一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法，属于分子鉴定技术领域。通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并尽可能的在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头特有的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码：所述DNA条形码为由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。利用该DNA条形码将大大有利于药用植物黄花乌头的快速鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，及利用该DNA条形码鉴定黄花乌头的方法。

背景技术

黄花乌头(Aconitum coreanum(H.Léveillé)Rapaics)，又名关附子、白附子、山喇叭花和黄乌拉花等，为毛莨科乌头属多年生草本药用植物，是吉林省特别是长白山区道地药材。其块根关白附入药，具有祛风、燥湿、化痰止痛之功效。乌头属植物在我国有200余种，同时该属植物均属为有毒植物，乌头类药材使用中同名异物或同物异名的现象普遍存在。国内报道乌头类药中毒屡见不鲜，各种乌头属植物依据传统形态或显微鉴定方法不易辨识。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，DNA条形码技术已经被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过渡依赖，能帮助鉴定物种、发现新种等。

目前，在乌头属药用植物的相关分子鉴定研究中，存在物种鉴定库构建时样品取样不足，未能考虑不同物种间或同一物种内可能存在不同个体间变异位点异同的问题，导致鉴定的可靠性差，准确率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，及利用该DNA条形码鉴定黄花乌头的方法，提高鉴定结果的可靠性和准确率。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，所述DNA条形码为由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。

优选的，所述DNA条形码的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种基于大数据DNA条形码的黄花乌头鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到629bp的扩增产物，所述DNA条形码引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

(3)对所述扩增产物进行测序，按照下列特异性位点进行黄花乌头物种鉴别的序列特征比对：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C；

若扩增产物符合上述条件，则该待测样本为黄花乌头。

优选的，所述PCR的扩增体系为25μL，组份配比如下：10μmol/L正反向引物各1.0μL，25mmol/L 10×PCRbuffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.5μL，5unit/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，50～100ng/L模板DNA 1.0μL，ddH2O 16.75μL。

进一步优选的，所述PCR的扩增条件为：94℃预变性2min，1循环；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。

优选的，本发明所述测序采用双向测序，所述测序的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步优选的，所述测序的反应体系为5μL：其中ddH₂O>

更优选的，所述测序的反应条件为：96℃预变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，33个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。

相较于以往的形态学或分子鉴定方法，本发明是首次在对乌头属药用植物进行广泛取样的基础上，利用ITS序列作为DNA条形码鉴定黄花乌头，通过对ITS序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测过程快速，结果准确性高。该方法将大大有利于药用植物黄花乌头的快速鉴定。

附图说明

图1为构建乌头属药用植物所用的部分样品的PCR扩增产物图谱，其中，位于右边位置的“M”为GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder；

图2为乌头属药用植物所用的部分样品比对序列结果。

具体实施方式

本发明通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并尽可能的在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头特有的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。

本发明的黄花乌头DNA条形码为由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增得到的总长为629bp的序列，在该序列中，特异性识别位点为：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。本发明的扩增引物采用的是ITS序列的通用引物，扩增得到的629bp的序列中，根据上述特异性位点的碱基种类即可鉴定黄花乌头。

由于本发明的黄花乌头DNA条形码是基于尽可能多获得的乌头属药用植物材料得到的，考虑到了不同物种间或同一物种内可能存在不同个体间变异位点异同的问题，是一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码。采用本发明的上述黄花乌头DNA条形码能够快速准确的对黄花乌头进行鉴定，克服了现有技术中鉴定可靠性差的缺陷。

本发明通过对待测样本的DNA进行提取，通过对扩增产物进行测序，将扩增产物的序列与本发明黄花乌头DNA条形码中的特异识别位点进行比对，直接获得鉴定结果。检测过程快速，结果准确性高，可用于药用植物黄花乌头的快速鉴定。

本发明中，待测样本的DNA提取方法采用本领域技术人员所熟知的方法。在本发明具体实施例中，采用改良的4×CTAB法提取待测样本的总DNA。本发明对待测样本中DNA来源没有特殊限定，可以为待测样本的叶子、根或茎。

