一株植物病原菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用

摘要

本发明公开了一株植物病原菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。该植物病原菌拮抗菌为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719。该植物病原菌拮抗菌类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719可以防治木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)、木薯棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)、木薯炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和木薯疫霉根腐病菌(Phytophthora palmivora)引起的植物病害；特别是可以与木薯共生，在木薯体内稳定的生存并防治木薯细菌性枯萎病。

说明书

技术领域

本发明涉及一株植物病原菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。

背景技术

植物内生细菌是指一生或至少一生中的某一阶段能进入活体植物组织内，且它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌。1926年Perotti在许多健康植物根组织内发现存在内生细菌，随后这方面的研究有了很大进展，在许多植物的不同组织内发现了多种内生细菌。这些内生细菌将植物组织作为栖息场所，且往往对宿主植物起到促生、防病虫、固氮、抗逆境(如干旱等)、抗动物(昆虫、食草哺乳动物等)摄食等作用，能够产生对宿主有利的活性代谢产物，还可作为外源基因载体而发挥作用，与病原菌不同，和植物是一种互利共生关系。

内生细菌在宿主植物体内稳定存在，并能长期发挥作用，因而利用拮抗性内生细菌进行病害防治有几个优点。首先，和抗病育种相比，拮抗性内生细菌能够起到类似抗病基因的作用而不需要进行抗病基因的分离以及相关的转基因试验操作，节省时间和资金，也不需要考虑转基因食品的生物安全性问题。其次，内生细菌存在于宿主组织内，基本不受外界环境(干燥、紫外线辐射、营养缺乏等)的影响，利用它进行病害防治可以获得比常规生物防治更稳定的防效。第三，内生菌在植物体内稳定存在，只需接种一次即可长期起到防病效果，和化学农药防治相比成本较低而且不存在环境污染问题。近年来，利用拮抗性内生细菌进行植物病害的生物防治已经成为人们研究的热点。植物内生细菌生防机制主要有产生抗生素、竞争生态位和营养、诱导宿主产生系统抗性、灭活病菌萌发因子、产生胞外酶溶解病原菌细胞壁和降解毒素等几种方式。

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科(Euphorbiaceae)木薯属灌木状多年生植物，是世界三大薯类作物之一。木薯块根富含淀粉，有地下粮仓、淀粉之王和特用作物的美誉，是热带地区的重要粮食作物。由地毯草黄单胞杆菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)侵染引起的细菌性枯萎病(也称为细菌性萎蔫病或细菌性疫病)是国内木薯生产中危害最为严重的病害，爆发流行后可造成木薯产量的巨大损失，是我国木薯相关产业发展的潜在限制性因素之一。细菌性枯萎病的田间初侵染来源为带病的植株、插条以及病株残留枝叶等。在自然条件下，病菌主要通过雨水的飞溅传播到健康的植株上。另外，病害也可通过染病的木薯种茎在不同的种植区域之间进行长距离传播。病原菌主要从木薯组织表面的气孔或伤口侵入，在茎杆和叶片组织内迅速繁殖，导致一系列症状的出现。采用化学药剂防治存在成本高、污染环境等问题，而且药剂在杀死病原菌的同时也抑制有益菌的生长，破坏土壤的微生态，对农田环境造成很大的不利影响。应用内生细菌防治植物病害已经有很多的报道，而有关运用木薯内生细菌防治木薯病害在国内外还没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物病原菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。

本发明所提供的植物病原菌拮抗菌为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33CGMCC No.12719。

所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33，已于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.12719。

所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719为革兰氏阴性杆菌，菌落在NA平板上呈乳白色，形状不规则，表面光滑，且粘稠程度高，边缘有较高隆起。菌体短杆状近球形，有荚膜，大小为(0.6-0.8)μm×(1.0-1.2)μm，革兰氏染色为阴性。

