细胞保存液及其利用、以及细胞保存液的制造方法

摘要

本发明涉及细胞保存液。另外，本发明涉及使用细胞保存液的，细胞的保存方法、固定细胞的调制方法及细胞的分析方法。再者，本发明涉及细胞保存液的制造方法。

说明书

【技术领域】

本发明涉及细胞保存液。另外，本发明涉及使用细胞保存液的，细胞的保存方法、固定细胞的调制方法及细胞的分析方法。再者，本发明涉及细胞保存液的制造方法。

【背景技术】

在分析细胞时，在供于分析之前保存细胞。例如，在分析从生物体采集的细胞时，由于从生物体分离后，细胞就开始自身分解，在从细胞的采集至分析之间、有必要将细胞适合地保存。

在专利文献1中记载了分析前将细胞保存在细胞保存液中。在专利文献1的实施例5中公开了细胞保存液含1mM醋酸镁、2mM醋酸钙、10mM氯化钾、0.1％氯化钠及20％甲醇。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：美国专利第5,256,571号说明书

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明人发现，如果在以往的细胞保存液中将细胞保存指定的期间，则有该细胞中所含的核酸变得不稳定而被分解的情况。从而，期望能将细胞在体外更稳定地保存指定的期间的细胞保存液的开发。

【解决课题的技术方案】

本发明提供细胞保存液，其在水性溶剂中含碳原子数1～6的低级醇和二价的金属离子，上述二价的金属离子的浓度是约6mmol/L以上约82mmol/L以下。

本发明提供细胞的保存方法，其包括使细胞在体外浸渍于上述的细胞保存液。

本发明提供细胞保存液的制造方法，其包括在水性溶剂中混合碳原子数1～6的低级醇和二价的金属离子，细胞保存液中的二价的金属离子的浓度是约6mmol/L以上约82mmol/L以下。

本发明提供固定细胞的调制方法，其包括通过使细胞和上述的细胞保存液在体外接触而固定细胞。

本发明提供细胞的分析方法，其包括通过使细胞和上述的细胞保存液在体外接触而固定细胞的工序，及对在此工序中得到的固定细胞中所含的核酸进行分析的工序。

【发明效果】

本发明能将成为分析的对象的细胞至供于分析的指定的期间、在体外稳定保存。

【附图说明】

【图1】是对从在本实施方式的细胞保存液或市售的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳之时的照片。

【图2A】是显示将从受试者采集的子宫颈部细胞在市售的细胞保存液中在指定的条件下保存，将该细胞的DNA中所含的人乳头瘤病毒(HPV)来源的核酸用杂交体捕获剂(HC)法检测之时的测定值的坐标图。

【图2B】是显示将从受试者采集的子宫颈部细胞在市售的细胞保存液中在指定的条件下保存，将该细胞的DNA中所含的HPV来源的核酸用HC法检测之时的测定值的坐标图。

【图3A】是显示将从受试者采集的子宫颈部细胞在本实施方式的细胞保存液中在指定的条件下保存，将该细胞的DNA中所含的HPV来源的核酸用HC法检测之时的测定值的坐标图。

【图3B】是显示将从受试者采集的子宫颈部细胞在本实施方式的细胞保存液中在指定的条件下保存，将该细胞的DNA中所含的HPV来源的核酸用HC法检测之时的测定值的坐标图。

【图4】是将从受试者采集的子宫颈部细胞在本实施方式的细胞保存液或市售的细胞保存液中于室温保存2天之后，Papanicolaou染色之时的照片。

【图5】是将在有各种镁离子浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图6】是显示在将在本实施方式的细胞保存液中于25℃保存4小时的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图中的二倍体细胞出现区域的图。

【图7A】是显示在对于在有各种镁离子浓度的细胞保存液中于25℃保存4小时或于30℃保存24小时的HeLa细胞，二倍体细胞出现区域中的荧光面积的变动系数(CV)的值的坐标图。

【图7B】是显示在对于在有各种镁离子浓度的细胞保存液中于30℃保存24小时的HeLa细胞，二倍体细胞出现区域中的荧光面积的CV的值的坐标图。

【图8A】是将在有各种甲醇浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图8B】是将在有各种甲醇浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图8C】是将在有各种甲醇浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图9】是将在pH6.4或7.0的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图10】是将在有各种钙离子浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图11】是将在市售的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图12】是显示收容到容器中的细胞保存液的一例的概略图。

【图13】是将在有各种钙离子浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图14】是将在含镁离子及钙离子的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图15】是将在含乙醇的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图16】是将在实施例1的细胞保存液或美国专利第5,256,571号说明书中公开的细胞保存液中在指定的条件下保存的HeLa细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【图17】是将在有各种镁离子浓度的细胞保存液中在指定的条件下保存的HUVEC细胞用流式细胞仪分析而得到的荧光面积的直方图。

【实施方式】

[1.细胞保存液]

本实施方式的细胞保存液的特征在于，在水性溶剂中含碳原子数1～6的低级醇和二价的金属离子，该二价的金属离子的浓度是约6mmol/L以上约82mmol/L以下。

碳原子数1～6的低级醇(以下，也简称为“低级醇”)只要是于常温(25℃)能与水以任意的比例混合，就不特别限定，例如，可举出甲醇、乙醇、n-丙醇、异丙醇、n-丁醇、异丁醇、sec-丁醇、tert-丁醇、n-戊基醇、异戊基醇、sec-戊基醇、tert-戊基醇、1-乙基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、n-己醇、环己醇等。在它们之中，从与细胞的保存及固定相关的作用(脱水作用及蛋白质的凝固作用)的观点来看，也优选甲醇或乙醇，特别优选甲醇。

在本实施方式中，低级醇可为仅1种使用，也可为2种以上使用。2种以上的醇可以任意的比例混合。例如，可在细胞保存液中使用将甲醇和乙醇以任意的比例混合的混合醇。

细胞保存液中的低级醇的浓度可根据细胞的保存期间、细胞的分析方法等适宜设定，但当浓度过低时(例如低于约20体积％的浓度的情况)、细胞的稳定保存变难，当浓度过高时(例如高于约60体积％的浓度的情况)，有过量地固定细胞的担忧。在本实施方式中，低级醇的浓度通常是约20体积％以上约60体积％以下，优选为约30体积％以上约50体积％以下，特别优选为约40体积％以上约45体积％以下。在进一步的的实施方式中，低级醇的浓度是20体积％以上60体积％以下，优选为30体积％以上50体积％以下，特别优选为40体积％以上45体积％以下。通过以这样的浓度含低级醇，稳定保存细胞变得可能。另外，也可期待抑菌作用或杀菌作用。再者，在本说明书中，“体积％”也表示为“v/v％”或“vol％”。

