一种灵敏探针及制备方法和利用其检测肠炎沙门氏菌的方法

摘要

一种灵敏探针及制备方法和利用其检测肠炎沙门氏菌的方法，它涉及一种探针及制备方法和探针的应用。本发明的目的是要解决现有探针昂贵、不稳定，抗体容易失活和灵敏度差的问题。一种灵敏探针由抗生素和信号载体制备而成，其制备方法为：一、制备黄棕色乳状液；二、制备羧基化的免疫磁珠；三、制备活化的磁性微球；四、加入重悬液保存；利用灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的方法：一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；二、待测液体与灵敏探针混合孵育，再逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，反应10分钟，读取结果。本发明只有一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，大大节省了成本，简单，方便。本发明适用于检测肠炎沙门氏菌。

说明书

技术领域

本发明涉及一种探针及制备方法和探针的应用。

背景技术

细菌感染性疾病导致的死亡人数占全球死亡人数的三分之一，这一直是一个重要的公共卫生问题。因此，早期识别细菌的感染通过即时检测(POC)对水，食物和临床诊断的安全至关重要。免疫层析试纸条，由于其制备和操作方便，成本低，一次性使用，检测时间短，结果直观可靠等优点，不需要专门的设备，是最常见的即时检测诊断工具，用于各种蛋白质、抗生素、金属离子、毒素等的检测。典型的夹心试纸条使用具有特异性的生物成分，如抗体，基于抗原抗体特异性结合原理，样品中的靶分子与结合垫上的金标抗体探针反应形成靶分子-金标探针复合物，此复合物再与在硝酸纤维素(NC)膜上测试的另一配对的抗体结合诱导出肉眼可见的颜色变化。

虽然试纸条的工作原理很简单，但不能直接应用于实际样品中食源性细菌的检测，因为食品样品中细菌的浓度非常低，大部分都是食物残渣。可以通过使用磁性纳米颗粒来解决这个问题，这使得靶细菌从大量样品溶液中捕获，分离和浓缩成小体积的溶液进行检测。然而，由于抗体的活性易受环境影响，在不同样品中，如有机样品提取中会失活，如材料标记过程中pH，盐等，都对抗体的活性有影响；对于夹心形式而言，制备抗体本身很困难，筛选到能识别同一靶目标的不同表位能形成配对的抗体更难，且成本高，灵敏度差，对肠炎沙门氏菌的最低检测限为400CFU/mL～10⁵CFU/mL。

发明内容

本发明的目的是要解决现有探针昂贵、不稳定，抗体容易失活和灵敏度差的问题，而提供一种灵敏探针及制备方法和利用其检测肠炎沙门氏菌的方法。

一种灵敏探针由抗生素和信号载体制备而成；所述的抗生素为氨苄青霉素；所述的信号载体为羧基化的免疫磁珠。

一种灵敏探针的制备方法，具体是按以下步骤完成的：

一、将FeCl₃·6H₂O和二水合柠檬酸三钠加入到乙二醇中，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，再加入醋酸钠，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，得到黄棕色乳状液；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O的质量与乙二醇的体积比为(0.5g～1g):(10mL～30mL)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与二水合柠檬酸三钠的质量比为(0.5～1):(0.1～0.4)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与醋酸钠的质量比为(0.5～1):(1～2)；

二、将步骤一中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为190℃～210℃的烘箱中放置8h～12h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗3次～5次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗3次～5次，最后在温度为60℃～70℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠；

步骤二中所述的羧基化的免疫磁珠的粒径为150nm～200nm；

三、将羧基化的免疫磁珠加入到蒸馏水中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应20min～30min，再进行磁分离，弃除溶剂，得到反应物Ⅰ；使用蒸馏水清洗反应物Ⅰ3次～5次，得到活化的磁性微球；

步骤三中所述的羧基化的免疫磁珠的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；

步骤三中所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；

步骤三中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的质量与蒸馏水的体积比为(0.5mg～1mg):1mL；

四、①、将活化的磁性微球加入到pH值为6.6的硼酸缓冲液中，再加入氨苄青霉素，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到反应物Ⅱ；②、向反应物Ⅱ中加入含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液中，继续在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到灵敏探针；再使用pH值为6.6的硼酸缓冲液对灵敏探针清洗3次～5次，再加入重悬液，得到灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液；