本发明中PCR扩增及对扩增引物进行测序时所用的序列均为ITS的通用序列，具体为：

ITS4(SEQ ID NO.1)：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，

ITS5(SEQ ID NO.2)：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。

本发明中，PCR扩增方法及对扩增产物进行测序的方法采用本领域技术人员所熟知的方法即可。

本发明优选采用25μL的PCR扩增体系，组份配比为：10μmol/L正反向引物各1.0μL，25mmol/L 10×PCR buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2.5μL，5unit/μL Taq DNA polymerase 0.25μL，50～100ng/L模板DNA 1.0μL，ddH₂O>

PCR的扩增条件为：94℃预变性2min，1循环；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。上述扩增体系及扩增条件下所有备筛选的样本DNA序列均能成功扩增。本领域技术人员可以在上述技术方案的基础上对扩增体系和扩增条件进行适当合理调整，如改变扩增体系的体积、组分的浓度、调整扩增的温度及时间等，均属于本发明的保护范围。本发明优选对扩增产物进行纯化。采用本领域技术人员所熟知的纯化方法进行即可。若扩增得到629bp的扩增产物，则待测样本有可能为黄花乌头，通过测序比对特异性识别位点对待测样本是否为黄花乌头进行进一步鉴定。

本发明对测序的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的测序方法，如单向测序或双向测序。在本发明具体实施例中，优选采用双向测序。

本发明中优选采用5μL的测序反应体系：ddH₂O>

将测序结果与本发明的黄花乌头DNA条形码进行比对，若满足下列条件则待测样本为黄花乌头：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。

本发明采用通用引物及本领域技术人员均能操作的PCR扩增和测序方法即可对其进行快速鉴定，检测过程快速、结果准确性高。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：

1、乌头属药用植物标本的采集和保存

查阅文献和国内各大标本馆的馆藏信息，根据DNA条形码的采样要求制定野外采样策略，每个物种尽可能的采集其分布区内不同来源的多个个体(1-13个)，所有个体的叶片用硅胶干燥保存。共获得乌头属70余种(含变种)206份的叶片材料，其余部分样品的序列信息从NCBI基因库下载(共23条)。其中，黄花乌头的样品来自黑龙江省、吉林省和辽宁省的5个地方，涵盖该物种的主要分布区，每个样点各采集3份叶片样品。材料清单和样品来源见表1。

表1乌头属药用植物标本及来源

2、总DNA提取

利用改良的4×CTAB法提取上述乌头属植物叶片的总DNA，具体步骤如下：

(1)将研钵洗净于烘箱中烘干备用，提取总DNA前用酒精灼烧研钵，杵子，勺子以灭菌。

(2)选取干净的叶片放在研钵中，用液氮冷却材料待水份完全损失后，用力研磨材料使之呈粉末状，然后将研磨好的材料转移到预冷的2ml的离心管中。

(3)在2ml的离心管中加入1ml预热的4×CTAB提取液和2μlβ-巯基乙醇(2％V/V)，使材料完全分散在提取液中，在65℃水浴锅中温浴约1.5小时，期间摇匀3～5次。

(4)将温浴的材料取出置于室温下，待冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)溶液，摇匀5～10分钟，然后以10000～12000转/分钟离心5分钟。

(5)将上清液(约700～800μl)转移到一新的离心管中(注意在吸取过中不要把杂质吸起来)，再加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24:1)，摇匀5～10分钟，然后以10000～12000转/分钟离心5～10分钟。

(6)将上清液(约450～600μl)转移到一新的离心管中，加入70％体积的异丙醇，沉降DNA，轻轻颠倒2～3次，可见白色絮状沉淀，室温或4℃冰箱中静置30分钟以上，然后10000～12000转离心5～10分钟，弃上清。

(7)用200μl的70％的乙醇和无水乙醇各洗2次，瞬时离心20～30s后弃上清，然后将离心管放在37℃烘箱中(或室温下)使乙醇挥发。待总DNA干燥后加30～50μl TE溶液和1～2μl RNase A于37℃烘箱中用核糖核酸酶(RNaseA)消化2～3小时，然后于-20℃(或4℃)冰箱中保存备用。

3、PCR扩增反应

DNA浓度用紫外分光光度计(UV-VIS spectrophotometer(TU-1800))检测，最后稀释到50～100ng/μL备用。

采用下列引物扩增核糖体DNAITS序列：

ITS4(SEQ ID NO.1)：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，

ITS5(SEQ ID NO.2)：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。

PCR反应体系为25μL，组份配比如下：正反向引物(10μmol/L)各1.0μL，10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus，25mmol/L)2.5μL，dNTP(2.5mM)2.5μL，Taq>2O16.75μL。