二价的金属离子只要不影响细胞的形态及构成成分的维持，就不特别限定，例如，也可从也添加到细胞的培养基的金属离子选择。在本实施方式中，作为二价的金属离子，例如，可举出镁离子、钙离子、锌离子、铁(II)离子、铜离子、锶离子、钼离子等。在它们之中也优选第2族元素的金属离子。作为第2族元素的金属离子，特别优选镁离子及钙离子。在本实施方式中，二价的金属离子可为仅1种使用，也可为2种以上使用。

在本实施方式中，细胞保存液中的二价的金属离子优选从可溶于水性溶剂的二价的金属化合物供给。作为这样的化合物，例如，可举出二价的金属的无机酸盐或有机酸盐。作为二价的金属的无机酸盐，例如，可举出盐酸、硫酸、硝酸、过氯酸、氢溴酸、氢碘酸等的无机酸和二价的金属的盐。作为二价的金属的有机酸盐，例如，可举出醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸等的有机酸和二价的金属的盐。在它们之中也优选二价的金属的无机酸盐，例如，可举出氯化镁、硫酸镁、氯化钙等。在本实施方式中，二价的金属化合物可为无水物，也可为水合物。

关于二价的金属离子的浓度，本发明人发现通过在以低级醇作为主成分的细胞保存液中，将二价的金属离子的浓度设为约6mmol/L以上约82mmol/L以下，可将细胞及该细胞中所含的核酸在体外稳定保存指定的期间。在本实施方式中，二价的金属离子的浓度是优选为约6mmol/L以上约80mmol/L以下，更优选为约10mmol/L以上约60mmol/L以下。在进一步的的实施方式中，二价的金属离子的浓度是6mmol/L以上82mmol/L以下，优选为6mmol/L以上80mmol/L以下，更优选为10mmol/L以上60mmol/L以下。再者，在本说明书中，“mmol/L”也表示为“mM”。在本实施方式中，将上述的可溶于水性溶剂的二价的金属的化合物、特别是二价的金属的无机酸盐溶解于细胞保存液时，该细胞保存液中的二价的金属离子的浓度也可用所述化合物的浓度表示。

水性溶剂能于常温(25℃)与低级醇以任意的比例混合，只要不影响细胞的形态及构成成分的维持，就不特别限定。作为这样的水性溶剂，例如，可举出水、生理盐水、缓冲液、白蛋白溶液、葡聚糖溶液、正常人或哺乳动物血清溶液、及这些的组合。

作为水性溶剂，优选使用缓冲液。作为缓冲液，只要是在pH6以上8以下有缓冲作用的缓冲液，就不特别限定，例如，可举出Good缓冲液、磷酸缓冲液(PBS)、咪唑缓冲液、三乙醇胺盐酸盐缓冲液(TEA)等。作为Good缓冲液，例如，可举出PIPES、MES、Bis-Tris、ADA、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等的缓冲剂的水溶液。当使用缓冲液以外的水性溶剂时，也可向细胞保存液添加在上述的缓冲液中使用的缓冲剂。

在本实施方式中，细胞保存液的pH在适宜于细胞的保存的范围即可，通常，约6以上约8以下，优选为约6.4以上约7以下。在进一步的的实施方式中，细胞保存液的pH是6以上8以下，优选为6.4以上7以下。细胞保存液的渗透压只要不抑制细胞的保存，就不特别限定，也可为生理性地等张。

本实施方式的细胞保存液，根据需要，除了低级醇及二价的金属离子之外，也可在水性溶剂中含添加剂。作为这样的添加剂，只要不抑制细胞的固定、细胞的保存及细胞的分析，就不特别限定，例如，可举出无机盐类(氯化钠、氯化钾等)、糖类(葡萄糖、海藻糖等)、防腐剂(叠氮化钠、苯基甲磺酰氟等)、蛋白质稳定化剂(牛血清白蛋白等)、消泡剂(乙二醇等)、抗生物质(青霉素、链霉素等)、抗真菌剂(两性霉素B等)等公知的物质。

本实施方式的由细胞保存液保存的细胞不特别限定，例如，可为多细胞生物的细胞、单细胞生物的细胞、培养细胞株等。作为多细胞生物的细胞，可为从生物体采集的细胞，也可为从死体采集的细胞。作为多细胞生物的细胞，例如可举从人等的哺乳动物采集的细胞。具体而言，例示子宫颈部细胞、子宫体部细胞、口腔细胞、乳腺细胞、甲状腺细胞、尿中细胞、咳痰中细胞、支气管擦过细胞、腹腔清洗液中细胞、体腔液中细胞等。另外，细胞也可为从人等的哺乳动物采集的组织中所含的细胞。采集的组织可为正常组织，也可为含病变部位的组织。作为采集的组织中所含的细胞，例如，可举原代培养细胞、脐带中所含的脐带静脉内皮细胞、由手术或活体检查采集的肿瘤组织中所含的肿瘤细胞等。细胞也可为毛滴虫等的原虫或假丝酵母(Candida)等的真菌。细胞也可为将干细胞或iPS细胞等在体外人工调制的细胞。细胞的性质不特别限定，也可为正常细胞、永生化细胞、癌细胞等。

图12示本实施方式的细胞保存液的外观的一例。图中，11示收容细胞保存液的容器。收容本实施方式的细胞保存液的容器也可收容到箱中而提供于使用者。在此箱中，也可同装记载细胞保存液的使用方法等的附带文书。另外，在为了子宫颈部细胞的保存提供本实施方式的细胞保存液时，也可同装用于从子宫颈部采集细胞的细胞采集具(例如，绵棒、刷具等)。

[2.细胞保存液的制造方法]

对于本实施方式的细胞保存液的制造方法(以下，也简称为“制造方法”)，接下来说明。本实施方式的制造方法是上述的细胞保存液的制造方法，包括将碳原子数1～6的低级醇和二价的金属离子在水性溶剂中混合至该二价的金属离子的浓度成为约6mmol/L以上约82mmol/L以下。再者，碳原子数1～6的低级醇及二价的金属离子的浓度或种类等与对于细胞保存液所述的同样。

在本实施方式中，作为二价的金属离子，优选使用可溶于水性溶剂的二价的金属化合物(以下，也简称为“金属化合物”)。再者，此化合物与对于细胞保存液述的同样。在本实施方式的制造方法中使用的金属化合物可为处于溶液的形态，也可为处于固体(粉末或结晶等)的形状。

在本实施方式的制造方法中使用的低级醇可为无水醇，只要可调整至上述的浓度，就也可为含水醇。

在本实施方式中，向水性溶剂添加低级醇和作为二价的金属离子的金属化合物的顺序不特别限定。例如，可为将低级醇和水性溶剂混合后混合金属化合物，也可为金属化合物与水性溶剂混合后添加低级醇。另外，也可使低级醇和二价的金属离子基本上同时与水性溶剂混合。混合条件不特别限定，例如，在常温－常压(例如25℃、1气压)之下进行混合即可。

