用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用

摘要

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用；本发明将鱼源无乳链球菌recA基因的启动子通过overlap PCR的方法融合至mcherry基因的上游，然后将此融合片段连接至pBCH载体上，即为pBCH‑RM质粒。通过将pBCH‑RM质粒应用到鱼源无乳链球菌菌株上，使其能够高效且稳定表达红色荧光蛋白，而且其保留了亲本菌株的强毒性生物学特征，能够应用于无乳链球菌的传播途径、荧光示踪和病原与宿主相互作用等基础研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物监测技术领域，特别涉及一种用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)作为淡水优良养殖品种之一，在我国南方如广东、广西和海南等地区已大规模人工养殖，据农业部渔业局统计数据表明，2015年我国罗非鱼养殖产量约178万t(2016年中国渔业统计年鉴)，总产量居全球第一位。然而，近年来链球菌病严重制约了我国罗非鱼产业的健康可持续发展。自2009年起，我国多个地区的养殖罗非鱼连年暴发链球菌病，其累积死亡率为30％～80％，而且90％以上的临床菌株是无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。无乳链球菌是鱼类重要的病原菌，可感染多种经济鱼类，如银鲳(Pampus argenteus)、金鲳(Trachinotus blochii)、金头鲷(Sparus auratus)、胭脂鱼(Liza klunzingeri)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)、鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和宝石鲈(Scortum barcoo)等，其中对罗非鱼的危害尤为严重。迄今，世界多个国家和地区养殖的罗非鱼均有感染无乳链球菌的相关报道，如中国、泰国、印度尼西亚、美国、巴西、洪都拉斯、哥伦比亚、哥斯达黎加和厄瓜多尔等。由于我国罗非鱼养殖产量大，因此，链球菌病的危害也最为严重。我国南方地区罗非鱼主养区每年均有大规模的链球菌病暴发，造成的经济损失高达数亿元。

红色荧光蛋白标记的鱼源无乳链球菌，对于无乳链球菌毒力相关基因、浸染过程、致病机制和病原菌与宿主相互作用等研究奠定了基础。然而，目前，国内外尚无鱼源无乳链球菌红色荧光蛋白标记菌株的相关报道，并且也没有可参考的高效表达红色荧光蛋白标记的鱼源无乳链球菌的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的之一在于提供了能够在无乳链球菌中高效表达荧光蛋白的强启动子PrecA以及用于表达荧光蛋白的无乳链球菌的质粒。本发明的目的之二在于提供了用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法。本发明的目的之三在于提供了用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的应用。

本发明采用如下技术方案实现上述技术问题：

用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒，所述载体为pBCH-RM质粒，所述pBCH-RM质粒的序列号为SEQ ID No.1。

所述用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒的构建方法具体步骤为：

(1)启动子PrecA的制备：

以鱼源无乳链球菌基因组为模板，引物为PrecA-F和PrecA-R，PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得启动子PrecA片段；启动子PrecA片段，序列号为SEQ ID No.2。其中，

PrecA-F：

CAGGCTAGCGGTATCGGTTTAACGGGAGTTGCTG

PrecA-R：

TCGCTCACCTAAGCGCATCACTG；

启动子PrecA制备的反应体系为：5×buffer 10μL，dNTPs 4μL，引物PrecA-F1μL，引物PrecA-R 1μL，DNA模板1μL，ExTaq酶1μL，补H₂O至50μL。

(2)制备红色荧光蛋白基因mcherry片段：

以pmCherry-C1质粒(TAKARA)为模板，引物：Pmche-F和Pmche-R；PCR扩增后通过凝胶电泳，回收目的片段即得红色荧光蛋白基因mcherry片段；红色荧光蛋白基因mcherry片段，序列号为SEQ ID No.3。其中，

Pmche-F：

AGTGATGCGCTTAGGTGAGCGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATPmche-R：

GAAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATG；

(3)启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry连接

将步骤(1)中回收的启动子PrecA与步骤(2)中回收的红色荧光蛋白基因mcherry片段按照1：1进行混合作为模板；通过引物PrecA和Pmche-R进行overlap PCR，得到PrecA-mcherry的PCR产物；启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry连接的的overlap PCR反应体系为：5×buffer 10μL，dNTPs 4μL，引物PrecA-F 1μL，引物Pmche-R 1μL，PrecA模板1μL，mcherry模板1μL，ExTaq酶1μL，补H₂O至50μL。

