以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶及其制备方法

摘要

本发明属于高分子化学领域，具体涉及一种以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶及其制备方法。本发明采用氧化羟乙基纤维素和氨基化透明质酸为原料制备水凝胶，所制备的水凝胶自由水含量高，溶胀性能高，克服了极性基团易对机体产生刺激反应的缺陷，具有高吸水膨胀性、快速止血性和良好的生物相容性等特点，具体表现出较好的凝血性能、较快的凝胶时间以及很高的溶胀性能，本发明所述水凝胶最大溶胀性达到265％，最快凝胶时间达到5s,凝血指数BCI最低为0.034，在5分钟内就达到凝血完全。本发明所述制备方法操作简单，有利于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于高分子化学领域，具体涉及一种以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶是能在水中溶胀但不溶于水的高分子材料，通过分子间的交联，形成三维网状结构，其分子链上带有亲水性基团。一般认为水凝胶具有良好的生物相容性，原因在于水凝胶中含有大量的水分，这与充满水性液体的机体组织极为相似。随着现代科技的发展，水凝胶在药物控释，组织工程，再生器官等领域多有应用。静电纺丝是一种新兴的技术，其产品为纳米纤维网状结构，具有极高的孔隙率与表面积，能够最大程度的模拟细胞外环境，在组织工程领域具有广阔的应用前景。

透明质酸是由(β-l-4)D-葡萄糖醛酸和(β-l-3)N-乙酰基-D-氨基葡萄糖为二糖单位的以β-l,3和β-l,4糖苷链交替连接组成的一种线性粘多糖，广泛存在于人体皮肤、关节液、细胞外基质等中，在体内具有保持水分、促进细胞自我修复和软骨形成等作用。透明质酸可修饰位点多，可在简单温和条件下改性，在体内可被透明质酸酶降解为可被人体吸收的葡萄糖，使透明质酸及其改性产物在药物控制释放，以及软骨、血管、神经、皮肤等组织修复中具有良好应用前景。然而，透明质酸在体内吸收速度太快，在组织中易扩散、停留时间短、难以稳定存在，极大限制了透明质酸的实际应用，因此，需要对透明质酸进行功能化修饰改性，拓展其应用范围，最大限度地发挥其价值。目前有关透明质酸水凝胶的报道，主要是采用小分子交联剂通过化学交联形成的，普遍存在机械强度低、网络结构不均匀、降解速度可控性差等问题，尤其是小分子交联剂存在一定的细胞毒性。而采用一些氧化多糖作为交联剂又具有水凝胶稳定性差，pH敏感性高，交联剂粘度大不便操作且含有的极性基团易对机体产生刺激反应的缺陷。

发明内容

本发明针对现有技术不足，目的在于提供一种以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)氧化羟乙基纤维素的制备：称取羟乙基纤维素溶解在乙醇水溶液中，然后在避光条件下向溶液中加入高碘酸钠的水溶液，4℃搅拌避光反应6～24小时，再加入乙二醇，终止反应，最后经透析、冻干得到氧化羟乙基纤维素；

(2)氨基化透明质酸的制备：在透明质酸水溶液中加入己二酸二酰肼，再将溶液的pH值调节至6.0～7.0，在30℃下搅拌0.5～6h后，得到透明质酸混合溶液；将碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶于DMSO水溶液中，然后加入到透明质酸混合溶液中，反应1～24h，经透析、冷冻干燥后，得氨基化透明质酸；

(3)水凝胶的制备：在氨基化透明质酸水溶液中加入氧化羟乙基纤维素溶液，置于0～50℃条件下自交联反应得到水凝胶。

上述方案中，步骤(1)制备所得氧化羟乙基纤维素的相对分子量为88000Da～113000Da，氧化度为30％～70％。

上述方案中，步骤(1)中所述羟乙基纤维素和高碘酸钠的质量比为3～30：0.9～27。更为优选地，所述羟乙基纤维素和高碘酸钠的质量比为3:0.9～2.7。

上述方案中，步骤(1)所述乙醇水溶液的体积浓度为50％～60％；所述高碘酸钠水溶液的质量浓度为2％～10％。

上述方案中，步骤(2)制备所得氨基化透明质酸的取代度为70～80％。

上述方案中，步骤(2)中所述碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、己二酸二酰肼与透明质酸的的摩尔比为1～20：1～20：1～30：1。