步骤四①中所述的活化的磁性微球的质量与pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)；

步骤四①中所述的活化的磁性微球与氨苄青霉素的质量比为1:(2～5)；

步骤四②中所述的反应物Ⅱ的质量与含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)。

利用灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的方法，具体是按以下步骤完成的：

一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条：

肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有肠炎沙门氏菌单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

所述的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的制备方法如下：

①、检测线的制备：

将肠炎沙门氏菌单克隆抗体溶于包被液中，得到肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液；用划线方式将肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿25mm～30mm的位置上，得到检测线，然后于36℃～37℃条件下干燥20min～30min，得到含有检测线的硝酸纤维素膜；

②、样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为13mm～18mm，宽为2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到样品垫；

③、结合垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为7mm～9mm，宽2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到结合垫；

④、吸水垫的制备：

将吸水纸剪裁成长为16mm～20mm，宽为2mm～4mm，得到吸水垫；

⑤、组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、含有检测线的硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，得到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；

二、取100μL待检测液体，向100μL待检测液体中加入5μL灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后在温度为35～37℃和转速为200r/min～300r/min的摇床中充分混合孵育20min～40min，再进行磁分离，弃去上清液，得到磁和待检测物质的复合物；向磁和待检测物质的复合物中加入100μL蒸馏水或100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行重悬，得到样品溶液；将样品溶液逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为检测试纸条，同时取100μL蒸馏水或100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，逐滴滴加到另一肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为对照试纸条，10min后读取结果；

检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌的浓度高于或等于80CFU/mL；(2)：阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌低于80CFU/mL。

与现有技术相比，本发明的优点与积极效果在于：

一、本发明为了解决免疫层析检测低灵敏度的这个问题，制备了灵敏探针来富集待测物，代替了检测抗体，既降低了成本，又提高了分析系统的灵敏度，这对于监控肉蛋奶类食品中的肠炎沙门氏菌具有很重要的意义和应用价值；通过该构建，肠炎沙门氏菌能够通过T线上的捕获抗体有效捕获，其打破了传统同时采用测试抗体和捕获抗体的夹心试纸条的形式，只使用一种抗体，大大降低了成本并实现高度灵敏的检测。此外，这种简便的传感器大大简化了免疫测定相关分析试剂的早期制备过程，如：预加载探针的制备过程。该设备具有很高的灵敏度和很强的特异性，结构简单，成本效益高，不需要设备，快速的分析时间和便携性，具有极大的应用潜力来满足POC诊断测定的要求。该方法已成功应用于牛奶中沙门氏菌的检测，验证了其实用性和适用性。因此只需一种抗体，该方法就可以作为通用检测平台去检测所有病原菌；

二、本发明制备的羧基化的免疫磁珠作为灵敏信号载体，羧基化的免疫磁珠易于制备，很好的光学特性，不仅具有适当的尺寸(150-200nm)，良好的均匀性，分散性和稳定性，而且表面含有大量羧基官能团，以利于活化和修饰，所以赋予了它超高的纳米信号负载能力。与其他大尺寸材料比如纳米二氧化硅，单壁碳纳米管，石墨烯等相比，羧基化的免疫磁珠合成简单，稳定，分散，易于活化修饰，避免了复杂的化学合成，这可以简化生产并确保均匀性和批次之间的一致性；本发明选用的氨苄青霉素去捕获细菌，代替了抗体的作用，氨苄青霉素表面含有氨基，能与羧基化的免疫磁珠表面的羧基结合，既可以牢牢作用于细菌表面且能杀死菌，成本低，是一种很有前景的信号载体；

三、打破了传统的夹心检测方法：本发明只用一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法，大大节省了成本，解决了配对抗体的困难，因此，本发明更简单，方便和新颖；

四、灵敏探针：本发明首次在免疫层析试纸条检测中以氨苄青霉素和羧基化的免疫磁珠构建探针，替代了昂贵的检测抗体，这项工作为牛奶等实际样品检测肠炎沙门氏菌开发了便宜，灵敏，便携和快速读出的分析系统；

五、灵敏度高：本发明提供的试纸条对肠炎沙门氏菌的最低检测限为80CFU/mL，其值低于现有技术报道的检测值；

六、良好的实际应用：本发明可以检测牛奶中的肠炎沙门氏菌，且灵敏度与标准菌株浓度一样，可以达到80CFU/mL，具有很好的应用前景，可以作为通用检测方法检测所有的病原菌；