(4)PCR产物的酶切、连接、转化和鉴定：

将步骤(3)中纯化的PCR产物(PrecA-mcherry)与pBCH载体分别进行NheI和BglII双酶切，分别回收酶切产物；回收后的酶切产物通过T4DNA连接酶进行连接。(PrecA-mcherry)与pBCH载体进行连接的反应体系：10×buffer 2μL，启动子PrecA5μL，红色荧光蛋白基因mcherry 5μL，T4连接酶0.5μL，补H₂O至20μL。然后使用胶回收试剂盒纯化连接产物，转化无乳链球菌感受态细胞，涂布四环素(tet)抗性平板，28℃培养2天，筛选有红色荧光的菌落。根据PCR扩增及其产物测序、菌落荧光对阳性菌落进行鉴定，得到PrecA-mcherry>

所述的用于表达荧光蛋白的无乳链球菌的质粒应用，将所述载体应用于鱼源中表达荧光蛋白无乳链球菌，特别是罗非鱼和斑马鱼。

制备鱼源无乳链球菌感受态细胞：挑取无乳链球菌单克隆至1mL无菌BHI液体培养基中，28℃培养过夜，然后加入100mL无菌BHI液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝0.6；离心收集菌体，去除上清液，加入20mL>

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)红色荧光蛋白(Mcherry fluorescent protein)能够自身催化形成发色结构并在激发光作用下发出红色荧光。作为报告基因，mcherry是不需要外源底物或辅助因子，就能在活细胞中表达的发光蛋白，mcherry作为荧光标记分子既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，因此可实现在体内实时检测标记菌株的情况，在菌体示踪研究方面具有不可替代的作用。本发明通过巧妙的引物设计以及合理的选择强启动子，实现了重组质粒pBCH-RM质粒的制备。

(2)本发明通过将构建的重组质粒pBCH-RM转入到鱼源无乳链球菌感受态细胞中，建立了红色荧光标记的鱼源无乳链球菌强毒株，便于通过荧光显微镜观察无乳链球菌侵染宿主的实时动态过程，该方法简单、直观、实时、可靠，为研究无乳链球菌与宿主的相互作用关系奠定了基础，不仅能够显著的节约实验周期，还能够极大地降低实验成本。

(3)本发明使用的无乳链球菌菌株是在患病罗非鱼体内分离出来的，对罗非鱼和斑马鱼均具有强致病性。该荧光菌株的成功构建有助于研究无乳链球菌在不同水生动物之间的水平传播途径，分析无乳链球菌在宿主体内的动态变化过程以及致病机理，还可用于无乳链球菌在宿主体表和肠道入侵途径与过程等方面的研究。同时以模式动物斑马鱼作为实验动物，可进行该荧光菌株的感染实验研究，为无乳链球菌感染宿主的致病机理奠定了基础。

附图说明

图1本发明实施例中pBCH-RM质粒图谱。

图2本发明实施例中显微镜下观察的荧光菌株。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案进行详细描述；显然，所描述的实施例是本发明的一部分，而不是全部。本实施方式中的罗非鱼源无乳链球菌强毒株WC1535菌株和pBCH载体均由中国水产科学研究院珠江水产研究所使用并保存。

重组质粒pBCH-RM的构建方法：

(1)启动子的制备：

以无乳链球菌WC1535菌株的基因组DNA为模板，以PrecA-F和PrecA-R作为上、下游引物，按照常规方法进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶回收试剂盒进行胶回收目的片段，经过测序验证，即可获得启动子PrecA片段，序列号详见SEQ ID No.2所示。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2；

表1PCR扩增体系

表2PCR扩增程序

(2)制备mcherry片段：

以红色荧光蛋白基因mcherry质粒为模板，以Pmche-F和Pmche-R作为上、下游引物，按照常规方法进行PCR反应，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶回收试剂盒进行胶回收目的片段，经过测序验证，即可获得启动子PrecA片段，序列号详见SEQ ID No.3所示。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2；

