用于测量土霉素的光电化学传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及电化学技术领域、环境检测技术领域，特别涉及一种用于检测土霉素的光电化学传感器。该传感器为土霉素适配体/TiO

说明书

技术领域

本发明涉及电化学技术领域、环境检测技术领域，特别涉及一种用于检测土霉素的光电化学传感器。

背景技术

土霉素是一种四环素类抗生素，由于抗菌性好且价格便宜，被滥用于兽药和饲料添加剂中, 从而导致在食品和自然水体中大量残留，对人类的健康和环境的安全造成严重的威胁。因此，开发出灵敏、特异性强、快速、低成本的测定土霉素的残留方法是十分必要的。

中国专利公开号CN 105259231公开了一种用于土霉素检测的电化学适体电极及其制备方法，该适体电极包括玻碳电极，所述玻碳电极外表面从里到外依次附有还原石墨烯-金纳米复合材料层，土霉素抗体层和牛血清白蛋白封闭层，该适体电极制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。中国专利公开号CN 104777206公开了一种检测土霉素的适体电极及其制备方法，该适体电极在玻碳电极上自下而上依次修饰有石墨烯- 金纳米复合物、BSA-OTC 复合物。信号层为亚甲基蓝修饰的在RCA 链扩增反应下折叠成G 四连体结构的核酸适配体，通过亚甲基蓝的量反映目标物的含量，该适体电极制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于药品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。中国专利公开号CN103616423公开了一种检测食品中土霉素（OTC）的适配体传感器，利用氧化石墨烯- 聚苯胺（GO-PANI）和辣根过氧化物酶（HRP）作为放大策略，构建了竞争型适配体传感器用于土霉素（OTC）的超灵敏检测，该发明制备的竞争型适配体传感器选择性强、灵敏度高、操作简单快速，适合食品中土霉素（OTC）的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的土霉素适配体光电化学生物传感器，并提供其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题的方案是：

一种土霉素适配体光电化学生物传感器，为土霉素适配体/TiO₂-rgo/FTO电极；所述土霉素适配体的序列如SEQ>

上述土霉素适配体光电化学生物传感器的制备方法是，先在FTO导电玻璃上采用水热法制备纳米TiO₂，得到TiO₂/FTO导电玻璃电极，再将氧化石墨烯溶液采用电化学方法进行还原并沉积在TiO₂/FTO导电玻璃电极上，得到TiO₂-rgo/FTO电极，然后将土霉素适配体修饰在TiO₂-rgo/FTO电极上，得到适配体/TiO₂-rgo/FTO电极(Aptamer//TiO₂-rgo/FTO)。

进一步的，具体方法是：

（1）清洗FTO导电玻璃并烘干；

（2）FTO导电玻璃上用水热法制备纳米二氧化钛：在容器中按20~80:和20~80的体积份数依次加入超纯水、浓盐酸，然后在搅拌的条件下缓慢的加入0.5-2体积份数的钛酸正丁酯，搅拌均匀，得到混合液；将烘干的FTO导电玻璃放入清洗干净并且干燥过的高压反应釜的内衬中，并且量取适量的混合液倒入其中；反应温度为80℃-200℃，时间为4-12h；样品自然冷却后，用超纯水清洗玻璃，晾干；然后放入300-600℃马弗炉中恒温2-5h后，即得到TiO₂/FTO导电玻璃电极；

（3）rGO 修饰>2/FTO导电玻璃电极的制备：制备浓度为0.1-2mg/mL的氧化石墨烯水溶液；将TiO₂/FTO导电玻璃的面积剪切成0.25-1cm²，以这种面积的TiO₂/FTO导电玻璃作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，采用循环伏安法进行还原，扫描范围为－2.5～2.5>－1；待>2-rgo/FTO电极；

（4）修饰OTC适配体：在TiO₂-rgo/FTO电极的表面上滴涂30-100μL的0.01%~0.2%的壳聚糖溶液，待其干燥后，用去离子水清洗，再吹干，然后将30-100μL>2-rgo/FTO电极(Aptamer//TiO₂-rgo/FTO)。