七、本发明自检测肠炎沙门氏菌的方法与传统的夹心检测方法相比，成本降低了40％～60％。

八、本发明只有一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法，大大节省了成本，解决了配对抗体的困难，更简单，方便，新颖。本发明适用于检测肠炎沙门氏菌。

本发明适用于检测肠炎沙门氏菌。

附图说明

图1为实施例一制备的灵敏探针的示意图，图1中1为羧基化的免疫磁珠，2为氨苄青霉素，3为灵敏探针，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；

图2为实施例二步骤一制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的结构示意图，图2中1为样品垫，2为结合垫，3为检测线，4为硝酸纤维素膜，5为吸水垫；

图3为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条检测原理图，图3中1为待检测液体，2为灵敏探针，3为加入磷酸盐缓冲液进行重悬，4为肠炎沙门氏菌单克隆抗体，5为反应10min；

图4为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的灵敏度；

图5为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的特异性，图5中1为待检测液体为肠炎沙门氏菌菌液，2为待检测液体为鼠伤寒沙门氏菌菌液，3为待检测液体为伦敦沙门氏菌菌液，4为待检测液体为哈达尔沙门氏菌菌液，5为待检测液体为乙型沙门氏菌菌液，6为待检测液体为大肠杆菌菌液，7为待检测液体为金黄色葡萄球菌菌液，8为待检测液体为弯曲杆菌菌液，9为待检测液体为李斯特菌菌液，10为待检测液体为阪崎肠杆菌菌液，11为待检测液体为白色念珠菌菌液；

图6为利用实施例一制备的灵敏探针测定牛奶中肠炎沙门氏菌的浓度结果；

图7为肠炎沙门氏菌的SEM图；

图8为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的SEM图；

图9为实施例三步骤二中灵敏探针捕获10²CFU/mL待测液体中肠炎沙门氏菌的SEM图；

图10为不同物质对肠炎沙门氏菌的抑菌圈，图10中AMP为氨苄青霉素，sterilewater为无菌水，MNPs为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠，AMP-MNPs为实施例一步骤四得到的灵敏探针；

图11为饱和磁化强度曲线，图11中1为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的饱和磁化强度曲线，2为实施例一步骤四得到的灵敏探针的饱和磁化强度曲线；

图12为红外光谱图，图12中1为氨苄青霉素的红外光谱曲线，2为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的红外光谱曲线，3为实施例一步骤四得到的灵敏探针的红外光谱曲线；

图13为紫外吸收光谱图，图13中1为氨苄青霉素的紫外吸收光谱曲线，2为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的紫外吸收光谱曲线，3为实施例一步骤四得到的灵敏探针的紫外吸收光谱曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式是一种灵敏探针，该探针由抗生素和信号载体制备而成；所述的抗生素为氨苄青霉素；所述的信号载体为羧基化的免疫磁珠。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的羧基化的免疫磁珠的粒径为150nm～200nm。其它步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：所述的羧基化的免疫磁珠具体是按以下步骤制备的：

一、将FeCl₃·6H₂O和二水合柠檬酸三钠加入到乙二醇中，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，再加入醋酸钠，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，得到黄棕色乳状液；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O的质量与乙二醇的体积比为(0.5g～1g):(10mL～30mL)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与二水合柠檬酸三钠的质量比为(0.5～1):(0.1～0.4)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与醋酸钠的质量比为(0.5～1):(1～2)；

二、将步骤一中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为190℃～210℃的烘箱中放置8h～12h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗3次～5次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗3次～5次，最后在温度为60℃～70℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠。其它步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤二中将步骤一中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为190℃～200℃的烘箱中放置8h～10h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗3次～4次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗3次～4次，最后在温度为60℃～65℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠。其它步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式是一种灵敏探针的制备方法具体是按以下步骤完成的：

一、将FeCl₃·6H₂O和二水合柠檬酸三钠加入到乙二醇中，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，再加入醋酸钠，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中溶解30min～60min，得到黄棕色乳状液；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O的质量与乙二醇的体积比为(0.5g～1g):(10mL～30mL)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与二水合柠檬酸三钠的质量比为(0.5～1):(0.1～0.4)；

步骤一中所述的FeCl₃·6H₂O与醋酸钠的质量比为(0.5～1):(1～2)；

二、将步骤一中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为190℃～210℃的烘箱中放置8h～12h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗3次～5次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗3次～5次，最后在温度为60℃～70℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠；