(3)启动子PrecA与mcherry连接

在引物设计时，引物Pmche-F的上游22个碱基与PrecA-R引物的部分序列反向互补，因此，这样设计有助于启动子PrecA与红色荧光蛋白基因mcherry通过overlap PCR反应进行连接。以胶回收产物PrecA和mcherry片段进行1：1混合后作为模板，通过引物PrecA和Pmche-R进行overlap PCR。连接物序列号详见SEQ ID No.4所示。PCR反应体系同表1，PCR反应条件见表3。

表3PCR扩增程序

(4)PCR产物的连接、纯化、转化与鉴定

将步骤(3)纯化的PCR产物与pBCH载体进行分别进行NheI和BglII双酶切，并分别回收酶切产物。将酶切产物进行16℃连接过夜。连接体系见表4。通过胶回收试剂盒对连接产物进行回收，并使用双蒸水洗脱连接产物。回收的连接产物加入无乳链球菌感受态细胞中，轻轻混匀后加入预冷的电击杯中，静置15min后进行电转(参数：2300V，200Ω，25μF)。立即加入无菌的BHI(脑心浸液培养基)1mL，悬浮菌体，转入至无菌的EP管中，28℃摇床培养3h(180r/min)。收集菌体，涂布于含有四环素抗性的BHI平板，28℃静置培养观察菌落，有红色荧光的菌落即为阳性，经过PCR验证并进行测序鉴定。通过上述方法构建得到的重组质粒pBCH-RM，其序列为SEQ ID No.1所示，其图谱如图1所示。

表4连接体系

(5)荧光菌株观察

构建好的荧光菌株用无菌水稀释后涂到载玻片上，使用荧光显微镜，在40×10的放大倍数下观察，能够观察到高效表达红色荧光蛋白的菌体，如图2所示。稳定性试验表明，红色荧光菌株传至30代，其红色荧光仍能够稳定高效表达，而且质粒稳定率可达100％。红色荧光无乳链球菌人工腹腔注射感染健康罗非鱼，其半数致死剂量为LD₅₀＝6.2×10⁷CFU/mL，该荧光菌株与野生株相比，它们对罗非鱼的半数致死剂量无显著性差异(P>0.5)。而且，从感染后的罗非鱼体内可以观察到并且能够分离到红色荧光无乳链球菌。