以上述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

实验证明，本发明的植物病原菌拮抗菌为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33CGMCC No.12719对木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.Manihotis)、木薯棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)、木薯炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和木薯疫霉根腐病菌(Phytophthora palmivora)等病原菌都有较强的抑菌作用，具有对这些病原菌引起的病害起到防治作用的潜力。

本发明的植物病原菌拮抗菌为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33，分离自健康木薯植株体内，是一株木薯内生细菌，实验证明该菌株接种木薯后能够在木薯植株组织内部稳定存在并能有效防治木薯细菌性枯萎病，为木薯细菌性枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。

附图说明

图1为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯细菌性枯萎病菌的抑菌作用。

图2为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯棒孢霉叶斑病菌的抑菌作用。

图3为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯炭疽病菌的抑菌作用。

图4为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯疫霉根腐病菌的抑菌作用。

图5为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯细菌性枯萎病的盆栽叶片防治作用。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、植物病原菌拮抗菌的筛选及其鉴定

1、植物病原菌拮抗菌的筛选

本发明的菌株是从健康木薯叶片(木薯品种为华南8号)内部分离到的，具体方法为：称取1g叶片，并剪成5mm×5mm的小块，放入70％的酒精中，60s后用无菌水冲洗一次，再放入3.25％的次氯酸钠中，5min后用无菌水反复冲洗。放入有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min。取1mL稀释至10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基(配方：蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)平板上，以最后1次洗过样品的无菌水为对照。28℃倒置培养，连续观察7天，挑取菌落形态不同的细菌菌株，再次划线纯化保存备用。

将木薯细菌性枯萎病菌(卢昕，李超萍，时涛，等.国内木薯主产区细菌性枯萎病病原鉴定.广东农业科学，2013，40(21)：84-87)悬浮液2mL(28℃，摇床培养24小时，OD₆₀₀值约为2.5)加入灭菌后冷却至45℃左右的15mL>600值约0.8的悬浮液，在带菌平板的中央接种2微升菌液，同时将不接种其它细菌的带菌平板在相同条件下培养作为对照，筛选抑菌作用最强(抑菌圈最大)的菌株，结果得到一株对木薯细菌性枯萎病菌具有较强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为CEB33。

2、CEB33菌株的种属鉴定

采用常规生理生化及16s rDNA序列分析对CEB33菌株进行鉴定，确认该菌株属于类芽孢杆菌。该菌株的基本生理生化特性见表1。

表1.CEB33菌株的基本生理生化特性

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应

CEB33菌株菌落在NA平板上呈乳白色，形状不规则，表面光滑，且粘稠程度高，边缘有较高隆起。菌体短杆状近球形，有荚膜，大小为(0.6-0.8)μm×(1.0-1.2)μm，革兰氏染色为阴性。生化试验结果表明，CEB33能氧化葡萄糖产酸，具有运动性，好氧，V-P反应阳性，接触酶反应呈阴性，能还原硝酸盐和水解淀粉，能在含质量百分含量为2﹪以下氯化钠的NB培养液(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH 7.0)中生长，依据《常见细菌鉴定手册》，CEB33菌株以上生理生化特征均与类芽孢杆菌相同。

以CEB33菌株的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物作为引物，PCR扩增出约为1.3kb左右的产物片段，测序结果表明序列长度为1255个碱基，具有序列表中序列1的核苷酸序列；将该序列与类芽孢杆菌属的其他菌株进行blast对比，结果表明类芽孢杆菌CEB33的16S rDNA序列与类芽孢杆菌Paenibacillus kribbensis的同源性高达99％(NCBI登录号NR025169.1)。

结合上述生理生化特征和分子鉴定，将该CEB33菌株的分类地位确定为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，具体为类芽孢杆菌(Paenibacillus Ash)，因此将其命名为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33。

该类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33菌株，已于2016年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.12719。