优选的，步骤（4）所述壳聚糖溶液浓度优选0.1%，滴涂量优选为90μL。

优选的，步骤（3）在 150 W 氙灯辐照和加偏压为0.1V条件下，氧化石墨烯沉积时间优选为300s。

一种上述土霉素适配体光电化学生物传感器的应用，是用于水样中土霉素含量的检测。

一种上述土霉素适配体光电化学生物传感器检测溶液中土霉素含量的方法是，将土霉素适配体光电化学生物传感器放入用PBS缓冲溶液稀释的待测水样中， 30-60℃反应1h，用超纯水清洗，然后用电化学工作站进行信号检测；采用安培电流时间曲线法，初始电位为-0.2V- 0.2V，运行时间为30-100s，来检测传感器与土霉素反应前后的光电流值。本发明具有如下有益效果：

本发明是在FTO上用水热法合成TiO₂再利用电化学沉积石墨烯，并将其作为光电传感的基底，然后在这个基础上固定OTC适配体，得到土霉素适配体光电传感器。利用土霉素适配体对土霉素检测的专一性与光电化学方法的快速、经济、简单、灵敏的优点相结合，成功的构建了一种性能优良、稳定可靠、低成本以及选择性强的测量土霉素光电化学传感器，实现了对水样中微量土霉素的检测。选择壳聚糖滴涂量的浓度为0.1%，电化学沉积石墨烯的时间为300s的最优条件，该传感器的线性范围是5.0×10^-6～5.0×10^-9mol/L，检测下限为1.0×10^-9mol/L，可以用于实际生活中对土霉素残留量的测定。

附图说明

图1为氧化石墨烯的红外光谱图。

图2为纳米TiO2和复合材料TiO2-rgo的扫描电子显微镜图。

图3为不同修饰电极在PBS缓冲液中光电流的大小图。

图4为不同修饰电极的阻抗图。

图5为光电流与滴涂的壳聚糖浓度的关系图。

图6为TiO2/FTO电极浸入GO电解液中扫描不同时间对其光电流的影响图。

图7为不同浓度的土霉素对Aptamer/TiO2-rgo/FTO光电流响应上的影响图。

图8为Aptamer/TiO2-rgo/FTO电极在PBS缓冲溶液中测定300s的光电流数据图。

具体实施方式

下面结合具体实验对本发明做详细的说明。

实验方法

1.1试剂的配制

1、OTC-aptamer的反应液：各组分浓度为：100mM NaCl ,20mM Tris-HCl,5mM KCl,1mMCaCl₂,2mM>2,pH=7.6，121℃灭菌15min，4℃保存。

2、OTC-aptamer溶液：OTC-aptamer的链序列是：5’-NH₂-（CH₂）₆-GGA>

3、OTC溶液（0.01M）：称取0.046g的土霉素用PBS缓冲液溶解，定容到10ml，置于4℃避光保存。所需不同浓度的OTC以此逐级稀释。

4、PBS缓冲液：由0.1M磷酸二氢钾和0.1M磷酸氢二钠配制。

氧化石墨烯（GO）制备

本论文采用常规的Hummers法来制备实验所需的氧化石墨烯。具体方法为现有技术，在此不详细阐述。

传感器的构建和检测

本文的实验步骤有以下两个大的部分构成：第一：传感器的构建。第二：光电信号的检测。

一、传感器的构建。

1.导电玻璃（FTO）的清洗：先用丙酮超声清洗15min，然后在无水乙醇中超声清洗15min，接着在超纯水中超声清洗15min，最后在烘箱中烘干。

2.导电玻璃（FTO）上制备纳米TiO₂：用水热法制备纳米二氧化钛，先在100mL的烧杯中加入30mL的超纯水，再往里面加入30mL的浓盐酸，搅拌的条件下缓慢的加入1mL的钛酸正丁酯，搅拌30min，得到混合液。将烘干的导电玻璃（FTO）放入清洗干净并且干燥过的高压反应釜的内衬中，并且量取适量的混合液倒入其中。反应温度为160℃，时间为6h。样品自然冷却后，用超纯水清洗玻璃，晾干。然后放入450℃马弗炉中恒温3h后，即得到TiO₂/FTO导电玻璃电极。