序列表

申请人：中国水产科学研究院珠江水产研究所

发明名称：用于表达荧光蛋白的无乳链球菌质粒及其构建方法和应用

SEQ ID No. 1 pBCH-RM质粒的序列：

1 GATCCGAATT CGGATCTAAA GAGTAATTTA ATAGAGTGAG GTGAATTTTG GAATTTATAA

61 GATTTGCCTT ACTCATTTTT TGTTGTGAGC TTGACAATTC TCCACTTTTA TGGTATAATA

121 AGCTTAAGGA GGTAGGCTAG CGGTATCGGT TTAACGGGAG TTGCTGGTCC TGATGAGTTG

181 GAAGGATACC CTGCAGGTAC AGTTTTTATT GGGATTGCAA CCCCTGAAGG CGTTTCTTCT

241 ATTAAAGTAT CGATTGGAGG GAAGAGCCGC TCAGATGTCC GTCATATCAG TACTTTACAT

301 GCTTTTGACC TGGTGCGTAG GGCTTTATTA AAGATATAAT ATTTGTTATA ATTAGTAGAA

361 CGATTTCTAA ATTTGAATCA ACCTAGATTC ATAGAAATAT AAGGAGAAGA CATTGGCTAA

421 AAAAACGAAA AAAGCAGAAG AAATTACTAA GAAATTCGGT GATGAACGTC GAAAAGCCTT

481 AGATGATGCT TTGAAAAATA TTGAAAAAGA TTTTGGTAAG GGCGCAGTGA TGCGCTTAGG

541 TGAGCGAATG GTGAGCAAGG GCGAGGAGGA TAACATGGCC ATCATCAAGG AGTTCATGCG

601 CTTCAAGGTG CACATGGAGG GCTCCGTGAA CGGCCACGAG TTCGAGATCG AGGGCGAGGG

661 CGAGGGCCGC CCCTACGAGG GCACCCAGAC CGCCAAGCTG AAGGTGACCA AGGGTGGCCC

721 CCTGCCCTTC GCCTGGGACA TCCTGTCCCC TCAGTTCATG TACGGCTCCA AGGCCTACGT

781 GAAGCACCCC GCCGACATCC CCGACTACTT GAAGCTGTCC TTCCCCGAGG GCTTCAAGTG

841 GGAGCGCGTG ATGAACTTCG AGGACGGCGG CGTGGTGACC GTGACCCAGG ACTCCTCCCT

901 GCAGGACGGC GAGTTCATCT ACAAGGTGAA GCTGCGCGGC ACCAACTTCC CCTCCGACGG

961 CCCCGTAATG CAGAAGAAGA CCATGGGCTG GGAGGCCTCC TCCGAGCGGA TGTACCCCGA

1021 GGACGGCGCC CTGAAGGGCG AGATCAAGCA GAGGCTGAAG CTGAAGGACG GCGGCCACTA

1081 CGACGCTGAG GTCAAGACCA CCTACAAGGC CAAGAAGCCC GTGCAGCTGC CCGGCGCCTA

1141 CAACGTCAAC ATCAAGTTGG ACATCACCTC CCACAACGAG GACTACACCA TCGTGGAACA

1201 GTACGAACGC GCCGAGGGCC GCCACTCCAC CGGCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAGAG

1261 ATCTAGATCT CAGGAATTGT CAGATAGGCC TAATGACTGG CTTTTATAAT ATGAGATAAT

1321 GCCGACTGTA CTTTTTACAG TCGGTTTTCT AATGTCACTA ACCTGCCCCG TTAGTTGAAG

1381 AAGGTTTTTA TATTACAGCT CCAGATCCTC TAGAGTCGAC CTCTGAGAGG GCCTCAGAGC

1441 TATCTAAAGC CGAGGGATAT ATAAATACCC TAGAAAATCA TTCGAAGAGC TTAGAAGCGA

1501 AAATAGAGTG TTTAGAGAGT GATAATCTAC AATTGGAAAA ACAAAAGGCG ACAAAACTCG

1561 AAGCGAAAGC GTTGAACGAG AGTGAGTTGC GAGAACTAAA GCCTAAGAAG AATTTTCTAG

1621 GAAAAGAGCA TTATGAGTTA AGTCCTGAAC AATTTGAAGG GTTGAAGGCA GAAGTTTATC

1681 GTAGTAGAAC TCTATTGCAC CACAAAGATA TTGAACTGGA GCAAGCAAAA CGTCAAGTAT

1741 CTCTGAGAGC CTCTAAAAAC TATTTTACAG CTAGTTTAGA GCGAGCTAAG GAAAAAGCTA

1801 AAGGTGAGAG TATAGACCGT CTTAAAAGCG AAATAAAGCG ACTAAAAAAC GAAAATTCAA

1861 TTTTACGTCA GCAAAATGAC AAGATGCTAG GGAAATTAAG AGAGTTAATG CCTGATAAAG

