一种农杆菌介导的麻竹转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的麻竹转化方法，包括外植体的准备、农杆菌侵染菌液的制备、侵染、筛选、不定芽的诱导和诱导生根步骤。利用农杆菌去侵染麻竹茎端外植体，在含有2 mg/L 2,4‑D和200 μM乙酰丁香酮的NB培养基中共培养，经过有道筛选等步骤最终获得转基因麻竹。本发明使用农杆菌介导的高效转化体系，首次建立了以麻竹营养器官为起始的麻竹的转基因体系，该体系能够突破克服传统的育种方法在竹类中无法应用的障碍，为将来通过转基因技术进行麻竹的分子育种提供前提；通过该方法，在基础研究领域为研究竹类基因功能提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于林木遗传育种领域，具体涉及一种农杆菌介导的麻竹转化方法。

背景技术

麻竹是禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，在福建台湾广东广西贵州云南等部自然分布，是中国华南及东南沿海地区重要的笋材两用的大型丛生竹种之一，具有极高的经济价值和社会价值。

随着社会经济的发展，人们对竹材的产量及质量要求越来越高，但随之对应的是竹类育种的远远滞后。传统的遗传育种方法在竹子中无法进行，主要的原因是竹子开花具有长期性及不确定性，无法进行竹种之间的杂交。转基因育种是作物育种中的重要手段，通过转基因进行精准的基因调控，大幅度的提高竹材的产量和品质。

目前麻竹转基因方面的研究比较少。2014年，Qiao等人利用花药组织为外植体建立起再生体系，并在此基础上将细菌中的codA基因导入到麻竹基因组。这是麻竹转基因研究的唯一一例报道。但是由麻竹的花药起始的转基因技术存在可能产生嵌合体、单倍体或是多倍体以及转化率较低等问题。因此，通过农杆菌介导的方法转化由营养组织产生的愈伤组织，进行功能基因的转化是对麻竹资源进行改良所必须解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种农杆菌介导的麻竹转化方法。本发明在发明人建立的以麻竹茎端为外植体再生体系的基础上，利用农杆菌介导的方法进行麻竹的转基因研究。本发明利用这种方法解决了长期以来麻竹转基因困难的问题，可广泛应用于麻竹的功能基因鉴定及分子育种。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种农杆菌介导的麻竹转化方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的准备：取生长于温室中的麻竹幼嫩茎端，洗涤、灭菌后，切成0.5-1cm的小段，其中结节的部位位于末端伤口处；将切断后的茎端放置于愈伤诱导培养基上，进行暗培养，培养温度为26℃；1.5个月后，待诱导出愈伤组织后，移入到愈伤增殖培养基中，并在该培养基中培养7-8个月，产生淡黄色的胚性愈伤组织，并将其作为农杆菌侵染对象；

（2）农杆菌侵染菌液的制备：将含有目的基因的农杆菌划线培养，随后转移至含有50mg/L卡那霉素的YEB培养基中，并于28℃振荡培养过夜，然后按照1:100的体积比例将培养基稀释，并将其添加到含有50 mg/L的卡那霉素和200 μM的乙酰丁香酮的YEB培养基中，继续培养至OD为0.6-0.8；离心后去除上清液，将所得菌液悬浮于含有200 μM的乙酰丁香酮的AMM液体培养基中，稀释至OD为0.8，得到农杆菌侵染菌液；

（3）侵染：将步骤（1）中增殖出胚性愈伤组织的外植体浸入步骤（2）得到的农杆菌侵染菌液中，真空处理15分钟后室温放置15分钟；取出侵染过的外植体，置于无菌台中，用灭菌的滤纸吸干表面菌液，后转入含有2 mg/L 2,4-D和200 μM乙酰丁香酮的NB培养基中，在25℃、黑暗条件下共培养4天；

（4）筛选：将步骤（3）共培养完毕的愈伤组织在400 mg/L的羧苄青霉素中清洗3-5遍，后在抗性愈伤扩增培养基中进行筛选培养，逐渐形成胚性愈伤组织，用于不定芽的诱导；所述筛选培养的条件为：26℃的黑暗条件下培养4个月；

（5）不定芽的诱导：将步骤（4）筛选培养得到的愈伤组织放置到抗性芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^-2>-1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；不定芽诱导培养后，在芽增殖培养基中进行不定芽伸长培养，培养条件为：光照条件下培养16>-2>-1；所述芽增殖培养基的配方与芽诱导培养基的培养相同；

（6）诱导生根：当再生的芽生长到3-4厘米长时，转入到不含有抗生素的诱导生根培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^-2>-1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；诱导生根后即成为完整的麻竹转基因植株，后移栽入土。

步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS+2,4-D 8 mg/L + IBA 0.5 mg/L+250 mg/L PVP+3g/L 山梨醇+ 30 g/L蔗糖。

步骤（1）中所述愈伤增殖培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250mg/L PVP+2mg/L 2,4-D。

步骤（2）中所述的农杆菌菌种为EHA105。

步骤（4）中所述的抗性愈伤扩增培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4-D+35 mg/L潮霉素+400 mg/L羧苄青霉素。

步骤（5）中所述的抗性芽诱导培养基的配方为：35 mg/L潮霉素+200 mg/L羧苄青霉素+MS培养基+蔗糖 30 g/L+ TDZ 0.1 mg/L + NAA 0.5 mg/L＋琼脂粉8 g/L。