在以下扩增条件下所有备筛选的引物均能成功扩增：94℃预变性2min，1循环；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；结束后72℃延伸7min，4℃保存。

对扩增产物进行纯化，方法按试剂盒(上海生工Sangon)说明操作。使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果证明，本发明扩增条件下所有备筛选的乌头属样本引物均能成功扩增。部分样品电泳图谱参见图1。

4、扩增产物测序

测序反应试剂使用ABI公司的PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing ReactionKit，双向测序。

测序反应体系为5μL：其中ddH₂O>

测序引物的序列同步骤3中的扩增引物序列，即SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

测序反应条件为：96℃预变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，33个循环；结束后加20μL沉降剂(无水乙醇：3M醋酸钠＝20：1)，4℃沉降过夜。沉降产物经70％酒精纯化后加20μL ddH₂O在95℃条件下变性2分钟后上样，在ABI>

5、数据分析

运用软件SeqMan(DNAstar)和BioEdit(ver 7.0.0)对测序结果分别进行拼接和比对，矩阵中的插入缺失用“-”代替。构建乌头属药用植物的ITS序列矩阵，获得ITS序列数据库。

6、序列比对及黄花乌头的序列特征

序列比对的结果为：整个矩阵总长640bp，由229条序列构成。其中，从NCBI下载23条，本发明获得206条，序列分属乌头属72种(含变种)常见入药植物。在矩阵中，黄花乌头所有样品的ITS序列识别位点为：在92bp碱基为A，206bp和207bp位置为缺失，452bp和456bp位置为A，其余物种为G；500-501bp有AT插入，其余物种样品该位点缺失；508bp位置为T，其余物种样品为G；587bp位置为C，其余为T。

若仅看单个物种的序列，所有不同来源的黄花乌头扩增序列一致，用引物ITS4和ITS5扩增得到的扩增产物序列如SEQ ID NO.3所示，该序列的总长为629bp，第89bp为碱基A，443bp为A，447bp为A，491bp和492bp为AT，499bp为T，577bp为C。

根据本发明所获得黄花乌头的特异信息位点可以作为黄花乌头的DNA条形码用于黄花乌头的鉴定。本发明的鉴定方法仅利用一般的通用性引物，通过PCR扩增和测序方法，通过上述7个特异性识别位点即可对黄花乌头进行快速鉴定。

实施例2

以药材种植区和野外所采集的无花无果的黄花乌头和其他乌头属植株叶片为材料，采用实施例1的方法进行DNA提取，PCR扩增和测序，鉴定结果显示，在已知的黄花乌头植物所获得ITS序列的第89bp为碱基A，443bp为A，447bp为A，491bp和492bp为AT，499bp为T，577bp为C，而其他未知的乌头属植物未见上述特异性位点，由此可以鉴定出黄花乌头样品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

<120> 一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 3

<211> 629

<212> DNA

<213> Aconitum coreanum

<400> 3

cgaaacctgc ccagcagagc gacccgcgaa caagtgaaaa caaaaccgga cggaccgaag 60

aggggcgcat gcccccgatc gcccgcccat cggaccgcga cctcttctgc gaccgcactg 120

atttgtgggt ggaggggtgg gttgttgagt ccgcacaaaa ccaaaaaccg gcgcgacagg 180

cgccaaggaa atcttagcgg aaagagggct tccccgttcg cggaggcagt cttcagaatc 240

cgatactcaa acgactctcg gcaacggata tctcggctct tgcatcgatg aagaacgtag 300

cgaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtc tttgaacgca 360

agttgcgccc gaggccatta ggtcgagggc acgtctgcct gggcgtcaca cacagcgtcg 420

caccccgtca accacgttgt cgaggaacgg agattggccc cccgggcccc tgcgggcacg 480

gtcggcacaa atatgttttt ccccggcggc gagcgtcgcg gtcagcggtg gttgtatttc 540

tcatcctcca aagacatcaa gacgcgtcgt cctcgtcgca tgttgggaca catcgacccc 600

acgaagtcgc tttgcgcgac attcaccct 629