1921 CCTTTAAGAA TTTGTTATCA GAACTTAAGG CGATTAAGCC AATCGTGAAT ATAATTAAAA

1981 AGGCTATTGA AAAGAGCTTG TTCTGAGCGA TTTATGCCGT GAAAGCTATT TGACAATAAG

2041 CAGTGACAGA GTACGCTAGG ACGTGCCGAG CCGAAAGGCT TTAGCGTTTC GGACGGACAC

2101 GGACAAAGGA CGGCAGTCAC TGGTTACTTG TTGTCAAATA GACCATGCAT GGAATAAAAA

2161 GCGTCAAAAG TCTTGAGTGG ATGATACCCT ATGGTACTCT ATTCGCCTTT TGACTTTTTT

2221 GCTATAATTT AAGTGTCGCC AGTTCTTCCG TCAGGTAATG CGAACTTAGA CTGGAGGTGA

2281 GCGTTGTGAA GACATTCCTC GAGCTTGTCT TTGTCCCTTT TGTGGTTGGC GTTGCTGCAG

2341 AAGTAGTCGC TGATTGGCTA ATTCAGCGTA TCAAAGACAA AGGCGACCAA AAATAGCTTG

2401 AGTTCTTTTA GAACAAAAAA GAAAGACAGT AGTTGCACCT ACTGTCTTTC TTTTGCGTTG

2461 TGCTTTTAGT TCCTCGAACT TTTAGCGTCA AGCATATTAT ATCATGGGGC GAGAAATTCT

2521 GTCAAAATAA TGCTATAATG CTTTTGAGGC ACCTCAGCGA TACGGTCGGT GGTGTGAATC

2581 TCATTTACGT AGGGCGACTG GAAACGGATA GCTCAAAGGG CGCGTTTGAG TGTCGGGTGT

2641 GGGACTGCCT TCAGCTTCGG GCTGTAAAGA CCCCTGATAC TTTTGAATGA GATGACCCTT

2701 TGGGGTCTTT TTTGTTTTTT TAGGGAGATG TTGTGGGGGA TTTTTTCTCC GAAAAAATCT

2761 AAAATATGGG GGGGCTACTA CGACCCCCCC TATAGTGCCG AGTGCCAAAA TCAAAAAAAA

2821 AACGCCTTTA GCCTTAGAGC TGCAAGGGTT TGAGGCTCGT CAAATCTCGG CGACTTTTCG

2881 GCGACTTTTC GGCGACTTTT TAGAGATTTT TTGGGAAAAA TACGAAAAAG ATTGCATTGA

2941 GTGCACGGTT ATGCTACTAT AGTTTTATAA AATTTTGAGA GGTGACGCAT GAAAAAAAGA

3001 TTGACGATAA CATTAAGTGA ATCGGTACTT GAAAATCTTG AAAAAATGGC AAGAGAGATG

3061 GGGTTATCAA AATCTGCAAT GATTTCTGTT GCCTTGGAAA ATTACAAGAA AGGTCAAGAA

3121 AAATAAAAAA AGCCGTGCTG GCAGGCACTG GCTAAAGTCA AACATTTCTT GGGTATATTA

3181 TACTTTATGG CTAAAGAAAA AGCAAGATAC TTCACTTTTT TACTTTATCC TGAATCAATT

3241 CCAAGCGACT GGGAGCTGAA ACTTGAAACG CTTGGAGTGC CGATGGCAAT TAGTCCATTG

3301 CATGATAAGG ATAAGAGTAG TATCAAAGGA CAAAAATATA AGAAAGCTCA TTATCATGTG

3361 CTTTATATAG CTAAAAATCC AGTTACTGCA GATAGTGTAC GTAAAAAGAT TAAATTATTG

3421 CTTGGTGAAA AAAGTCTTGC AATGGTGCAG GTTGTTCTCA ATGTCGAAAA TATGTATTTG

3481 TATTTAACGC ACGAGAGCAA GGACGCTATT GCTAAGAAGA AACATGTTTA TGATAAGGCT

3541 GATATAAAGC TAATCAATAA TTTTGATATT GACCGTTATG TGACGTTAGA TGTCGAGGAA

3601 AAGACCGAAC TTTTCAATGT GGTTGTATCG CTTATTCGTG CGTACACTCT CCAAAATATT

3661 TTTGATTTGT ATGATTTCAT TGACGAAAAT GGAGAAACTT ATGGGTTGAC TATAAATTTG

3721 GTTAACGAAG TTATTGCAGG GAAAACTGGT TTTATGAAAT TGTTGTTTGA CGGAGCTTAT

3781 CAACGTAGTA AGCGTGGAAC AAAGAACGAA GAGAGATAAA AAGTTGATCT TTGTGAAAAC