上述方案中，步骤(2)中所述透明质酸水溶液的浓度为1～20g/L；所述DMSO水溶液的体积浓度为50％～60％。

上述方案中，步骤(3)所述氨基化透明质酸水溶液的溶剂是蒸馏水、生理盐水、注射用水、或林格氏液。

上述方案中，步骤(3)中所述氨基化透明质酸与氧化羟乙基纤维素的质量比为1：1～1：5。

上述方案中，步骤(3)中所述氨基化透明质酸水溶液的质量浓度为1％～10％；所述氧化羟乙基纤维素溶液的质量浓度为5％～30％。

上述制备方法制备所得以氧化羟乙基纤维素为交联剂的透明质酸衍生物自交联水凝胶。

上述以氧化羟乙基纤维素为交联剂的氨基化透明质酸自交联水凝胶材料在制备伤口敷料药物中的应用。

上述以氧化羟乙基纤维素为交联剂的氨基化透明质酸自交联水凝胶材料在制备止血药物中的应用。

本发明采用氧化羟乙基纤维素和氨基化透明质酸为原料制备水凝胶，氧化羟乙基纤维素采用混合溶剂在低温的条件下制备，制备所得氧化羟乙基纤维素的分子量相比羟乙基纤维素无明显下降，且不影响羟乙基纤维素不与正、负离子作用的非离子型特征；氨基化透明质酸通过对反应温度、反应pH、反应时间和反应物比例的调整使其取代度为70～80％，产率达到85.6％。本发明选用氧化改性后的羟乙基纤维素作为交联剂和氨基化透明质酸为原料，使所制备水凝胶自由水含量高，溶胀性能高，克服了极性基团易对机体产生刺激反应的缺陷，具有高吸水膨胀性，快速止血性、凝血性能，较快的凝胶时间等特点。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述制备方法具有合成工艺简单、操作性强的优点；所选用的原料氧化羟乙基纤维素保持了较高分子量，具有不与正/负离子作用、相容性好的非离子型特征，原料氨基化透明质酸为生物相容性较好的高分子，对环境和人体无害；本发明制备所得水凝胶性能稳定，生物相容性好，受外界环境影响较小，有利于环境的可持续发展；

(2)本发明所述氧化羟乙基纤维素是采用混合溶剂在低温的条件下制备得到，该制备方法使氧化羟乙基纤维素的分子量与羟乙基纤维素相比变化不大，保持了较高分子量；所述氨基化透明质酸的制备过程中，通过对反应温度、反应pH、反应时间和反应物比例的调整使其取代度控制在70～80％，产率达到85.6％；

(3)本发明以氧化羟乙基纤维素为交联剂与氨基化透明质酸形成的水凝胶，所述水凝胶结构更稳定，自由水含量高，溶胀性能高，克服了极性基团易对机体产生刺激反应的缺陷，具有高吸水膨胀性和快速止血性等特点，所述水凝胶表现出较好的凝血性能、较快的凝胶时间以及很高的溶胀性能，本发明中所述水凝胶最大溶胀性达到265％，最快凝胶时间达到5s,凝血指数BCI最低为0.034，在5分钟内就达到凝血完全。

附图说明

图1为实施例1、5制备的氧化羟乙基纤维素、水凝胶和羟乙基纤维素对比的红外光谱图。

图2为制备的氨基化透明质酸的核磁共振图。

图3为制备的水凝胶的断面的扫描电子显微镜图片。

图4为不同水凝胶的溶胀性能图。

图5为不同水凝胶的凝血性能图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

以下实施例中，羟乙基纤维素的氧化度由硫代硫酸钠滴定的方法来测定。在反应结束，加入终止剂之前，取5mL反应混合液，加入10mL碳酸氢钠饱和溶液进行中和，接着，加入2mL 20％(w/v)的碘化钾溶液混合均匀，将混合液在黑暗中放置15min，使碘释放出来。释放出的碘以硫代硫酸钠标准溶液滴定，并以淀粉溶液作为指示剂。因为高碘酸钠和糖醛酸单元是等物质的量反应，即1分子的高碘酸钠与1分子的糖醛酸反应，因而可以通过测定高碘酸钠的消耗量，间接计算出氧化羟乙基纤维素(OHEC)的氧化度。