3、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719对木薯细菌性枯萎病菌的拮抗活性遗传稳定性鉴定

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719接种在NA斜面培养基上，28℃培养24小时，4℃冰箱保存，15天后再接种NA斜面培养基，28℃培养24小时，4℃冰箱保存。按此方法连续转接培养20代后，活化第5、10、15和20代菌株，按照实施例1植物病原菌拮抗菌的筛选中所述的方法测定其抑菌活性，结果表明各世代所活化的菌体抑菌活性均与初始菌株一致，表明其拮抗活性是稳定遗传的。

实施例2、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719抑菌谱测定

按照实施例1中的方法，将CEB33与木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC03517)共同培养(图1)。该菌株对木薯细菌性枯萎病菌拮抗作用结果如图1所示，结果表明筛选得到的菌株对木薯细菌性枯萎病菌具有很强的拮抗作用。图1中Ⅱ为CEB33和木薯细菌性枯萎病菌对峙培养试验，Ⅰ为对照木薯细菌性枯萎病菌生长情况。该菌株对木薯细菌性枯萎病菌有良好的抑制效果，抑菌圈直径为1.7cm(如图1所示)。

用PDA培养基平板(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)将供试病原菌[木薯棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.3.14168)、木薯炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)(蔡吉苗，李超萍，时涛，等.木薯炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究.安徽农业科学,2010，38(10)：5435-5438，5467)、木薯疫霉根腐病菌(Phytophthora palmivora)(卢昕，李超萍，裴月令，等.木薯疫霉根腐病病原初步鉴定及其生物学特性测定.热带农业科学，2014，34(8)：59-62)]在28℃培养7天后，用无菌打孔器打取直径5毫米的菌饼备用。用NB液体培养基(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH 7.0)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719在28℃，摇床培养24小时(OD₆₀₀值约为2.5)。将各病原菌菌饼接种在新制备的PDA培养基平板中央(平板直径9厘米)，用接种环蘸取类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)CEB33的菌液，在菌饼两侧约3cm处进行划线接种，以不接种类芽孢杆菌(Paenibacillus>

实施例3、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719的内生性测定

1、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719的氨苄霉素耐性菌体的获得

将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33接种含10μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基(配方：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)中，摇菌培养约48小时至菌液变浑，取少量培养的菌液接种至含有15μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基，摇菌培养至菌液变浑。按此方法逐步增加氨苄青霉素的浓度进行培养，最终获得能在含有浓度为300μg/mL氨苄的LB培养基上稳定生长、且菌落形态及对病原菌的拮抗作用等均保持不变的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719菌体，按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719一致后保存备用。

2、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719内生性测定

通过针刺法将步骤1获得的氨苄霉素耐性的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33菌体(28℃、180rpm，NB培养液培养至OD₆₀₀值约0.5)接种于长有3～4叶的木薯苗内，分别于第3、5、7、9、15、20、25、30天按照步骤1)的方法对接种植株取样表面消毒后研磨均匀取100μL的研磨液涂布于分别含有300μg/mL的氨苄霉素的NA培养基平板上，28℃下培养3～5天，以接种了无菌水木薯苗为对照，结果在各个时间段所取样品中均分离获得和接种时同样的单一白色菌落，而对照则无类似的菌落形成。按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性，表明该菌落为类芽孢杆菌(Paenibacillus>

实施例4、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719的对木薯盆栽苗细菌性枯萎病的防治

将菌株CEB33和木薯细菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.Manihotis简称Xam，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 03517)分别接种至液体NB培养液，28℃、180rpm，条件下培养至OD₆₀₀值约0.5。选取长势一致，种植90天的木薯品种华南8号盆栽苗，采用剪叶法在木薯叶片上接种Xam，采用喷雾法在木薯叶片上接种CEB33，分别设4个处理：1、先接种CEB33>

测量病斑面积并按下式计算病斑抑制率：病斑抑制率(％)＝(对照病斑总面积－处理病斑总面积)×100/对照病斑总面积。结果表明，先接种CEB33后1d后接种Xam的处理病斑抑制率达63.4±2.3％(图5中Ⅲ)，同时接种CEB33和Xam的处理病斑抑制率达45.4±6.5％(图5中Ⅱ)，可见类芽孢杆菌CEB33对木薯盆栽苗细菌性枯萎病具较好的防治效果。