3.rGO 修饰>2/FTO导电玻璃电极的制备：将100>2/FTO导电玻璃的面积剪切成1cm²，以这种面积的TiO2/FTO导电玻璃作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极(SEC)>－1)>2-rgo/FTO电极。

4.修饰OTC适配体：在TiO₂-rgo/FTO电极的表面上滴涂90μL的0.1%的壳聚糖溶液，待其干燥后，用去离子水清洗，再吹干。然后将50μL稀释好的戊二醛溶液（2.5%）滴涂到修饰好的电极表面，在室温黑暗放置1h。清洗并干燥后，然后在上面滴涂50μL的OTC适配体，在4℃的冰箱中放置12h。之后拿用PBS缓冲液洗去未反应的OTC适配体，得到适配体/TiO₂-rgo/FTO电极（Aptamer//TiO₂-rgo/FTO）。

二、光电信号的检测过程。

将制备好的传感器（适配体/TiO₂-rgo/FTO）与50μL的0.1M>

实验结果及分析

2.1>2-rgo纳米复合材料的表征

一、氧化石墨烯的红外光谱图

图1为氧化石墨烯的红外光谱图，在图中我们可以清晰的找到主要官能团的特征峰：在1710>-1处对应的是C=O的伸缩振动吸收峰，在1390>-1处对应的是O-H的变形振动吸收峰，在1630>-1处对应的是C=C伸缩振动峰，在1060>-1处对应的是C-O-C的伸缩振动吸收峰，在3410cm^-1处对应的是O-H伸缩振动峰。说明氧化石墨烯具有较多的含氧官能团。

二、纳米TiO₂和复合材料TiO₂-rgo的扫描电子显微镜图

图2为纳米TiO2和复合材料TiO2-rgo的扫描电子显微镜图。如图2所示，图2的图A是纳米TiO₂的扫描电子显微镜图，图B是复合材料TiO₂-rgo的扫描电子显微镜图。如图A可知，纳米TiO₂排列整齐，呈现棒状;>2表面均匀的覆盖着还原氧化石墨烯，可以说明还原氧化石墨与纳米TiO2很好的结合在一起。

传感器的表征

2.2.1 不同材料对光电流的影响

图3为不同修饰电极在PBS缓冲液中光电流的大小图（（a）TiO₂-rgo/FTO，（b）Aptamer/TiO₂-rgo/FTO，（c）TiO₂/FTO，（d）与100nM的OTC反应的Aptamer/TiO₂-rgo/FTO），图3是在0.1M>2-rgo/FTO电极产生的光电流的大小，而曲线c反应了TiO₂/FTO电极产生的光电流的大小，可以明显的看到TiO₂-rgo/FTO电极产生的光电流比TiO₂/FTO电极产生的光电流大，是因为石墨烯具有二维的π–π共轭结构和较大的表面积，因此可以接收TiO₂产生的光生电子并且迅速地传递到导电基底上，从而实现了电荷空穴的分离，并且能够降低光生电子与空穴的复合，最终加速光电子的转移从而使光电流增大。曲线b反应了Aptamer/TiO₂-rgo/FTO电极产生光电流的大小，可以看出明显比TiO₂-rgo/FTO电极产生的光电流小，是因为修饰上的碱基增大了电极的阻抗，阻碍了光电子的转移，最终导致光电流变小。曲线d是和100nM>

不同修饰电极阻抗分析

本文探究了在电解质溶液（5mM>3Fe(CN)₆-K₄Fe(CN)₆-0.2M>2-rgo/FTO，>2/FTO，c-FTO，>2-rgo/FTO，>2-rgo/FTO>3Fe(CN)₆/>4Fe(CN)₆-0.2>

。如图4所示，曲线a为TiO2-rgo/FTO、曲线b为TiO₂/FTO、曲线c为FTO导电玻璃、曲线d为Aptamer/TiO₂-rgo/FTO、曲线e为OTC/>2-rgo/FTO的交流阻抗(IMP)。我们比较电极阻抗的大小是通过观察谱图中半圆的直径的大小，半圆直径越小，电极阻抗就越小。从图中看出到它们阻抗的大小，其顺序为：e>d>c>b>a，>2-rgo/FTO电极中由于石墨烯的存在大大减小了电子在电极中的传输阻力，增强电子的传递速度，因此TiO₂-rgo/FTO电极能够具有更好的光电转换性能。因为适配体对电子的传递具有较大的阻碍作用，从而导致修饰上适配体的电极阻抗变大。