步骤二中所述的羧基化的免疫磁珠的粒径为150nm～200nm；

三、将羧基化的免疫磁珠加入到蒸馏水中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应20min～30min，再进行磁分离，弃除溶剂，得到反应物Ⅰ；使用蒸馏水清洗反应物Ⅰ3次～5次，得到活化的磁性微球；

步骤三中所述的羧基化的免疫磁珠的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；

步骤三中所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量与蒸馏水的体积比为(0.8mg～1.5mg):1mL；

步骤三中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的质量与蒸馏水的体积比为(0.5mg～1mg):1mL；

四、①、将活化的磁性微球加入到pH值为6.6的硼酸缓冲液中，再加入氨苄青霉素，再在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到反应物Ⅱ；②、向反应物Ⅱ中加入含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液中，继续在温度为36℃～37℃和转速为200r/min～300r/min的气浴摇床中反应50min～60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到灵敏探针；再使用pH值为6.6的硼酸缓冲液对灵敏探针清洗3次～5次，再加入重悬液，得到灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液；

步骤四①中所述的活化的磁性微球的质量与pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)；

步骤四①中所述的活化的磁性微球与氨苄青霉素的质量比为1:(2～5)；

步骤四②中所述的反应物Ⅱ的质量与含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液的体积比为1mg:(1mL～2mL)。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤四中所述的重悬液为硼酸盐缓冲液、蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮的混合液；所述的重悬液中蔗糖与硼酸盐缓冲液的质量比为5:100，海藻糖与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100，叠氮化钠与硼酸盐缓冲液的质量比为0.5:100，牛血清白蛋白与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100，聚乙烯吡咯烷酮与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100；所述的硼酸盐缓冲液的pH值为9，离子浓度为0.02mol/L。其它步骤与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式是利用灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的方法，具体是按以下步骤完成的：

一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条：

肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有肠炎沙门氏菌单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

所述的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的制备方法如下：

①、检测线的制备：

将肠炎沙门氏菌单克隆抗体溶于包被液中，得到肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液；用划线方式将肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿25mm～30mm的位置上，得到检测线，然后于36℃～37℃条件下干燥20min～30min，得到含有检测线的硝酸纤维素膜；

②、样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为13mm～18mm，宽为2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到样品垫；

③、结合垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为7mm～9mm，宽2mm～4mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为36℃～37℃下干燥10h～16h，得到结合垫；

④、吸水垫的制备：

将吸水纸剪裁成长为16mm～20mm，宽为2mm～4mm，得到吸水垫；

⑤、组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、含有检测线的硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，得到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；

二、取100μL待检测液体，向100μL待检测液体中加入5μL灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后在温度为35～37℃和转速为200r/min～300r/min的摇床中充分混合孵育20min～40min，再进行磁分离，弃去上清液，得到磁和待检测物质的复合物；向磁和待检测物质的复合物中加入100μL蒸馏水或100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行重悬，得到样品溶液；将样品溶液逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为检测试纸条，同时取100μL蒸馏水或100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，逐滴滴加到另一肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为对照试纸条，10min后读取结果；

检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌的浓度高于或等于80CFU/mL；(2)：阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌低于80CFU/mL。

本实施方式步骤一①中所述的肠炎沙门氏菌单克隆抗体是按Zhang Daohong等人在刊物《Analytical Chimica Acta》的第635卷第63-69页，题目为“Production ofultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using amodified two-step screening procedure”记载的方法制备的。

与现有技术相比，本实施方式的优点与积极效果在于：

一、本实施方式为了解决免疫层析检测低灵敏度的这个问题，制备了灵敏探针来富集待测物，代替了检测抗体，既降低了成本，又提高了分析系统的灵敏度，这对于监控肉蛋奶类食品中的肠炎沙门氏菌具有很重要的意义和应用价值；通过该构建，肠炎沙门氏菌能够通过T线上的捕获抗体有效捕获，其打破了传统同时采用测试抗体和捕获抗体的夹心试纸条的形式，只使用一种抗体，大大降低了成本并实现高度灵敏的检测。此外，这种简便的传感器大大简化了免疫测定相关分析试剂的早期制备过程，如：预加载探针的制备过程。该设备具有很高的灵敏度和很强的特异性，结构简单，成本效益高，不需要设备，快速的分析时间和便携性，具有极大的应用潜力来满足POC诊断测定的要求。该方法已成功应用于牛奶中沙门氏菌的检测，验证了其实用性和适用性。因此只需一种抗体，该方法就可以作为通用检测平台去检测所有病原菌；