式中m是羟乙基纤维素钠的质量，242是羟乙基纤维素单元的分子量(g/mol)，n是溶液中高碘酸钠的量。

实施例1

氧化羟乙基纤维素的制备:3g羟乙基纤维素溶于300mL蒸馏水：乙醇＝1:1(v/v)的混合溶剂中，将2.7g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，于4℃避光反应24h，加入5mL乙二醇搅拌60min终止反应，纯化得到氧化羟乙基纤维素。经测定，氧化羟乙基纤维素的氧化度68.5％，相对分子质量为11.3万，与羟乙基纤维素相比基本不变，远高于常规氧化体系的3.9万。该氧化羟乙基纤维素经红外表征的红外图谱见图1，与羟乙基纤维素相比，氧化羟乙基纤维素在波长1734.8处出现新的吸收峰，归属于-CHO的伸缩振动吸收峰，证明氧化反应的发生。

实施例2

氧化羟乙基纤维素的制备:3g羟乙基纤维素溶于300mL蒸馏水：乙醇＝1:1(v/v)的混合溶剂中，将1.8g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，于4℃避光反应24h，加入5mL乙二醇搅拌60min终止反应，纯化得到氧化羟乙基纤维素。经测定，氧化羟乙基纤维素的氧化度48.7％，相对分子质量为13.4万，与羟乙基纤维素相比基本不变，远高于常规氧化体系的7万。

实施例3

氧化羟乙基纤维素的制备:3g羟乙基纤维素溶于300mL蒸馏水：乙醇＝1:1(v/v)的混合溶剂中，将0.9g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，于4℃避光反应24h，加入5mL乙二醇搅拌60min终止反应，纯化得到氧化羟乙基纤维素。经测定，氧化羟乙基纤维素的氧化度30％，相对分子质量为15.7万，与羟乙基纤维素相比基本不变，远高于常规氧化体系的8.2万。

实施例4

氨基化透明质酸的制备:将1g透明质酸溶于100ml蒸馏水配制成1％的透明质酸水溶液，接着加入己二酸二酰肼(ADH)，其用量为透明质酸重复单元摩尔数的30倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至6.8；将1.56g碳二亚胺盐酸盐和1.54g1-羟基苯并三唑溶于DMSO：H2O＝1:1的20ml的溶液中，然后将溶液逐滴加入到透明质酸溶液中，在室温下搅拌反应24小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析3天(透析袋截留分子量为3500Da，以下同)，经冷冻干燥得到氨基化透明质酸。氨基化透明质酸的核磁表征的核磁共振图见图1，通过ADH的亚甲基峰在δ＝1.7和2.4ppm处，说明在透明质酸上成功引入了ADH。通过ADH的亚甲基质子和透明质酸的羧基上质子所产生的NMR信号进行数字积分得到其取代度为70～80％，产率达到85.6％。

实施例5

水凝胶的制备:氨基化透明质酸溶于蒸馏水配制成质量分数为2％的水溶液，实例1中的氧化羟乙基纤维素溶于蒸馏水配制成质量分数为10％的水溶液；量取4mL的氨基化透明质酸水溶液置于烧杯中，然后加入2mL的氧化羟乙基纤维素溶液，经充分搅拌后静置得到水凝胶。其凝胶时间为14s，溶胀度为265％，将制备好的水凝胶放入干燥箱中干燥备用。