步骤（6）中所述的诱导生根培养基的配方为：MS+IAA 1 mg/L+30 g/L 蔗糖+35mg/L潮霉素。

本发明的有益效果在于：

1）本发明使用农杆菌介导的高效转化体系，首次建立了麻竹的转基因体系。该体系能够突破克服传统的育种方法在竹类中无法应用的障碍；为将来通过转基因技术进行麻竹的分子育种提供前提；通过该方法，在基础研究领域为研究竹类基因功能提供了技术支撑；

2）本发明以以麻竹的茎端为起始外植体，构建转基因材料；选择侵染农杆菌的菌种是EHA105以增加转化效率；

3）农杆菌侵染菌液的配制中，控制农杆菌的浓度为OD 0.8，并采用含有200 μM的乙酰丁香酮的AMM液体培养基，该培养基培养的农杆菌能有效侵染愈伤组织；

4）所用的共培养的培养基为 NB，并需添加2,4-D 2mg/L和200 μM乙酰丁香酮以有利于提高农杆菌侵染性的同时，又不对植物组织造成过大的伤害。

附图说明

图1为农杆菌介导的麻竹转化及鉴定图，图中：（a）含有目的基因的农杆菌，包含潮霉素抗性基因HPTII和GUS；（b）转化的整个流程：i侵染之前的愈伤状态；ii抗性愈伤从褐化的母体中长出；iii抗性愈伤继代培养；iv抗性愈伤逐步产生胚性愈伤；v抗性愈伤开始分化产生芽点；vi>

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例

一种农杆菌介导的麻竹转化方法，具体包括以下步骤：

（1）外植体的准备：取生长于温室中的麻竹幼嫩茎端，切断后放置于洗涤剂中浸泡60分钟，后在自来水下冲洗2个小时。在无菌条件下在75%乙醇中浸泡1分钟后用无菌水漂洗5次，后再用0.1%的生汞灭菌8 分钟，再用无菌水冲洗6次。灭菌后的茎端切成1cm的小段，其中结节的部位位于末端伤口处；将切断后的茎端放置于愈伤诱导培养基上，进行暗培养，培养温度为26℃；1.5个月后，待诱导出愈伤组织后，移入到愈伤增殖培养基中，并在该培养基中培养7个月，产生淡黄色的胚性愈伤组织（图1中的（b）-i），并将其作为农杆菌侵染对象；

（2）农杆菌侵染菌液的制备：将含有目的基因Pcambia1301-GUS的农杆菌EHA105（图1中的（a））划线培养，随后转移至含有50 mg/L卡那霉素的YEB培养基中，并于28℃振荡培养过夜，然后按照1:100的体积比例将培养基稀释，并将其添加到含有50 mg/L的卡那霉素和200μM的乙酰丁香酮的YEB培养基中，继续培养至OD为0.6；离心后去除上清液，将所得菌液悬浮于含有200 μM的乙酰丁香酮的AMM液体培养基中，稀释至OD为0.8，得到农杆菌侵染菌液；

（3）侵染：将步骤（1）中增殖出胚性愈伤组织的外植体浸入步骤（2）得到的农杆菌侵染菌液中，真空处理（-0.8bar）15分钟后室温放置15分钟；取出侵染过的外植体，置于无菌台中，用灭菌的滤纸吸干表面菌液，后转入含有2 mg/L 2,4-D和200 μM乙酰丁香酮的NB培养基中，在25℃、黑暗条件下共培养4天；

（4）筛选：将步骤（3）共培养完毕的愈伤组织在400 mg/L的羧苄青霉素中清洗4遍，后在抗性愈伤扩增培养基中进行筛选培养，逐渐形成胚性愈伤组织，用于不定芽的诱导；所述筛选培养的条件为：26℃的黑暗条件下培养4个月；2个月左右会有新的抗性愈伤组织从母体中分离出来（图1中的（b）-ii），4个月左右的时间逐渐形成胚性愈伤(图1中的（b）-iii, -iv)；

（5）不定芽的诱导：将步骤（4）筛选培养得到的愈伤组织放置到抗性芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^-2>-1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；不定芽诱导培养后，在芽增殖培养基中进行不定芽伸长培养（图1中的（b）-v, -vi），培养条件为：光照条件下培养16>-2>-1；

（6）诱导生根：当再生的芽生长到3-4厘米长时，转入到不含有抗生素的诱导生根培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^-2>-1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；诱导生根后即成为完整的麻竹转基因植株（图1中的（b）-vii），后移栽入土（图1中的（b）-viii）。

（7）最后获得了17株阳性苗，其中12株经PCR验证后呈阳性（图1中的（c）），所用的引物为HPTII和35S特异性的引物，其序列为：

(Forward: 5’-TGCCATCATTGCGATAAAGGAAAG-3’) and HPTII>

步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS+2,4-D 8 mg/L + IBA 0.5 mg/L+250 mg/L PVP+3g/L 山梨醇+ 30 g/L蔗糖。

步骤（1）中所述愈伤增殖培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250mg/L PVP+2mg/L 2,4-D。

步骤（4）中所述的抗性愈伤扩增培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4-D+35 mg/L潮霉素+400 mg/L羧苄青霉素。

步骤（5）中所述的抗性芽诱导培养基的配方为：35 mg/L潮霉素+200 mg/L羧苄青霉素+MS培养基+蔗糖 30 g/L+ TDZ 0.1 mg/L + NAA 0.5 mg/L＋琼脂粉8 g/L。

步骤（6）中所述的诱导生根培养基的配方为：MS+IAA 1 mg/L+30 g/L 蔗糖+35mg/L潮霉素。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。