在本实施方式中，优选将如上所述得到的混合液的pH使用氢氧化钠等的碱或盐酸等的酸调整到约6以上约8以下，特别约6.4以上约7以下。在进一步的的实施方式中，优选将该混合液的pH调整到6以上8以下，特别6.4以上7以下。

在本实施方式中，根据需要，除了低级醇及二价的金属离子之外，也可混合添加剂。再者，添加剂与对于细胞保存液述的同样。

[3.使用细胞保存液的细胞的保存方法]

对于本实施方式的细胞的保存方法(以下，也简称为“保存方法”)，接下来说明。本实施方式的保存方法包括使细胞在体外浸渍于上述的本实施方式的细胞保存液。

在本实施方式的保存方法中使用的细胞与上述同样。

在本实施方式中，通过将细胞在体外浸渍到充分的量(例如，细胞的体积的100～1000倍量)的细胞保存液中，固定细胞。其后，可将细胞保存指定的期间。根据需要，将细胞浸渍到细胞保存液中之后，也可以不损伤该细胞的程度搅拌而使悬浮。在浸渍到细胞保存液中之前，也可用PBS等清洗细胞。在将细胞从生物体采集时，由于细胞立即开始自身分解，发生细胞或核结构的变形、核酸或蛋白质等的细胞内容物的分解－变性，优选在采集后最迟1分钟以内浸渍到细胞保存液中。保存容器只要是能由盖或密封等密闭的容器，就不特别限定，例如，可举出瓶、试管、微管、微平板、皿、瓶等。

将细胞浸渍到细胞保存液中时的温度(使细胞与细胞保存液接触时的温度)优选为35℃以下，更优选为32℃以下，再优选为30℃以下。将细胞浸渍到细胞保存液中时的温度的下限只要不由细胞保存液或细胞的冷冻等给之后的分析等带来不良影响，就不特别限定。例如，该温度的下限也可为1℃以上或2℃以上。本实施方式的保存方法也可包括通过于上述的温度使细胞与细胞保存液接触来固定细胞的工序。

细胞的保存温度优选为35℃以下，更优选为32℃以下，再优选为30℃以下。如果用本实施方式的细胞保存液保存细胞，则不仅是冷藏保存，即使在室温保存，仍可稳定维持细胞的核酸。保存温度的下限只要不由细胞保存液或细胞的冷冻等给之后的分析等带来不良影响，就不特别限定。例如，保存温度的下限也可为1℃以上又2℃以上。本实施方式的保存方法也可包括在上述的温度将细胞在细胞保存液中保存指定的期间的工序。再者，细胞和细胞保存液的接触时的温度和细胞的保存温度可为相同，也可为不同。

在保存期间中，也可更换细胞保存液。更换的频度不特别限定，例如也可在90天更换一次。

[4.使用细胞保存液的固定细胞的调制方法]

对于本实施方式的固定细胞的调制方法(以下，也简称为“调制方法”)，接下来说明。本实施方式的调制方法包括，通过使细胞和上述的本实施方式的细胞保存液在体外接触，固定该细胞。再者，在本实施方式的调制方法中使用的细胞与在本实施方式的细胞的保存方法中述的相同。

在本实施方式中，也可通过将细胞浸渍于充分的量(例如，细胞的体积的100～1000倍量)的细胞保存液，使该细胞和细胞保存液接触。或者，也可向空的容器放入细胞之后，向其中添加充分的量的细胞保存液，使该细胞和细胞保存液接触。在与细胞保存液接触之前，也可用PBS等清洗细胞。由于细胞立即开始自身分解，发生细胞或核结构的变形、核酸或蛋白质等的细胞内容物的分解－变性，优选在采集后最迟1分钟以内与细胞保存液接触。在接触中使用的容器不特别限定，例如，可举出瓶、试管、微管、微平板、皿、瓶等。根据需要，也可由盖或密封等密闭容器。

在本实施方式的调制方法中，与细胞保存液接触的细胞由该细胞保存液中所含的低级醇的作用(脱水作用及蛋白质的凝固作用)固定。在本实施方式中，只要细胞被充分地固定，细胞和细胞保存液的接触时间不特别限定。接触时的温度条件与在上述的本实施方式的保存方法巾叙述的条件同样。

在本实施方式中，将得到的固定细胞直接或用PBS等清洗，可作为期望的分析的受试体使用。或者，也可在使细胞与细胞保存液接触的状态下保存至供于分析。对于细胞的保存条件与对于本实施方式的保存方法述的相同。

[5.使用细胞保存液的细胞的分析方法]

对于本实施方式的细胞的分析方法(以下，也简称为“分析方法”)，接下来说明。在本实施方式的分析方法中，首先，通过使细胞和上述的本实施方式的细胞保存液在体外接触，固定该细胞。对于细胞、细胞保存液及细胞的固定与至此所述的相同。

接下来，进行得到的固定细胞中所含的核酸的分析。在本实施方式中，优选在核酸分析中取得示核酸的量的信息。表示核酸的量的信息的形式不特别限定，可根据取得该信息的方法适宜决定。作为示核酸的量的信息，例如，可为测定值等的数值信息，可为基于该数值信息取得的坐标图等的图表，也可为染色像或凝胶电泳的照片等的图像信息。

固定细胞中所含的核酸可为细胞原本有的核酸，也可为由基因导入或病毒感染等从外部导入的核酸。另外，核酸的种类也可为DNA及RNA之任一者。在本实施方式中，固定细胞中所含的核酸也可为从该固定细胞提取的核酸合成的cDNA或cRNA。

在本实施方式中，分析固定细胞中所含的核酸的方法可从现有技术中公知的方法选择。作为这样的方法，例如，可举出显微镜观察、流式细胞术、核酸扩增法(例如PCR法、RT-PCR法、实时PCR法等)、杂交法(例如Southern杂交法、Northern杂交法等)、微阵列法、杂交体捕获剂(HC)法(ClavelC.等人,J.Clin.Pathol,vol.51,p.737-740(1998)参照)等(Clavel C.等人,J.Clin.Pathol,vol.51,p.737-740(1998)通过参照并入本说明书)。

在本实施方式中，优选从固定细胞调制测定试样，对其进行分析。测定试样可为破碎固定细胞而调制，也可为不使固定细胞破碎地调制。作为破碎固定细胞的调制手段，例如，可举出从固定细胞提取核酸的。作为不破碎固定细胞的调制手段，例如，可举出在维持固定细胞的形态的状态下对核酸进行染色。

来自细胞的核酸的提取方法本身是在现有技术中公知的。在提取DNA时，例如，将固定细胞和含表面活性剂(例如胆酸钠、十二烷基硫酸钠等)的增溶液混合。在提取RNA时，例如，将固定细胞和含硫代氰酸胍及表面活性剂的增溶液混合。进而，通过对得到的混合液实施物理处理(搅拌、均化、超声波破碎等)，使在生物体试样中所含的核酸在该混合液中游离而可提取核酸。此时，优选对混合液进行离心分离而使细胞碎片沉淀，在分析中使用含游离的核酸的上清。另外，也可将得到的上清由现有技术中公知的方法纯化。来自细胞的核酸的提取及纯化也可使用市售的试剂盒进行。