水凝胶的红外表征的红外光谱图见图1。水凝胶的红外光谱图在波长1624.6处出现的吸收峰，归属于-N＝C-伸缩振动，它的出现证明氨基化透明质酸上的氨基与氧化羟乙基纤维素上的醛基发生了席夫碱反应。水凝胶的断面扫描电子显微镜图片见图3，从图3可以看出：水凝胶样品具有平整而光滑的骨架结构，并有大量的微孔遍布其中，从而在水凝胶内部形成了牢固连续且均匀分布的三维网络结构。氧化羟乙基纤维素/氨基化透明质酸水凝胶稳定而柔韧的多孔结构，可以吸收和保有大量的水分和体液，可以作为止血剂，良好的空间结构和吸液性能快速吸收血液中的水分，并通过毛细作用吸附和聚集血小板，同时利用其内部多孔结构阻断血液起到网架作用，引起血小板凝集和释放多种凝血因子，达到快速止血。还可以与伤口良好地贴合，吸收伤口的渗出液防止伤口感染，并封存一定的水分，避免伤口结痂，为伤口愈合提供一个良好的润湿的环境。

实施例6

水凝胶的制备:氨基化透明质酸溶于蒸馏水配制成质量分数为4％的水溶液，实例2中氧化羟乙基纤维素溶于蒸馏水配制成质量分数为10％的水溶液；量取4mL的氨基化透明质酸置于烧杯中，然后加入2mL的氧化羟乙基纤维素溶液，经充分搅拌后静置得到水凝胶。其凝胶时间为8s，溶胀度为198％，将制备好的水凝胶放入干燥箱中干燥备用。

实施例7

水凝胶的制备:氨基化透明质酸溶于蒸馏水配制成质量分数为4％的水溶液，实例3中氧化羟乙基纤维素溶于蒸馏水配制成质量分数为20％的水溶液；量取4mL的氨基化透明质酸置于烧杯中，然后加入2mL的氧化羟乙基纤维素溶液，经充分搅拌后静置得到水凝胶。其凝胶时间为5s,溶胀度为147％，将制备好的水凝胶放入干燥箱中干燥备用。

实施例8

称取一定质量的具有相似形状的冷冻干燥的水凝胶样品，在室温下将其浸泡于pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，一段时间后水凝胶可达到溶胀平衡，取出水凝胶样品滤掉部分水分，并用滤纸片将水凝胶样品表面残留的水分完全吸收移除，然后对溶胀后的水凝胶进行称重，每组实验重复三次。按以下公式计算出水凝胶的溶胀率，其中，SR(％)为水凝胶的溶胀率，m_t为水凝胶溶胀后的重量，m₀为水凝胶初始重量。

室温下，不同氧化羟乙基纤维素加入量所制备的水凝胶在PBS(PH＝7.4)溶液中的溶胀率测试结果如图4所示。其中取10mL氨基化透明质酸溶液，按实验设计量加入氧化羟乙基纤维素水溶液(分别为2,4,6,8,10mL)，将水凝胶分别标记为OKCP-2，OKCP-4，OKCP-6，OKCP-8，OKCP-10。由图4可以看出，溶胀率最高可以达到265％。

实施例9

利用实施例5制备所得水凝胶进行止血性能研究的方法，包括如下步骤：称取质量为25mg的水凝胶样品粉末放入试管底部，然后将全部试管放入37℃的恒温水浴槽中，温热5min。取0.1mL新鲜抗凝全血缓慢滴入试管中，使血液充分浸润凝胶粉末，并立即滴加入12.5uL 0.2mol/L CaCl₂溶液，轻摇混匀后继续放入37℃下的恒温水浴槽中保温，并开始计时，分别间隔3min，5min，10min，15min，20min后取出一组试管并沿管壁缓慢加入10mL的去离子水。将上层清液在1000rpm/min的转速下离心5min，用紫外分光光度仪测量上清液在545nm波长处的吸光度值A，每组凝胶样品平行重复三次，取其平均值。取0.1mL新鲜抗凝全血于试管中，并加入10mL去离子水，离心取上清液，测量其在同波长下的吸光度值A0，作参考值。以下式计算水凝胶的凝血指数BCI：

BCI＝A/A₀>

经测定，水凝胶的凝血指数BCI如图5所示，水凝胶显示出了优良的凝血性能，其BCI为0.034，在5min时达到了最低的BCI值，达到完全凝血。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。