优化实验条件

2.3.1 滴涂壳聚糖的浓度

图5为光电流与滴涂的壳聚糖浓度的关系图，是保持其他实验条件不变，分别向TiO₂/FTO电极表面滴涂0.01%，0.05%，0.1%，0.15%,0.2%的壳聚糖溶液，得到的修饰电极再修饰相同浓度的OTC适配体，然后在0.1MPBS缓冲溶液中的光电流响应。从图可以得到的信息是：当滴涂壳聚糖的浓度的不断增大时，其对应的光电流信号也在不断地增大；其滴涂壳聚糖的浓度为0.1%时其光电流达到最大值，但当滴涂壳聚糖的浓度大于0.1%时，其对应的光电流信号就会减小。其原因是壳聚糖对电子的传递有一定的阻碍作用，壳聚糖溶液是提供氨基与适配体进行结合的，因此选择滴涂壳聚糖溶液的浓度为0.1%>

电化学沉积氧化石墨烯的时间

图6为TiO2/FTO电极浸入GO电解液中扫描不同时间对其光电流的影响图（a沉积时间300s，b沉积时间400s，c沉积时间200s ，d沉积时间500s，e沉积时间100s），是将TiO₂/FTO电极放入GO溶液中用循环伏安法还原不同时间（圈数）并在>2/FTO的电极得到的光电流值最大。当电化学沉积时间越来越少时，TiO₂/FTO电极表面的石墨烯负载量也越来越少，其强化分离电荷能力就会降低，从而就会使其光电流响应能力减弱;>2/FTO电极表面负载的石墨烯量就会越来越多，当石墨烯的量太多时就会遮挡辐照于TiO₂表面的紫外光，从而降低了光电流响应。因此实验选择300s为还原氧化石墨烯的电化学沉积时间。

传感器的线性曲线

图7为不同浓度的土霉素对Aptamer/TiO2-rgo/FTO光电流响应上的影响图（从a到g浓度分别为：(a)5nM，(b)10nM，(c)50nM，(d)100nM，(e)500nM，(f)1000nM，(g)5000nM。插图为相对应的标准曲线图），为在上述优化条件下，在0.1MPBS（pH=7.4）缓冲溶液中，Aptamer/TiO₂-rgo/FTO电极在不同浓度的土霉素溶液中的安培电流时间（i-t）图以及线性图。由图中可见，在5.0×10^-6～5.0×10^-9mol/L浓度范围内，呈现较宽的线性关系，对应的线性回归方程：△I=-1.9806C+17.637，（Ｒ＝0.9951，△I为峰电流前后的差值，以uA为单位，C为土霉素浓度的负对数，以uM为单位。），依据3倍标准偏差计算（S/N=3）此条件下土霉素的检出限可达1.0×10^-9mol/L。

传感器重现性、重复性、稳定性的探究

2.5.1传感器的重现性

制备一支Aptamer/TiO₂-rgo/FTO电极，在上述优化条件下，和1.0×10^-7mol/>

传感器的重复性

制备出5支Aptamer/TiO₂-rgo/FTO电极，使其和1.0×10^-7mol/>

传感器的稳定性

图8为Aptamer/TiO2-rgo/FTO电极在PBS缓冲溶液中测定300s的光电流数据图。制备一支>2-rgo/FTO电极，在0.1MPBS（pH=7.4）缓冲溶液中测定300s，如图8所示，可以看出其光电流基本稳定。再制备了Aptamer/TiO₂-rgo/FTO电极，先测定在0.1M>2-rgo/FTO电极稳定性良好。

实际样品的检测

通过空白加标回收法在自来水中加入三组不同浓度的 OTC，平行测三次。检测结果显示，回收率在 93.0-107.5%的范围内，表明具有较高的准确度。

以上仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQ ID NO:1

5’-NH2-（CH2）6-GGA ATT CGC TAG CAG GTT GAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGGTGC

GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3’