在维持细胞的形态的状态下对核酸进行染色的方法本身是在现有技术中公知的。例如，首先，通过使固定细胞和含表面活性剂(例如Nonidet(注册商标)P-40、Triton(注册商标)X-100等)的处理液接触，给细胞膜可通过核酸染色用染料的程度的损伤。进而，通过使处理后的固定细胞和该染料的溶液接触，可在维持该固定细胞的形态的状态下对核酸进行染色。

用于对核酸进行染色的染料可根据核酸的分析方法，从公知的核酸染色用染料适宜选择。例如，在信息的取得中使用光学显微镜时，作为核酸染色用染料，可举出苏木精、派罗宁Y(派罗宁G)、甲基绿色等。另外，在信息的取得中使用荧光显微镜、流式细胞仪等时，作为核酸染色用染料，优选使用能对核酸进行染色的荧光染料。作为这样的荧光染料，例如，可举出碘化丙啶、溴化乙锭、乙啶-吖啶异源二聚体、乙啶二叠氮化物、乙啶同源二聚体-1、乙啶同源二聚体-2、乙啶单叠氮化物、Hoechst33342、Hoechst33258、4'，6-二脒-2-苯基吲哚－二氢氯化物(DAPI)、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]亚甲基]-1,4-二氢喹啉]-1-基]丙基]二甲基铵]·四碘化物(TOTO-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)-亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵)丙基]喹啉鎓－二碘化物(TO-PRO-1)、N,N,N'，N'-四甲基-N,N'-双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]-2-亚丙烯基]-1,4-二氢喹啉-1-基]丙基]-1,3-丙烷二铵－四碘化物(TOTO-3)、2-[3-[[1-[3-(三甲基铵)丙基]-1,4-二氢喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎓－二碘化物(TO-PRO-3)等。

含从固定细胞提取的核酸的测定试样适宜于检测固定细胞中所含的指定的核酸的分析方法(核酸扩增法、杂交法、微阵列法、HC法等)。含在维持细胞的形态的状态下进行核酸染色的固定细胞的测定试样适宜于取得每种细胞中所含的核酸的信息的分析方法(显微镜观察、流式细胞术等)。在本实施方式中，只要根据分析的目的，从固定细胞调制适合的测定试样而进行分析即可。

由流式细胞术分析固定细胞中所含的核酸时，优选在细胞的固定工序和该信息的取得工序之间，进行对固定细胞中所含的核酸进行染色的工序。对于固定细胞中所含的核酸的染色如上所述。在染色的固定细胞中所含的核酸的分析中，适宜地使用显微镜、流式细胞术等。由核酸染色用染料的细胞的染色强度依赖于主要细胞内的核酸的量。再者，染色质的结构等也与染色强度(易染性)相关，认为染色强度最依赖于核酸的量。从而，通过由显微镜、流式细胞术等测定细胞的染色强度，可取得表示核酸的量的信息。具体而言，在使用流式细胞术时，可向流式细胞仪导入染色的固定细胞，取得从该细胞发生的荧光信号，基于该荧光信号，取得表示核酸量的信息。

在本实施方式中，作为由流式细胞术的分析方法，例如，也可使用在美国专利申请公报第2009/0091746号说明书中记载的细胞分析装置或细胞分析方法(美国专利申请公报第2009/0091746号说明书通过参照并入本说明书)。具体而言，可将含美国专利申请公报第2009/0091746号说明书中的“测定对象细胞(measurement target cell)”的多个细胞用本实施方式的细胞保存液固定，由上述细胞分析装置或细胞分析方法分析。

在利用流式细胞仪的测定中，通过向流式细胞仪的流动池导入含染色的固定细胞的测定试样，向通过该流动池的细胞照射光，可取得从每种细胞发的光学信息(荧光信息及散射光信息)。

在本实施方式中，荧光信息是向用上述的荧光染料染色的每种细胞照射适当的波长的激发光，对激发的荧光进行测定而得到的信息(例如，波形、荧光强度等)。由于此荧光从由荧光染料染色的细胞中所含的核酸发出，荧光信息反映固定细胞中所含的核酸的量。再者，光接收波长可根据使用的荧光染料适宜选择。

在本实施方式中，散射光信息只要是可用一般市售的流式细胞仪测定的散射光，就不特别限定，可举出例如前方散射光(例如，光接收角度0～20度附近)、侧方散射光(光接收角度90度附近)等的散射光的脉宽、散射光强度等。在现有技术中知，侧方散射光反映细胞的核或颗粒等的内部信息，前方散射光反映细胞的大小的信息。

在本实施方式中，流式细胞仪的光源不特别限定，选适宜于荧光染料的激发的波长的光源。例如，使用红色半导体激光、蓝色半导体激光、氩激光、He-Ne激光、汞弧光灯等。特别是半导体激光与气体激光比非常地廉价，从而优选。

在本实施方式中，也可通过对于上述的光学信息，例如，进行信号的波形解析等，提取反映细胞中所含的DNA量、核的大小，细胞的大小等的特征参数，使用它们的特征参数而判别细胞的癌化－异型化。

在本实施方式的分析方法中，对固定细胞中所含的核酸进行分析的工序也可为包括检测该固定细胞中所含的指定的核酸的工序。此时，作为测定试样，优选使用含从固定细胞提取的核酸的试样。

在本实施方式中，指定的核酸不特别限定，可检测兴趣对象的任意的核酸。检测方法不特别限定，优选使用可与指定的核酸特异性地杂交的多核苷酸(探针或引物)的杂交法、微阵列法、HC法、核酸扩增法等。这样的多核苷酸可为DNA，也可为RNA。另外，该多核苷酸可由本领域技术人员根据指定的核酸的碱基序列适宜设计。

在本说明书中，“可特异性地杂交”是指作为探针或引物的上述的多核苷酸可在严格的条件下与指定的核酸杂交。其中，严格的条件是指该多核苷酸能以相比该指定的核酸以外的核酸更能检测地大的程度(例如，超背景的至少2倍)与指定的核酸杂交的条件。再者，严格的条件通常是序列依赖性的，在各种的环境中不同。一般而言，严格的条件选择为比以规定的离子强度及pH的特定的序列的热的熔点(thermal melting point：Tm)低约5℃变。此Tm是(在规定的离子强度、pH及核酸组成之下)与上述的指定的核酸的碱基序列互补的多核苷酸的50％平衡而杂交的温度。