3841 TACAGAAAGT AAAGAATGAA AAGAGTAATG CTAACATAGC ATTACGGATT TTATGACCGA

3901 TGATGAAGAA AAGAATTTGA AACTTAGTTT ATATGTGGTA AAATGTTTTA ATCAAGTTTA

3961 GGAGGAATTA ATTATGAAGT GTAATTAATG TAACAGGGTT CAATTAAAAG AGGGAAGCGT

4021 ATCATTAACC CTATAAACTA CGTCTGCCCT CATTATTGGA GGGTGAAATG TGAATACATC

4081 CTATTCACAA TCGAATTTAC GACACAACCA AATTTTAATT TGGCTTTGCA TTTTATCTTT

4141 TTTTAGCGTA TTAAATGAAA TGGTTTTGAA CGTCTCATTA CCTGATATTG CAAATGATTT

4201 TAATAAACCA CCTGCGAGTA CAAACTGGGT GAACACAGCC TTTATGTTAA CCTTTTCCAT

4261 TGGAACAGCT GTATATGGAA AGCTATCTGA TCAATTAGGC ATCAAAAGGT TACTCCTATT

4321 TGGAATTATA ATAAATTGTT TCGGGTCGGT AATTGGGTTT GTTGGCCATT CTTTCTTTTC

4381 CTTACTTATT ATGGCTCGTT TTATTCAAGG GGCTGGTGCA GCTGCATTTC CAGCACTCGT

4441 AATGGTTGTA GTTGCGCGCT ATATTCCAAA GGAAAATAGG GGTAAAGCAT TTGGTCTTAT

4501 TGGATCGATA GTAGCTATGG GAGAAGGAGT CGGTCCAGCG ATTGGTGGAA TGATAGCCCA

4561 TTATATTCAT TGGTCCTATC TTCTACTCAT TCCTATGATA ACAATTATCA CTGTTCCGTT

4621 TCTTATGAAA TTATTAAAGA AAGAAGTAAG GATAAAAGGT CATTTTGATA TCAAAGGAAT

4681 TATACTAATG TCTGTAGGCA TTGTATTTTT TATGTTGTTT ACAACATCAT ATAGCATTTC

4741 TTTTCTTATC GTTAGCGTGC TGTCATTCCT GATATTTGTA AAACATATCA GGAAAGTAAC

4801 AGATCCTTTT GTTGATCCCG GATTAGGGAA AAATATACCT TTTATGATTG GAGTTCTTTG

4861 TGGGGGAATT ATATTTGGAA CAGTAGCAGG GTTTGTCTCT ATGGTTCCTT ATATGATGAA

4921 AGATGTTCAC CAGCTAAGTA CTGCCGAAAT CGGAAGTGTA ATTATTTTCC CTGGAACAAT

4981 GAGTGTCATT ATTTTCGGCT ACATTGGTGG GATACTTGTT GATAGAAGAG GTCCTTTATA

5041 CGTGTTAAAC ATCGGAGTTA CATTTCTTTC TGTTAGCTTT TTAACTGCTT CCTTTCTTTT

5101 AGAAACAACA TCATGGTTCA TGACAATTAT AATCGTATTT GTTTTAGGTG GGCTTTCGTT

5161 CACCAAAACA GTTATATCAA CAATTGTTTC AAGTAGCTTG AAACAGCAGG AAGCTGGTGC

5221 TGGAATGAGT TTGCTTAACT TTACCAGCTT TTTATCAGAG GGAACAGGTA TTGCAATTGT

5281 AGGTGGTTTA TTATCCATAC CCTTACTTGA TCAAAGGTTG TTACCTATGG AAGTTGATCA

5341 GTCAACTTAT CTGTATAGTA ATTTGTTATT ACTTTTTTCA GGAATCATTG TCATTAGTTG

5401 GCTGGTTACC TTGAATGTAT ATAAACATTC TCAAAGGGAT TTCTAAATCG TTAAGGGATC

5461 AACTTTGGGA GAGAGTTCAA AATTGATCCT TTTTTTATAA CAGGAATTCG

SEQ ID No. 2 启动子PrecA片段：

1 GGTATCGGTT TAACGGGAGT TGCTGGTCCT GATGAGTTGG AAGGATACCC TGCAGGTACA

61 GTTTTTATTG GGATTGCAAC CCCTGAAGGC GTTTCTTCTA TTAAAGTATC GATTGGAGGA

121 AAGAGCCGCT CAGATGTCCG TCATATCAGT ACTTTACATG CTTTTGACTT GGTGCGTAGG

181 GCTTTATTAA AGATATAATA TTTGTTATAA TTAGTAGAAC GATTTCTAAA TTTGAATCAA

241 CCTAGATTCA TAGAAATATA AGGAGAAGAC ATTGGCTAAA AAAACGAAAA AAGCAGAAGA

