱培养10min后，将培养液取出3000r/min离心3min去除多余的药物，细菌稀释到原来的浓度，并将培养皿中的细胞消化下来，然后将细菌和细胞混合，滴加10μL细菌和细胞混合液到载玻片上，盖上盖玻片，立即置于共聚焦下观察，激发波长为488nm。

如图5所示，细菌表面有红色荧光，细胞表面无荧光，说明药物能选择性结合到细菌表面，药物具有靶向病原体的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。