在本实施方式中，探针也可由现有技术中公知的标记物质标记。作为这样的标记物质，可举出³²P、³⁵S、³H及¹²⁵I等的放射性物质、荧光素及Alexa>

在本实施方式中，核酸的检测可如以下一样进行。在杂交法中，通过检测由与指定的核酸特异性地杂交的标记探针发生的信号，可检测该指定的核酸。在微阵列法中，在存在与在微阵列上配置的探针特异性地杂交的标记核酸时，通过检测从该标记核酸发生的信号，可检测该指定的核酸。再者，在本说明书中，“检测信号”包括，定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及将信号的强度如“不信号发生”、“弱”、“强”等一样以多个阶段半定量检测。

在核酸扩增法中，对使用与指定的核酸的碱基序列互补的引物的扩增后的反应液进行凝胶电泳而确认扩增产物的有无，在存在扩增产物时，可检测该指定的核酸。或者，在使用SYBR(注册商标)Green I等的嵌入DNA的荧光物质或TaqMan(商标)探针的实时PCR法中，通过检测来自扩增后或扩增中的反应液中的荧光物质或探针的信号，可检测该指定的核酸。

在HC法中，通过将指定的核酸(DNA)和与该核酸特异性地杂交的RNA探针的杂交体用固相化抗体及标记抗体捕获，检测由该标记抗体发生的信号，可检测该指定的核酸。

在本实施方式中，也可将从子宫颈部采集的细胞用上述的细胞保存液固定，对于该细胞，作为指定的核酸检测来源于人乳头瘤病毒(HPV)的核酸。被HPV感染，则HPV的DNA并入宿主的细胞的基因组DNA。从而，在受试者的从子宫颈部采集的细胞中，在检测到来源于HPV的核酸时，可判断该受试者被HPV感染。

HPV被分类为100种以上的亚型，在本实施方式中，作为检测对象的HPV不特别限定，可从公知的亚型任意地选择。例如，也可检测来源于被认为引起子宫颈癌的可能性高的高风险型HPV的核酸。作为这样的高风险型HPV，可举出HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73及HPV-82。

来源于HPV的核酸的检测方法可从公知的检测方法适宜选择。例如，也可使用能扩增作为检测对象的HPV的基因组DNA的引物，由核酸扩增法检测来源于HPV的核酸。另外，也可使用能与上述的HPV的基因组DNA特异性地杂交的探针，由杂交法或HC法检测HPV来源的核酸。再者，引物及探针可由本领域技术人员根据HPV的基因组DNA的碱基序列适宜设计。另外，在HPV来源的核酸的检测中，也可使用市售的HPV检测用试剂盒。

用本实施方式的细胞保存液固定的细胞不仅是可供于上述的核酸的分析方法，也可供于对细胞、核等的大小或形态进行分析的方法。在对细胞、核等的大小或形态进行分析时，可使用例如流式细胞仪或显微镜。

在使用流式细胞仪时，通过使对核进行荧光染色的细胞流过流动池，向每种细胞照射光取得散射光信息或荧光信息，可基于其进行异常的细胞的检测等。作为流式细胞仪，例如，可使用在美国专利申请公报第2015/0104786号说明书中记载的装置(美国专利申请公报第2015/0104786号说明书通过参照并入本说明书)。另外，也可使用作为市售的剥离细胞分析装置的LC-1000(Sysmex公司)。

另外，也可使用有摄像功能的流式细胞仪。通过对流过流动池的每种细胞进行摄像，病理医生等观察摄像的细胞，可进行异常的细胞的检测等。

在使用显微镜时，例如，对用本实施方式的细胞保存液固定的细胞进行染色，向载玻片涂沫细胞，通过对其进行显微镜观察分析细胞。在显微镜观察中，病理医等可为用显微镜观察，也可为用有摄像功能的显微镜对染色像进行摄影，病理医生等观察摄影的图像。向此载玻片的涂沫可由病理医生等手动进行，也可为用标本制作装置自动进行。作为标本制作装置，可使用在美国专利第5240606号说明书中记载的装置(美国专利第5240606号说明书通过参照并入本说明书)。另外，也可使用ThinPrep(注册商标)处理器等的市售的标本制作装置。

再者，本发明也包括用于保存细胞的细胞保存液的使用。另外，本发明也包括用于调制固定细胞的细胞保存液的使用。另外，本发明也包括用于对细胞进行分析的细胞保存液的使用。保存、固定或分析的细胞与上述同样。另外，细胞保存液的组成也与上述同样。

接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【实施例1】

使用本实施方式的细胞保存液而保存细胞之后，探讨该细胞的DNA的保存稳定性。为了比较，使用市售的细胞保存液而进行同样的探讨。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表1中所示的组成而进行调制(以下，也称为“实施例1的细胞保存液”)。在此细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。此细胞保存液的pH是6.7。使用PreservCyt(注册商标)(Hologic公司)作为市售的细胞保存液。PreservCyt(注册商标)的详细的组成未被公开，但知是以甲醇作为主成分的水性缓冲液。再者，由使用ICP发光分光分析装置(SII Nanotechnology公司)的组成分析，从PreservCyt(注册商标)检测不到二价的金属离子。

【表1】实施例1的细胞保存液

甲醇43v/v％MgCl₂20mmol/L

【(1-2)细胞】

作为用细胞保存液保存的细胞，使用人子宫颈癌细胞株HeLa(从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到)。使用含有10％胎牛血清(FBS：HyClone公司)的Dulbecco改变Eagle培养基(DMEM：Sigma-Aldrich公司)，在37℃、5％CO₂气氛下培养HeLa细胞。

【2.DNA的保存稳定性的探讨】

【(2-1)细胞的保存】

将培养的HeLa细胞由常规方法回收而进行计数。将HeLa细胞(1×10⁶个)添加到分注到15mL容量的塑料管(Labcon公司)中的实施例1的细胞保存液(12mL)或市售的细胞保存液(12mL)中，将细胞浸渍到细胞保存液中。将这些在1℃或31℃的温度条件下保存2周、1个月间或2个月间。再者，在临床现场中，细胞的保存一般在冰箱内(约4℃)进行。作为在本实施例中设定的温度条件的“1℃”是比此冰箱的温度低的温度。另外，在本实施例中，由于验证可于临床现场的室温使用细胞保存液与否，即使在比室温高的“31℃”，也进行实验。

【(2-2)DNA提取】

将含HeLa细胞和保存液的试样以10,000rpm离心1分钟，除去上清。从回收的细胞，使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司制)而提取DNA。具体的操作根据所述试剂盒附带的手册进行。另外，作为对照，从在实施例1的细胞保存液或市售的细胞保存液中浸渍3小时的HeLa细胞(以下，也称为“刚固定的细胞”)，与上述同样地，提取DNA。

【(2-3)电泳】

将各DNA溶液的吸光度用分光光度计nanodrop2000(Thermo Fisher Scientific公司制)测定而取得DNA浓度。从DNA溶液调制琼脂糖凝胶电泳用样品至各样品中所含的DNA量成为500ng/泳道。将得到的样品在0.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。