301 AATTACTAAG AAATTCGGTG ATGAACGTCG AAAAGCCTTA GATGATGCTT TGAAAAATAT

361 TGAAAAAGAT TTTGGTAAGG GCGCAGTGAT GCGCTTAGGT GAGCGA

SEQ ID No. 3 红色荧光蛋白基因mcherry片段：

1 ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GGATAACATG GCCATCATCA AGGAGTTCAT GCGCTTCAAG

61 GTGCACATGG AGGGCTCCGT GAACGGCCAC GAGTTCGAGA TCGAGGGCGA GGGCGAGGGC

121 CGCCCCTACG AGGGCACCCA GACCGCCAAG CTGAAGGTGA CCAAGGGTGG CCCCCTGCCC

181 TTCGCCTGGG ACATCCTGTC CCCTCAGTTC ATGTACGGCT CCAAGGCCTA CGTGAAGCAC

241 CCCGCCGACA TCCCCGACTA CTTGAAGCTG TCCTTCCCCG AGGGCTTCAA GTGGGAGCGC

301 GTGATGAACT TCGAGGACGG CGGCGTGGTG ACCGTGACCC AGGACTCCTC CCTGCAGGAC

361 GGCGAGTTCA TCTACAAGGT GAAGCTGCGC GGCACCAACT TCCCCTCCGA CGGCCCCGTA

421 ATGCAGAAGA AGACCATGGG CTGGGAGGCC TCCTCCGAGC GGATGTACCC CGAGGACGGC

481 GCCCTGAAGG GCGAGATCAA GCAGAGGCTG AAGCTGAAGG ACGGCGGCCA CTACGACGCT

541 GAGGTCAAGA CCACCTACAA GGCCAAGAAG CCCGTGCAGC TGCCCGGCGC CTACAACGTC

601 AACATCAAGT TGGACATCAC CTCCCACAAC GAGGACTACA CCATCGTGGA ACAGTACGAA

661 CGCGCCGAGG GCCGCCACTC CACCGGCGGC ATGGACGAGC TGTACAAGTA G

序列号为SEQ ID No. 4 PrecA-mcherry PCR产物：

1 GGTATCGGTT TAACGGGAGT TGCTGGTCCT GATGAGTTGG AAGGATACCC TGCAGGTACA

61 GTTTTTATTG GGATTGCAAC CCCTGAAGGC GTTTCTTCTA TTAAAGTATC GATTGGAGGG

121 AAGAGCCGCT CAGATGTCCG TCATATCAGT ACTTTACATG CTTTTGACCT GGTGCGTAGG

181 GCTTTATTAA AGATATAATA TTTGTTATAA TTAGTAGAAC GATTTCTAAA TTTGAATCAA

241 CCTAGATTCA TAGAAATATA AGGAGAAGAC ATTGGCTAAA AAAACGAAAA AAGCAGAAGA

301 AATTACTAAG AAATTCGGTG ATGAACGTCG AAAAGCCTTA GATGATGCTT TGAAAAATAT

361 TGAAAAAGAT TTTGGTAAGG GCGCAGTGAT GCGCTTAGGT GAGCGAATGG TGAGCAAGGG

421 CGAGGAGGAT AACATGGCCA TCATCAAGGA GTTCATGCGC TTCAAGGTGC ACATGGAGGG

481 CTCCGTGAAC GGCCACGAGT TCGAGATCGA GGGCGAGGGC GAGGGCCGCC CCTACGAGGG

541 CACCCAGACC GCCAAGCTGA AGGTGACCAA GGGTGGCCCC CTGCCCTTCG CCTGGGACAT

601 CCTGTCCCCT CAGTTCATGT ACGGCTCCAA GGCCTACGTG AAGCACCCCG CCGACATCCC

661 CGACTACTTG AAGCTGTCCT TCCCCGAGGG CTTCAAGTGG GAGCGCGTGA TGAACTTCGA

721 GGACGGCGGC GTGGTGACCG TGACCCAGGA CTCCTCCCTG CAGGACGGCG AGTTCATCTA

781 CAAGGTGAAG CTGCGCGGCA CCAACTTCCC CTCCGACGGC CCCGTAATGC AGAAGAAGAC

841 CATGGGCTGG GAGGCCTCCT CCGAGCGGAT GTACCCCGAG GACGGCGCCC TGAAGGGCGA

901 GATCAAGCAG AGGCTGAAGC TGAAGGACGG CGGCCACTAC GACGCTGAGG TCAAGACCAC

961 CTACAAGGCC AAGAAGCCCG TGCAGCTGCC CGGCGCCTAC AACGTCAACA TCAAGTTGGA

1021 CATCACCTCC CACAACGAGG ACTACACCAT CGTGGAACAG TACGAACGCG CCGAGGGCCG

1081 CCACTCCACC GGCGGCATGG ACGAGCTGTA CAAGTAG