二、本实施方式制备的羧基化的免疫磁珠作为灵敏信号载体，羧基化的免疫磁珠易于制备，很好的光学特性，不仅具有适当的尺寸(150-200nm)，良好的均匀性，分散性和稳定性，而且表面含有大量羧基官能团，以利于活化和修饰，所以赋予了它超高的纳米信号负载能力。与其他大尺寸材料比如纳米二氧化硅，单壁碳纳米管，石墨烯等相比，羧基化的免疫磁珠合成简单，稳定，分散，易于活化修饰，避免了复杂的化学合成，这可以简化生产并确保均匀性和批次之间的一致性；本实施方式选用的氨苄青霉素去捕获细菌，代替了抗体的作用，氨苄青霉素表面含有氨基，能与羧基化的免疫磁珠表面的羧基结合，既可以牢牢作用于细菌表面且能杀死菌，成本低，是一种很有前景的信号载体；

三、打破了传统的夹心检测方法：本实施方式只用一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法，大大节省了成本，解决了配对抗体的困难，因此，本发明更简单，方便和新颖；

四、灵敏探针：本实施方式首次在免疫层析试纸条检测中以氨苄青霉素和羧基化的免疫磁珠构建探针，替代了昂贵的检测抗体，这项工作为牛奶等实际样品检测肠炎沙门氏菌开发了便宜，灵敏，便携和快速读出的分析系统；

五、灵敏度高：本实施方式提供的试纸条对肠炎沙门氏菌的最低检测限为80CFU/mL，其值低于现有技术报道的检测值；

六、良好的实际应用：本实施方式可以检测牛奶中的肠炎沙门氏菌，且灵敏度与标准菌株浓度一样，可以达到80CFU/mL，具有很好的应用前景，可以作为通用检测方法检测所有的病原菌；

七、本实施方式自检测肠炎沙门氏菌的方法与传统的夹心检测方法相比，成本降低了40％～60％。

八、本实施方式只有一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法，大大节省了成本，解决了配对抗体的困难，更简单，方便，新颖。本发明适用于检测肠炎沙门氏菌。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤一①所述的包被液是按以下方法配置得到的：将0.02g～0.04g叠氮化钠、0.8g～1.0g氯化钠、0.29g～0.35g十二水磷酸氢二钠、0.02g～0.04g氯化钾和0.02g～0.04g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。其它步骤与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤一②中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将1.5g～2.5g牛血清白蛋白、0.02g～0.04g叠氮化钠、0.8g～1.0g氯化钠、0.29g～0.35g十二水磷酸氢二钠、0.02g～0.04g氯化钾和0.02g～0.04g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。其它步骤与具体实施方式一至八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：步骤一③中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将1.5g～2.5g牛血清白蛋白、0.02g～0.04g叠氮化钠、0.8g～1.0g氯化钠、0.29g～0.35g十二水磷酸氢二钠、0.02g～0.04g氯化钾和0.02g～0.04g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。其它步骤与具体实施方式一至九相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：一种灵敏探针的制备方法，具体是按以下步骤完成的：

一、将0.675g FeCl₃·6H₂O和0.245g二水合柠檬酸三钠加入到20mL乙二醇中，再在温度为37℃和转速为220r/min的气浴摇床中溶解40min，再加入1.2g醋酸钠，再在温度为37℃和转速为220r/min的气浴摇床中溶解40min，得到黄棕色乳状液；

二、将步骤一中得到的黄棕色乳状液转移至聚四氟乙稀内衬的反应釜中，再将聚四氟乙稀内衬的反应釜在温度为200℃的烘箱中放置10h，再自然冷却至室温，得到黑褐色产物；首先使用无水乙醇对黑褐色产物清洗5次，再使用超纯水对黑褐色产物清洗5次，最后在温度为60℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠；

步骤二中所述的羧基化的免疫磁珠的粒径为150nm～200nm；

三、将1mg羧基化的免疫磁珠加入到1mL蒸馏水中，再加入1mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.6mg N-羟基琥珀酰亚胺，再在温度为37℃和转速为220r/min的气浴摇床中反应30min，再进行磁分离，弃除溶剂，得到反应物Ⅰ；使用蒸馏水清洗反应物Ⅰ5次，得到活化的磁性微球；