【3.结果】

电泳的结果示于图1。如图1所示，在使用市售的细胞保存液时，从保存一定期间的细胞取得的DNA的核苷酸长与从刚固定的细胞取得的DNA比变短，得知DNA被分解。这表示，在市售的细胞保存液中，在保存期间DNA不被适合地维持。从而提示，在使用市售的细胞保存液时，有不适合进行保存后的细胞的DNA分析的可能性。与此相比，在使用实施例1的细胞保存液时，即使是任何的温度条件及保存期间，从保存后的细胞取得的DNA的核苷酸长与从刚固定的细胞取得的DNA的核苷酸长几乎无变。从而提示，如果使用实施例1的细胞保存液，即使在将细胞保存一定期间之后，也适合进行DNA分析。

【实施例2】

在使用实施例1的细胞保存液而保存细胞之后，通过检测该细胞的DNA中所含的指定的核酸(HPV来源的核酸)，探讨细胞中的DNA的保存稳定性。为了比较，使用作为市售的细胞保存液的PreservCyt(注册商标)(Hologic公司)而进行同样的探讨。

【1.由市售的细胞保存液的DNA的保存稳定性的探讨】

【(1-1)细胞的保存】

从8名的受试者的子宫颈部采集子宫颈部细胞(8受试体)。向PreservCyt(注册商标)(12mL)各自添加8个受试体，将细胞浸渍到细胞保存液中。将每种受试体等分为3个，得到等份1～3。对于等份1是，向细胞保存液添加后立即(刚固定)进行后述的核酸检测。对于等份2是，于1℃保存1个月间或2个月间之后，进行后述的核酸检测。对于等份3是，于31℃保存1个月间或2个月间之后，进行后述的核酸检测。各受试体的受试体编号及保存条件示于表2。

【表2】

【(1-2)核酸检测】

在实施例2中，将来源于感染子宫颈部细胞的HPV的核酸由杂交体捕获剂(HC)法检测。使用HC2Sample Conversion Kit(制品编号5127-1220、Qiagen公司)作为HC法的预处理，提取各等份中所含的细胞的DNA。具体的操作根据所述试剂盒附带的手册进行。对于从各等份得到的DNA，使用作为HPV-DNA检测试剂盒的HPV DNA“Qiagen”HCII(制品编号618915、Qiagen公司)而进行HPV来源的核酸的检测。具体的操作根据所述试剂盒附带的手册进行。

【(1-3)结果】

结果示于图2A及图2B。图中，纵轴示由HC法测定的化学发光强度(HC2指数值)的对数，横轴的“0day”示保存期间是0天(刚固定)，“1m/2m”示保存期间是1个月或2个月。如图2A所示，有等份2的HC2指数值比等份1的HC2指数值降低的倾向。另外，如图2B所示，等份3的HC2指数值比等份1的HC2指数值降低。这些结果表示，通过将从受试者采集的子宫颈部细胞，在市售的细胞保存液中保存1℃或于31℃1个月间或2个月间，细胞中的核酸分解。

【2.由本实施方式的细胞保存液的DNA的保存稳定性的探讨】

【(2-1)细胞的保存】

从与上述的8名不同的12名的受试者的子宫颈部采集子宫颈部细胞(12受试体)。向实施例1的细胞保存液(12mL)各自添加12个受试体，将细胞浸渍到细胞保存液中。将每种受试体等分为3个，得到等份1～3。对于等份1是，向细胞保存液添加后立即(刚固定)回收细胞而于-60℃保存。2个月后，对于从等份1回收的细胞，与等份2及3一同，进行后述的核酸检测。对于等份2是，于1℃保存2个月间之后，进行后述的核酸检测。对于等份3是，于31℃保存2个月间之后，进行后述的核酸检测。各受试体的受试体编号及保存条件示于表3。

【表3】

【(2-2)核酸检测】

与上述同样地，将来源于感染子宫颈部细胞的HPV的核酸由杂交体捕获剂(HC)法检测。由HC法的预处理及HC法的核酸的检测各自使用HC2Sample Conversion Kit(Qiagen公司)及HPV DNA“Qiagen”HCII(Qiagen公司)进行。具体的操作根据各试剂盒附带的手册进行。

【(2-3)结果】

结果示于图3A及图3B。图中，纵轴示由HC法测定的化学发光强度(HC2指数值)，横轴的“0day”示保存期间是0天(刚固定)，“2m”示保存期间是2个月。如图3A所示，等份2的HC2指数值与等份1的HC2指数值大致同等。另外，如图3B所示，等份3的HC2指数值比等份1的HC2指数值降低。从这些结果得知，将从受试者采集的子宫颈部细胞，即使在实施例1的细胞保存液中保存1℃或于31℃2个月间，仍可适合维持细胞中的核酸。

【实施例3】

探讨用实施例1的细胞保存液保存的细胞是否适宜于细胞标本染色。为了比较，使用用作为市售的细胞保存液的PreservCyt(注册商标)(Hologic公司)保存的细胞。

【1.用市售的细胞保存液保存的细胞的染色】

将从受试者的子宫颈部采集的细胞悬浮于PreservCyt(注册商标)(20mL)中，于室温静置2天。使用载玻片制成装置ThinPrep2000(Hologic公司)而制成从细胞悬浮液，使细胞附着的载玻片。具体的操作根据所述装置的处理说明书进行。对制成的载玻片根据下述的表4所示的顺序进行Papanicolaou染色。

【表4】

顺序染色槽时间170％乙醇2min250％乙醇2min3水洗2min41.5倍稀释吉尔苏木精4min5流水水洗5min60.2％盐酸醇1min7流水水洗2min870％乙醇2min995％乙醇2min×4槽10OG6(橙G6)2min1195％乙醇2min×4槽12EA(伊红)2min13100％乙醇2min×4槽14二甲苯5min×4槽

【2.用本实施方式的细胞保存液保存的细胞的染色】

将从受试者的子宫颈部采集的细胞悬浮于实施例1的细胞保存液(20mL)中，于室温静置2天。进而，将细胞悬浮液以800g离心10分钟，除去上清。向沉淀物添加200μL的去离子水而悬浮之后，向设置在载玻片(BDSurePath预包被载玻片、Becton-Dickinson公司)的室(BDSettling Chamber、Becton-Dickinson公司)内添加得到的悬浮液的全量，静置10分钟。其后，将载玻片上的细胞用95％乙醇固定。对制成的载玻片根据上述的表4所示的顺序进行Papanicolaou染色。

【3.结果】

结果示于图4。如图4所示，对用本实施方式的细胞保存液保存的细胞进行Papanicolaou染色，则得到了与用市售的细胞保存液保存的细胞同等的染色像。

【实施例4】

将细胞保存液的镁离子浓度和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

在实施例4中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表5中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.6。

