一株腐皮镰刀菌及其在防治铁皮石斛白绢病中的应用

摘要

本发明公开了一株腐皮镰刀菌及其在防治铁皮石斛白绢病中的应用，该菌株JSNL007‑2，经鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13687，保藏日期为2017年3月10日。本发明的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007‑2对铁皮石斛抗病作用效果显著，尤其是用于改善铁皮石斛抗白绢病的能力，对减少化学农药的使用有一定作用，是保证食用安全的重要手段。该菌株JSNL007‑2生产的微生物菌剂能使铁皮石斛抗白绢病能显著提高，并且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株腐皮镰刀菌及其在防治铁皮石斛白绢病中的应用。

背景技术

石斛属(Dendrobium)为兰科多年生草本植物，全球共计1500种以上。《中国药典》2010年版将收载的石斛分为两类，即石斛和铁皮石斛，后者铁皮石斛(D.officinaleKimuraet Migo)除有良好的药用功效外，还有非常好的滋补和养身效果。铁皮石斛叶面积小，光合强度低，对生长环境要求苛刻，多附生于大树干上和石壁、石缝间，因此生长十分缓慢。由于过量采挖和生态环境破坏，石斛现已被我国列为濒于灭绝的受保护的药材品种之一。目前，铁皮石斛的市场需求主要靠人工栽培，但人工种植铁皮石斛生长速度慢，平均产量低，病害发生较为严重，并且病害的防治仍然主要依靠农药。从保护生态环境和食品安全的角度出发，铁皮石斛作为名贵中药，应尽可能减少农药的使用量。合理利用菌物资源，提高铁皮石斛的抗病能力，在一定程度上减少化学农药的施用量，这也符合农业的可持续发展战略。因此，生防制剂相关研究已成为铁皮石斛产业的一个重要方向。

白绢病又称菌核性根腐病和菌核性苗枯病，危害苗木和幼树的根茎部。白绢病的菌核在基质和植株残体上越冬，春末至秋末均可发病。而以种植密度过大的床槽，高温到湿的雷阵天气更易发病，特别是在基质呈酸性(PH值3—5)的条件下，发病最为严重，该病害发病迅速，传播快，毁灭性大。目前防治铁皮石斛白绢病都是通过化学农药，容易伤害铁皮石斛。如何通过生物防治的方法，有效预防和控制白绢病已成为铁皮石斛产业当前的研究热点之一。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株铁皮石斛抗白绢病生防菌株JSNL007-2，用于改善铁皮石斛抗白绢病的能力。本发明的另一目的是提供该菌株生产的菌剂及其应用，该菌株制备的固体微生物菌剂可使铁皮石斛抗白绢病能力显著提高。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)，菌株名为JSNL007-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.13687，保藏日期为2017年3月10日。该菌株是2015年3月在江苏省句容市铁皮石斛栽植区内生长状况较好的植株上分离获得的。该菌株JSNL007-2主要生物学特性为：正面菌丝为灰白色，绒状，附于基物表面；反面白色至淡黄色，略有色素沉积。

本发明所述的菌株JSNL007-2在防治铁皮石斛白绢病中的应用。

本发明所述菌株JSNL007-2生产的微生物菌剂。

本发明所述的菌株JSNL007-2生产微生物菌剂的制备方法，通过以下步骤所制成：

(1)以棉籽壳菌渣为培养基质、硝酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源，制备成固体培养基，灭菌，接种腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2；

(2)在25-30℃，每天8h光照16h黑暗、pH为6.0-6.5条件下培养5～8天；

(3)将步骤(2)培养好的固体微生物菌剂切割成1-1.5cm³大小的块状物，备用。

其中，步骤(1)所述灭菌条件为121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌20-25分钟。

本发明所述的菌株JSNL007-2生产的微生物菌剂在提高铁皮石斛抗白绢病能力中的应用。

其中，所述应用的具体步骤为：将固体微生物菌剂接种于铁皮石斛幼苗栽培基质表面，每丛铁皮石斛幼苗的固体菌剂接种量为5-8g。

进一步地，所述固体微生物菌剂接种于铁皮石斛幼苗栽培基质表面后，基质相对含水量维持在60％以上6-10天。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明的腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2对铁皮石斛抗病作用效果显著，尤其是用于改善铁皮石斛抗白绢病的抗病能力，对减少化学农药的使用有一定作用，是保证食用安全的重要手段。

(2)腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2生产的微生物菌剂能使铁皮石斛抗白绢病能力显著提高，并且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明菌株JSNL007-2菌落照片；

图2为本发明菌株JSNL007-2菌根化铁皮石斛的抗白绢病能力分析图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