实施例5、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CEB33 CGMCC No.12719的对木薯大田细菌性枯萎病的防治

2015年，在海南省文昌市迈号镇选择地势平坦，土质疏松，土壤肥力中等，上一茬种植木薯且细菌性枯萎病(卢昕，李超萍，时涛，等.国内木薯主产区细菌性枯萎病病原鉴定.广东农业科学，2013，40(21)：84-87)发生较严重的田块进行了CEB33对木薯枯萎病的防效试验。供试木薯品种为华南9号。试验共设3个处理和1个空白对照：CEB33菌液(OD₆₀₀值约为0.6)、可杀得叁千(46％氢氧化铜WDG，美国杜邦公司生产，稀释1500倍)、净刹(80％乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司生产，稀释3000倍)及空白对照(清水)，每个处理重复3次，共12个小区，小区面积100m²，小区间设3行保护行，木薯行距100cm，株距60cm。3次施药时间分别为8月26日、9月5日和9月15日。9月25日调查时发现3个处理均无药害产生。采用五点取样法对各个处理小区进行调查，每个小区调查5个点，每个点3株木薯，共15株；在每株木薯的上、中、下部不同部位各取5张复叶，共取复叶15张。按照以下标准进行分级：0级：无任何病斑；1级：病斑总面积占叶片总面积1/16以下；3级：病斑总面积占叶片总面积1/16～1/8；5级：病斑总面积占叶片总面积1/8～1/4；7级：病斑总面积占叶片总面积1/4～1/2；9级：病斑总面积占叶片总面积1/2以上或叶片变黄凋萎。按照以下公式计算各小区的病情指数，计算病害减退率，求取校正防效的平均值和标准差，用SAS9.0软件进行差异显著性分析。

病情指数＝(Σ各病级叶片数×相应病级数值)/(调查总叶片数×最高病害级数)×100

病害减退率＝(防治前病情指数－防治后病情指数)/防治前病情指数×100％

校正防效＝(各处理病害减退率-对照病害减退率)/(100－对照病害减退率)×100％。

结果表明，CEB33菌液对木薯细菌性枯萎病田间校正防效达57.64±3.41％，优于药剂46％氢氧化铜WDG(校正防效为37.21±3.05％)，但差于80％乙蒜素EC(校正防效为73.26±1.68％)，说明菌株CEB33可应用于木薯细菌性枯萎病的生物防治。

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 一株植物病原菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用

<130> WHOI170042

<160> 1

<210> 1

<211> 1255

<212> DNA

<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) CEB33

<400> 1

aaaaatttac atgaattacg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagattaaca 60

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gctaggtgtt aggggtttcg 120

atacccttgg tgccgaagtt aacacattaa gcattccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 180

ctgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg 240

aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatccctct gaccggtcta gagatagatc 300

tttccttcgg gacagaggag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 360

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatgctta gttgccagca ggtaaagctg 420

ggcactctaa gcagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 480

catgcccctt atgacctggg ctacacacgt actacaatgg ccggtacaac gggaagcgaa 540

atcgcgaggt ggagccaatc ctagaaaagc cggtctcagt tcggattgta ggctgcaact 600

cgcctacatg aagtcggaat tgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 660

cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tacaacaccc gaagtcggtg 720

gggtaacccg caagggagcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg tgaactcgta 780

acaaggtagc cgtaaatcgt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 840

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 900

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 960

gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttc tccgtacgca tctgtgcggt 1020

atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080

agcccggaca cccgcaacaa cccgctgacg ccgcctgacg gcttgtctgc tccggcatcc 1140

gcttaacgaa cagctgtgac gtctcaggaa gctgcaagtg tcaaggttca ccgtcataca 1200

cgacgcggaa cgaggccctc ggtatcgcct atttaatagg taagggtcag tggaa 1255