【表5】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液1430细胞保存液2431.0细胞保存液3432.0细胞保存液44320

【(1-2)细胞】

作为用细胞保存液保存的细胞，使用人子宫颈癌细胞株HeLa(获自ATCC)。HeLa细胞与实施例1同样地培养。

【(1-3)试剂及流式细胞仪】

使用GC-SEARCH KIT(Sysmex株式会社)作为染色液及RNA除去剂。使用GC-PACK(Sysmex株式会社)作为稀释液。使用剥离细胞分析装置LC-1000(Sysmex株式会社)作为流式细胞仪。

【2.细胞的保存及流式细胞术(FCM)分析】

向细胞保存液1～4的各自添加HeLa细胞而悬浮，将得到的细胞悬浮液于1℃或31℃静置24小时。将细胞悬浮液以10,000rpm离心1分钟分离之后，除去上清。向含细胞的残留液(30μL)加稀释液(1mL)，以10,000rpm离心1分钟分离之后，除去上清。向含细胞的残留液(30μL)加染色液、RNA除去剂、及稀释液而调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，从每种细胞检测的荧光面积作为横轴，制成细胞数根据纵轴的频度分布(直方图)。再者，荧光面积是反映细胞的DNA量的指标。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图5。其中，对于荧光面积的直方图进行说明。知在荧光面积的直方图中，通常，确认到2个峰。即，是由二倍体细胞的集团形成的峰和通过由细胞增殖而成四倍体的细胞的集团形成的峰。DNA量是，成为四倍体的细胞的比二倍体细胞多。一般而言知，二倍体细胞的DNA量是一定的。从而，当DNA稳定时，由于二倍体细胞的荧光面积变得一定，在荧光面积的直方图中锐利地出现二倍体细胞的峰。一方面，由于荧光面积是反映DNA量的指标，DNA不稳定化而发生分解或片段化时，二倍体细胞的DNA量变得不一定，发生荧光面积的变动。结果，在直方图中，二倍体细胞的峰变得不锐利。

如图5所示，在1℃的温度条件下，即使使用细胞保存液1～4的任何而保存细胞，荧光面积的直方图的形状也是正常的。但是，使用二价的金属离子浓度低的细胞保存液1、2及3而于31℃保存细胞，则直方图的形状崩塌。与此相比，当使用将二价的金属离子浓度设为20mmol/L的细胞保存液4时，即使在31℃的温度条件下，也确认不到直方图的形状的崩塌。从而示，通过适合地设定二价的金属离子浓度，在高温保存时，也可与于低温保存时同样地稳定维持DNA，防止直方图的崩塌。

【实施例5】

将细胞保存液的镁离子浓度和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

在实施例5中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表6中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.6。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表6】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液5430细胞保存液6431.0细胞保存液7432.0细胞保存液8433.0细胞保存液9434.0细胞保存液10435.0细胞保存液11436.0细胞保存液12438.0细胞保存液134310细胞保存液144320细胞保存液154330细胞保存液164340细胞保存液174360细胞保存液184380细胞保存液194382细胞保存液204385细胞保存液214390细胞保存液224392细胞保存液234395细胞保存液2443100细胞保存液2543120细胞保存液2643200

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液5～26各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于25℃4小时或于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。如以下一样算出直方图形状的稳定性的指标。再者，为了对于算出进行说明，参照图6。由使用细胞保存液14(MgCl₂浓度是20mmol/L)而于25℃保存4小时的细胞的直方图，算出二倍体细胞区域的荧光面积的最频值。图6中，最频值对应于用箭头表示的峰。定义以二倍体细胞区域的荧光面积的最频值的75％作为下限，以二倍体细胞区域的荧光面积的最频值的125％作为上限的二倍体细胞出现区域。图6中，此区域对应于夹在二条线之间的区域。算出在二倍体细胞出现区域中的荧光面积的变动系数(CV)，以其作为直方图的形状的稳定性的指标。在所述区域中的荧光面积的变动系数(CV)的值越大，表示对于二倍体细胞的直方图的形状崩塌。

【3.结果】

结果示于图7A及图7B。如图7A所示，于25℃保存4小时时，使用在0mmol/L～200mmol/L的范围之中任何的氯化镁浓度的细胞保存液，在二倍体细胞出现区域中的CV的值都低，另外，几乎确认不到随氯化镁的浓度的CV的值的变动。一方面，如图7A及图7B所示，于30℃保存24小时时，在二倍体细胞出现区域中的CV的值在使用氯化镁浓度低值或高值的细胞保存液之时显著地增大。由这些结果，使用细胞保存液11～19时，即，细胞保存液中的二价的金属离子浓度是6mmol/L～82mmol/L时，确认到有防止直方图形状的崩塌的效果。如上所述，由于荧光面积是反映细胞的DNA量的指标，当DNA不稳定化而发生分解或片段化时，二倍体细胞的DNA量变得不一定，发生荧光面积的变动。结果，二倍体细胞的直方图的形状崩塌。从而认为，通过将细胞保存液的二价的金属离子浓度设为6mmol/L～82mmol/L，贡献于细胞的DNA的稳定化。

【实施例6】

将细胞保存液的低级醇浓度和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

在实施例6中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表7中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH都是6.7。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表7】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液274010细胞保存液284020细胞保存液294040细胞保存液304510细胞保存液314520细胞保存液324540细胞保存液333810细胞保存液343820细胞保存液353840细胞保存液363860细胞保存液374810细胞保存液384820细胞保存液394840细胞保存液404860细胞保存液413520细胞保存液423540细胞保存液434320细胞保存液444340细胞保存液455020细胞保存液465040

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液27～46的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图8A、图8B及图8C。如图8A及图8B所示，当细胞保存液的二价的金属离子浓度是10mmol/L～60mmol/L之时，即使甲醇(MeOH)浓度是38v/v％～48v/v％，荧光面积的直方图的形状也良好地维持。另外，如图8C所示，当细胞保存液的二价的金属离子浓度是20mmol/L或40mmol/L之时，即使甲醇浓度是35v/v％或50v/v％，荧光面积的直方图的形状也良好地维持。

【实施例7】

将细胞保存液的pH和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

在实施例7中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表8中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液47～50的pH是6.4，细胞保存液51～54的pH是7.0。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表8】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液474310细胞保存液484320细胞保存液494340细胞保存液504360细胞保存液514310细胞保存液524320细胞保存液534340细胞保存液544360

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液47～54的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图9。如图9所示，当细胞保存液的二价的金属离子浓度是10mmol/L～60mmol/L之时，即使pH是6.4或7.0，荧光面积的直方图的形状也良好地维持。

【实施例8】

将使用钙离子作为二价的金属离子，细胞保存液的钙离子浓度和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

在实施例8中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化钙(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表9中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.7。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表9】