四、①、将1mg活化的磁性微球加入到1mL pH值为6.6的硼酸缓冲液中，再加入2mg氨苄青霉素，再在温度为37℃和转速为220r/min的气浴摇床中反应60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到反应物Ⅱ；②、向1mg反应物Ⅱ中加入2mL含有1％牛血清白蛋白的pH值为6.6的硼酸缓冲液中，继续在温度为37℃和转速为220r/min的气浴摇床中反应60min，再进行磁分离，弃去上清液，得到灵敏探针；再使用pH值为6.6的硼酸缓冲液对灵敏探针清洗5次，再加入重悬液，得到灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液；

步骤四中所述的重悬液为硼酸盐缓冲液、蔗糖、海藻糖、叠氮化钠、牛血清白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮的混合液；所述的重悬液中蔗糖与硼酸盐缓冲液的质量比为5:100，海藻糖与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100，叠氮化钠与硼酸盐缓冲液的质量比为0.5:100，牛血清白蛋白与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100，聚乙烯吡咯烷酮与硼酸盐缓冲液的质量比为1:100；所述的硼酸盐缓冲液的pH值为9，离子浓度为0.02mol/L。

实施例二：利用实施例一制备的灵敏探针检测肠炎沙门氏菌的方法，具体是按以下步骤完成的：

一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条：

肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有肠炎沙门氏菌单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

所述的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的制备方法如下：

①、检测线的制备：

将肠炎沙门氏菌单克隆抗体溶于包被液中，得到肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液；用划线方式将肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿30mm的位置上，得到检测线，然后于37℃条件下干燥30min，得到含有检测线的硝酸纤维素膜；

步骤一①所述的包被液是按以下方法配置得到的：将0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

②、样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为15mm，宽为3mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为37℃下干燥13h，得到样品垫；

步骤一②中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将2g牛血清白蛋白、0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

③、结合垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为8mm，宽3mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为37℃下干燥13h，得到结合垫；

步骤一③中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将2g牛血清白蛋白、0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

④、吸水垫的制备：

将吸水纸剪裁成长为18mm，宽为3mm，得到吸水垫；

⑤、组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、含有检测线的硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，得到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；

二、取100μL待检测液体，向100μL待检测液体中加入5μL实施例一制备的灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后在温度为37℃和转速为220r/min的摇床中充分混合孵育30min，再进行磁分离，弃去上清液，得到磁和待检测物质的复合物；向磁和待检测物质的复合物中加入100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行重悬，得到样品溶液；将样品溶液逐滴滴加到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为检测试纸条，同时取100μL0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，逐滴滴加到另一肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为对照试纸条，10min后读取结果；

检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌的浓度高于或等于80CFU/mL；(2)：阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待检测液体中的肠炎沙门氏菌低于80CFU/mL。

实施例二步骤一①中所述的肠炎沙门氏菌单克隆抗体是按Zhang Daohong等人在刊物《Analytical Chimica Acta》的第635卷第63-69页，题目为“Production ofultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using amodified two-step screening procedure”记载的方法制备的。

图1为实施例一制备的灵敏探针的示意图，图1中1为羧基化的免疫磁珠，2为氨苄青霉素，3为灵敏探针，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；

图2为实施例二步骤一制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的结构示意图，图2中1为样品垫，2为结合垫，3为检测线，4为硝酸纤维素膜，5为吸水垫；

图3为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条检测原理图，图3中1为待检测液体，2为灵敏探针，3为加入磷酸盐缓冲液进行重悬，4为肠炎沙门氏菌单克隆抗体，5为反应10min；

实施例三：利用实施例一制备的灵敏探针测定实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的灵敏度具体是按以下步骤完成的：

一、微生物的培养：

将肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)接种于LB培养基，在37℃下静置培养24小时；挑取单菌落接种于250mL LB肉汤培养基中，再在150r/min摇床和37℃的条件下培养24小时，再将菌液以4000r/min的离心速度离心15min，收集菌体；用pH值为7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体3次，然后以10mL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液重悬，再加50μL 0.5％福尔马林溶液，室温下放置24小时灭活；灭活结束后，使用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后，再用0.01mol/L的PBS缓冲液调节成合适浓度，调整抗原浓度分别为10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、80CFU/mL、40CFU/mL和0CFU/mL，于-20℃保存备用；各浓度分别取100μL作为待检测液体；