在江苏省句容市铁皮石斛栽植区内生长状况较好的植株上分离筛选到一株铁皮石斛抗白绢病菌株JSNL007-2，在PDA平板上培养，正面菌丝为灰白色，绒状，附于基物表面；反面白色至淡黄色，略有色素沉积，如图1所示。

扩增该菌株JSNL007-2的ITS区全序列并进行测序，PCR扩增得到的rDNA ITS序列全序列，如SEQ ID No 1所示，通过在genebank上进行比对发现，结果表明菌株JSNL007-2与腐皮镰刀菌(Fusarium solani)菌株的同源性最近，与菌株Fusarium solani LYF019和Fusarium solani CDR3P2F2同源性都达到99％，结合形态和生理生化特征，将菌株JSNL007-2初步鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，命名为腐皮镰刀菌JSNL007-2(Fusarium solani JSNL007-2)，属于半知菌亚门瘤座孢目镰孢属。将该菌株JSNL007-2送交位于中国北京，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC NO.13687，保藏日期为2017年3月10日。

实施例2

腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2生产的微生物菌剂：

(1)以棉籽壳菌渣为培养基质、硝酸铵为外源氮源、蔗糖为外源碳源，制备成固体培养基质装入高压灭菌袋内，于121℃和101.3千帕的高压条件下灭菌20-25分钟，待培养基质冷却后在无菌条件下接种菌根真菌JSNL007-2，然后进行人工培养；

(2)人工培养的具体培养条件在25-30℃，每天8h光照16h黑暗、pH为6.0-6.5条件下培养5～8天，

(3)将步骤(2)培养好的固体微生物菌剂切割成1-1.5cm³大小的块状物，备用。

实施例3

腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2生产的微生物菌剂对铁皮石斛白绢病的抗病能力作用效果分析。

(1)在PDA培养基上人工培养，获得白绢病病原的菌核；

(2)将实施例2培养好的固体微生物菌剂，以及步骤(1)培养好的白绢病病原的菌核，同时接种于铁皮石斛幼苗栽培基质表面，其中，每丛铁皮石斛幼苗的JSNL007-2固体菌剂接种量为5-8g，白绢病病原的菌核数量为10个；

(3)施用菌剂后，将步骤(2)供试铁皮石斛植株在同等条件下进行管理，基质相对含水量维持在60％以上至少6-10天，以确保菌丝在基质内成活；

温室内温度为28-30℃，湿度40％-50％，每种处理均为100株，并设3组重复；同时以只接种白绢病病原菌核，未接种腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2固体菌剂的植株为对照(CK)。

(4)接种后每天监控白绢病的发病程度，统计发病率、发病指数。

病株分级标准：病情分级主要根据接种后出现烂根数量，初定分级标准为：

0：正常；

Ⅰ：有少量烂根；

Ⅱ：烂根数量占根总数量1/4以下；

Ⅲ：烂根数量占根总数量1/4-1/2；

Ⅳ：烂根数量占根总数量1/2-3/4；

Ⅳ：烂根数量占根总数量3/4以上。

感病指数＝∑(各级病株数×该级代表数值)×100/(总株数×最高一级代表数值)；

感病率＝(感病株树/接种株树)×100％。

没有接种JSNL007-2菌剂的供试植株与接种JSNL007-2菌剂的植株感病率和感病指数，如图2所示。

由图2可知，在人工接种后的30天内，接种腐皮镰刀菌(Fusarium solani)JSNL007-2菌剂的铁皮石斛感病率和感病指数均明显低于未接种腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)JSNL007-2菌剂的铁皮石斛植株。

序列表

<110>江苏农林职业技术学院

<120>一株腐皮镰刀菌及其在防治铁皮石斛白绢病中的应用

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>502

<212>DNA

<213>腐皮镰刀菌(Fusarium solani)

<400>1

aagttacctg tcatacggca tggccgcgcc gctctccagt tgcgaggtgt tagctactac60

gcaatggaag ctgcggcggg accgccactg tatttgaggg acggcgtgtg cccacagggg 120

gcttccgccg atccccaacg ccaggcccgg gggcctgagg gttgtaatga cgctcgaaca 180

ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg 240

aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat gccagagcca 300

agagatccgt tgttgaaagt tttaatttat ttgcttgttt actcagaaaa acattataaa 360

aacagagtta ggggtcctct ggcgggggcg gcccgttgtt acagggccgt ctgttcccgc 420

cgaagcaacg ttttaggtat gttcacaggg ttgatgagtt gtataactcg gtaatgatcc 480

ctccgcaggt cacactacgg aa502