甲醇(v/v％)CaCl₂(mmol/L)细胞保存液55430细胞保存液56431.0细胞保存液574320

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液55～57的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于1℃或31℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图10。如图10所示，在1℃的温度条件下，即使使用细胞保存液55～57之任一者而保存细胞，荧光面积的直方图的形状仍是正常的。但是，使用二价的金属离子浓度低的细胞保存液55及56而于31℃保存细胞，则直方图的形状崩塌。与此相比，当使用将二价的金属离子浓度设为20mmol/L的细胞保存液57时，在31℃的温度条件下，也确认不到直方图的形状的崩塌。从而示，通过适合地设定二价的金属离子浓度，在高温保存时，也可与于低温保存时同样地稳定维持DNA，防止直方图的崩塌。

【比较例1】

对于使用市售的细胞保存液保存的细胞，将DNA的稳定性由流式细胞术探讨。

【1.材料】

在比较例1中，使用PreservCyt(注册商标)(Hologic公司)作为市售的细胞保存液。另外，细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【2.细胞的保存及FCM分析】

向PreservCyt(注册商标)添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于室温静置30分钟、于31℃静置24小时或于31℃静置7天。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图11。如图11所示，在室温30分钟的保存条件下，荧光面积的直方图的形状是正常的。但是，在31℃保存24小时或7天的条件下，直方图的形状崩塌。从而得知，市售的细胞保存液与本实施方式的细胞保存液不同，不适宜于在31℃的温度条件下的保存。

【实施例9】

将细胞保存液的钙离子浓度和细胞的DNA的稳定性的关联由流式细胞术探讨。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

在实施例9中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化钙(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表10中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.6。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表10】

甲醇(v/v％)CaCl₂(mmol/L)细胞保存液58430细胞保存液59431.0细胞保存液60436.0细胞保存液614320细胞保存液624382细胞保存液6343100细胞保存液6443200

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液58～64的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图13。如图13所示，在使用钙离子浓度是6、20及82mmol/L的细胞保存液60、61及62而于30℃保存细胞时，直方图的形状是良好的。如上所述，荧光面积是反映细胞的DNA量的指标。即表示，荧光面积的直方图的形状是良好的，保存期间、细胞的DNA稳定维持。从而示，通过适合地设定钙离子浓度，在30℃的温度条件下保存也可稳定维持细胞的DNA。

【实施例10】

使用含镁离子及钙离子的两方作为二价的金属离子的细胞保存液固定及保存细胞。将保存的细胞的DNA的稳定性由流式细胞术探讨。为了比较，也使用不含二价的金属离子的细胞保存液。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

在实施例10中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)、氯化镁(岸田化学株式会社)及氯化钙(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表11中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.7。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表11】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)CaCl₂(mmol/L)细胞保存液654300细胞保存液66431010

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液65及66的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图14。如图14所示，使用不含二价的金属离子的细胞保存液65而于30℃保存细胞，则直方图的形状崩塌。与此相比，当使用二价的金属离子的合计浓度是20mmol/L的细胞保存液66时，直方图的形状是良好的。从而示，通过使用以适合的浓度含2种二价的金属离子的细胞保存液，在30℃的温度条件下保存也可稳定维持细胞的DNA。

【实施例11】

使用含乙醇作为低级醇的细胞保存液固定及保存细胞。将保存的细胞的DNA的稳定性由流式细胞术探讨。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

在实施例11中，将乙醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表12中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。此细胞保存液的pH是6.7。细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【表12】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液673020

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液67添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置7天。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图15。如图15所示，用含乙醇作为低级醇的细胞保存液67保存细胞时，直方图的形状是良好的。从而示，通过使用以适合的浓度含乙醇及二价的金属离子的细胞保存液，在30℃的温度条件下保存也可稳定维持细胞的DNA。

【比较例2】

对于使用在本实施方式的细胞保存液及专利文献1(美国专利第5,256,571号说明书)的实施例5中记载的细胞保存液保存的细胞，对DNA的稳定性进行比较。

【1.材料】

【(1-1)细胞保存液】

使用上述的实施例1的细胞保存液作为本实施方式的细胞保存液。另外，作为在专利文献1的实施例5中记载的细胞保存液(以下，也称为“比较例2的细胞保存液”)，调制下述的组成的细胞保存液。再者，细胞、试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

<比较例2的细胞保存液>

1mM醋酸镁六水合物2mM醋酸钙一水合物10mM氯化钾0.1％氯化钠20％甲醇

【2.细胞的保存及FCM分析】

向实施例1的细胞保存液及比较例2的细胞保存液的各自添加HeLa细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置7天。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图16。如图16所示，当用实施例1的细胞保存液将细胞于30℃保存7天时，荧光面积的直方图的形状是正常的。与此相比，当用比较例2的细胞保存液保存细胞时，直方图的形状崩塌。从而得知，在美国专利第5,256,571号说明书的实施例5中记载的细胞保存液与本实施方式的细胞保存液不同，不适宜于在30℃的温度条件下的保存。

【实施例12】

使用含镁离子的细胞保存液而固定及保存正常组织来源的细胞。将保存的细胞的DNA的稳定性由流式细胞术探讨。

【1.材料】

【(1.1)细胞保存液】

在实施例12中，将甲醇(和光纯药工业株式会社)及氯化镁(岸田化学株式会社)混合至成为以下的表13中所示的组成而调制细胞保存液。在这些细胞保存液的调制中，使用水作为溶剂，作为缓冲剂添加PIPES(同仁化学研究所)至成为20mM。在pH的调整中使用NaOH水溶液。细胞保存液pH均是6.7。

【表13】

甲醇(v/v％)MgCl₂(mmol/L)细胞保存液68430细胞保存液69436细胞保存液704320细胞保存液714382

【(1-2)细胞、试剂及流式细胞仪】

作为用细胞保存液保存的正常组织来源的细胞，使用人脐带静脉内皮细胞株HUVEC(获自ATCC)。HUVEC细胞与实施例1的HeLa细胞的培养同样地培养。试剂及流式细胞仪与实施例4相同。

【2.细胞的保存及FCM分析】

向细胞保存液68～71的各自添加HUVEC细胞而使悬浮，将得到的细胞悬浮液于30℃静置24小时。与实施例4同样地，从细胞悬浮液调制测定试样。向流式细胞仪导入得到的测定试样而取得光学信号(荧光信号及前方散射光信号)。进而，与实施例4同样地，制成荧光面积的直方图。

【3.结果】

制成的荧光面积的直方图示于图17。如图17所示，使用不含镁离子的细胞保存液68而于30℃保存HUVEC细胞，则直方图的形状崩塌。与此相比，当使用镁离子浓度是6、20及82mmol/L的细胞保存液69、70及71而于30℃保存细胞时，直方图的形状是良好的。从而示，如果使用本实施方式的细胞保存液，则即使将正常组织来源的细胞在30℃的温度条件下保存，仍可稳定维持该细胞的DNA。

【符号的说明】

11：收容细胞保存液的容器