二、取100μL各浓度的待检测液体，向100μL各浓度的待检测液体中分别加入5μL实施例一制备的灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后分别在温度为37℃和转速为220r/min的摇床中充分混合孵育30min，再分别进行磁分离，弃去上清液，得到不同浓度的磁和待检测物质的复合物；分别向不同浓度的磁和待检测物质的复合物中分别加入100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行重悬，得到不同浓度的样品溶液；将不同浓度的样品溶液分别逐滴滴加到9个肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为9个检测试纸条，同时取100μL 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，逐滴滴加到另一肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的样品垫上，将其作为对照试纸条，10min后读取结果；

检测结果如图4所示。

实施例三所述的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

图4为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的灵敏度；

从图4可知，随着待测液体中肠炎沙门氏菌的降低，肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条T线的黄色越来越浅，肉眼可见的浓度为80CFU/mL，因此，实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条可以检测到肠炎沙门氏菌最低浓度为80CFU/mL。本发明能高灵敏度检测肠炎沙门氏菌，且可作为通用方法只需一种抗体及简单的染色就可检测，快速便捷。

实施例四：利用实施例一制备的灵敏探针测定实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的特异性：

一、分别将肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、哈达尔沙门氏菌(Salmonella Hadar)、伦敦沙门氏菌(Salmonella London)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)、乙型沙门氏菌(Salmonella Paratyphi B)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、弯曲杆菌(Campylobacter coli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)和白色念珠菌(Candidaalbicans)的菌液用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液稀释成10⁷CFU/mL的浓度，各菌液分别取100μL溶液作为待检测测液，与5μL实施例一制备的灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液在37℃的摇床中充分混合孵育30分钟，再进行磁分离，弃去上清液，得到11个磁和待检测物质的复合物；向11个磁和待检测物质的复合物中分别加入100μL>

检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性；(2)阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果。

检测结果如图5所示；

实施例四所述的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、哈达尔沙门氏菌(Salmonella Hadar)、伦敦沙门氏菌(Salmonella London)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)、乙型沙门氏菌(Salmonella Paratyphi B)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、弯曲杆菌(Campylobacter coli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)和白色念珠菌(Candidaalbicans)均购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

图5为实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的特异性，图5中1为待检测液体为肠炎沙门氏菌菌液，2为待检测液体为鼠伤寒沙门氏菌菌液，3为待检测液体为伦敦沙门氏菌菌液，4为待检测液体为哈达尔沙门氏菌菌液，5为待检测液体为乙型沙门氏菌菌液，6为待检测液体为大肠杆菌菌液，7为待检测液体为金黄色葡萄球菌菌液，8为待检测液体为弯曲杆菌菌液，9为待检测液体为李斯特菌菌液，10为待检测液体为阪崎肠杆菌菌液，11为待检测液体为白色念珠菌菌液；

从图5可知，除了检测肠炎沙门氏菌菌液的试纸条T线有肉眼可见的明亮的黄色外，检测其他细菌的试纸条T线都没有颜色，说明实施例二制备的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条能高度特异性识别肠炎沙门氏菌，有特别高的特异性。

实施例五：利用实施例一制备的灵敏探针测定牛奶中肠炎沙门氏菌的浓度：

一、制备肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条：

肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的免疫层析试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有肠炎沙门氏菌单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理；

所述的肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的制备方法如下：

①、检测线的制备：

将肠炎沙门氏菌单克隆抗体溶于包被液中，得到肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液；用划线方式将肠炎沙门氏菌单克隆抗体浓度为1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿30mm的位置上，得到检测线，然后于37℃条件下干燥30min，得到含有检测线的硝酸纤维素膜；；

步骤一①所述的包被液是按以下方法配置得到的：将0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

②、样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为15mm，宽为3mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为37℃下干燥13h，得到样品垫；

步骤一②中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将2g牛血清白蛋白、0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

③、结合垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长为8mm，宽3mm，再放入封闭液中浸湿，取出后在温度为37℃下干燥13h，得到结合垫；

步骤一③中所述的封闭液是按以下方法配置得到的：将2g牛血清白蛋白、0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；

④、吸水垫的制备：

将吸水纸剪裁成长为18mm，宽为3mm，得到吸水垫；

⑤、组装：

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、含有检测线的硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，得到肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条；

二、将肠炎沙门氏菌菌液添加到脱脂牛奶中稀释成10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、80CFU/mL、40CFU/mL和0CFU/mL，分别100μL上述菌液作为待检测液体，分别向9个100μL待检测液体中加入5μL实施例一制备的灵敏探针浓度为1mg/mL的重悬液，然后在温度为37℃和转速为220r/min的摇床中充分混合孵育30min，再进行磁分离，弃去上清液，得到9个磁和待检测物质的复合物；向9个磁和待检测物质的复合物中分别加入100μL>

检测结果：(1)阳性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线显示出黄色线条时，判为阳性，表明待测液体中的肠炎沙门氏菌的浓度高于或等于80CFU/mL；(2)：阴性：当肠炎沙门氏菌的免疫层析试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待测液体中的肠炎沙门氏菌低于80CFU/mL。

检测结果如图6所示。

实施例五所述的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

图6为利用实施例一制备的灵敏探针测定牛奶中肠炎沙门氏菌的浓度结果；

从图6可知，随着待检测液体中肠炎沙门氏菌的浓度降低，试纸条上黄色越来越浅，有眼可见的浓度可达到80CFU/mL，因此，本实施例能检测牛奶中的肠炎沙门氏菌最低浓度到80CFU/mL，反映了其良好的实际应用价值。

为了验证羧基化的免疫磁珠和氨苄青霉素能很好的结合，做了以下试验；

图7为肠炎沙门氏菌的SEM图；

从图7可知，肠炎沙门氏菌为棒状，菌形完整，大约1μm～2μm；

图8为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的SEM图；

从图8可知，实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的为球状，大约150nm～200nm。

图9为实施例三步骤二中灵敏探针捕获10²CFU/mL待测液体中肠炎沙门氏菌的SEM图；

从图9可知，肠炎沙门氏菌表面附着了很多灵敏探针，且菌破碎，不完整，说明灵敏探针既可以捕获肠炎沙门氏菌，又可以杀死肠炎沙门氏菌。

图10为不同物质对肠炎沙门氏菌的抑菌圈，图10中AMP为氨苄青霉素，sterilewater为无菌水，MNPs为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠，AMP-MNPs为实施例一步骤四得到的灵敏探针；

从图10可知，无菌水和羧基化的免疫磁珠没有抑菌圈，说明它们不会对菌产生影响，氨苄青霉素有抑菌圈，可以杀死菌，而灵敏探针也有明显可见的抑菌圈，说明羧基化的免疫磁珠与氨苄青霉素灵敏探针已结合。

图11为饱和磁化强度曲线，图11中1为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的饱和磁化强度曲线，2为实施例一步骤四得到的灵敏探针的饱和磁化强度曲线；

从图11可知，羧基化的免疫磁珠的磁滞回线为典型的S型曲线，羧基化的免疫磁珠的磁感应强度随着外加磁场的增加而增加，并在2000(Oe)之后逐渐达到饱和，其饱和磁化强度为43.54emg/g。灵敏探针的饱和磁化强度有所降低，但是影响不是很大，灵敏探针的饱和磁化强度为39.41emg/g。

图12为红外光谱图，图12中1为氨苄青霉素的红外光谱曲线，2为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的红外光谱曲线，3为实施例一步骤四得到的灵敏探针的红外光谱曲线；

从图12可知，实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠在1633cm^-1和1388cm^-1处有明显的吸收，说明羧基化的免疫磁珠表面存在大量可伸缩振动的羧基。590cm^-1出的吸收峰是的Fe-O的伸缩振动，3436cm^-1是来自O-H的伸缩振动。而灵敏探针在1780处有明显的吸收，该吸收峰为氨苄青霉素β-内酰胺环的特征吸收峰，说明氨苄青霉素成功标记到了羧基化的免疫磁珠表面上。

图13为紫外吸收光谱图，图13中1为氨苄青霉素的紫外吸收光谱曲线，2为实施例一步骤二得到的羧基化的免疫磁珠的紫外吸收光谱曲线，3为实施例一步骤四得到的灵敏探针的紫外吸收光谱曲线。

从图13可知，羧基化的免疫磁珠在400nm处有个小峰，氨苄青霉素的特征峰在280nm，氨苄青霉素的特征吸收峰在灵敏探针的吸收峰上清晰可见，证明氨苄青霉素成功在羧基化的免疫磁珠上结合。