一种黄芩的组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明涉及一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，首先将野外采集健壮新鲜的黄芩的茎，经多次漂洗后置于超净工作台紫外灯下照射处理10‑25min，得到无菌外植体，然后依次经过诱导培养、增殖培养和生根培养得到生根的无菌苗，最后将健壮的，叶片较多，根系长度大于2cm的无菌苗进行炼苗和移栽。本发明发方法简单，步骤易于操作，能够克服黄芩出芽率低、繁殖速度慢的缺点，通过组织培养的方法，建立黄芩组织培养体系，有效提高繁殖系数，促进生长，提高黄芩的繁殖力度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，属于生物繁殖技术领域。

背景技术

黄芩具有清热解毒，镇痛消炎等药理作用，近年来研究表明，黄芩还具有较强的抗癌抗氧化、抗病毒抗HIV的作用，且生物安全性高等特点，使得黄芩的应用和开发受到医学界的关注，市场需求量逐年上升，野生资源遭到掠夺性破坏，虽有栽培，但是市场仍然供不应求，加上黄芩种子出芽率低，繁殖速度慢，近年来，黄芩作为宿根花卉也逐渐用于园林绿化方面，如何快速有效繁殖黄芩成为目前制约其发展的重要因素之一。

发明内容

本发明的目的是为了解决黄芩种子出芽率低，繁殖速度慢的问题，提供了一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，通过组织培养的方法，缩短黄芩的培养时间，使黄芩能够快速、大规模繁殖缓解了市场上供不应求的困境。

本发明采用如下技术方案：一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获得：将野外采集健壮新鲜的黄芩的茎，经多次漂洗后置于超净工作台紫外灯下照射处理10-25min，得到无菌外植体；

(2)诱导培养：将无菌外植体取茎段切除叶片，将茎节段切成1-2cm节段，保留一个节，每个茎段上带有腋芽；将切好的茎节段接种到不定芽的诱导培养基上；首先暗培养3-5天，然后在20-25℃温度下光培养25-30天；

(3)增殖培养：将长出的丛生不定芽切下，切成小的丛生芽，接种到增殖培养基中，6-7天后，丛生芽基部长出新的丛生芽，25-30天转接一次，将新的丛生芽接种到增殖培养基中继续增殖培养；

(4)生根培养：选取生长健壮，高度为3-5cm的丛生苗切成单株接种到生根培养基中，然后置于4-5℃环境暗期培养1-2天，然后置正常环境培养，培养条件为白天20-25℃，夜间10-15℃，保持温差5-10℃，光照为2000-3000lx，光照时间为10-12h，待无菌苗下部长出根；

(5)炼苗与移栽：将步骤(4)中健壮的，叶片较多，根系壮的，根系长度大于2cm的无菌苗进行炼苗；在组培室拧松瓶盖2-3天后打开瓶盖3-4天，使其逐渐适应环境，并用注射器浇灌；6-7天后清洗干净根部的培养基，移栽入营养钵，置于光照培养箱培养5-7天，光强为2000-3000lx，照射10-12h，温度为15-25℃；然后将其移至大棚内，遮阴。

进一步的，所述步骤(1)中漂洗前用自来水冲洗2-3h；在灭菌烧杯中用70-75％的乙醇漂洗15-45s、无菌水漂洗4-6次、0.1％氯化汞消毒4-8min、再用无菌水漂洗4-6次后，将消毒并漂洗多次后的黄芩茎全部浸泡在无菌水中，用无菌滤纸吸干多余水分。

进一步的，所述步骤(2)中的光培养条件为：光照强度为2000-3000lx，光照时间为10-12h。

进一步的，所述步骤(2)中的诱导培养基为MS+1-3mg/L BA+0.1-0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH为5.8。

进一步的，所述步骤(3)中的增殖培养基为MS+0-0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH为5.8。

进一步的，所述步骤(4)中的生根培养基为1/2MS+0.5-1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH为5.8。

进一步的，所述步骤(3)中增殖培养条件为：白天20-25℃，夜间10-15℃，保持温差5-10℃，光照为2000-3000lx，光照时间为10-12h。

步骤(1)中无菌外植体的获得时采用紫外线照射处理诱导的不定芽明显粗壮，且腋芽数量多；经过紫外照射处理的平均诱导率为62.37％，而不经紫外照射处理的平均诱导率仅为39.5％；

步骤(2)中经过暗培养的处理明显高了黄芩不定芽的诱导率，且不定芽芽点明显是不进行暗培养对照组的1.5倍以上；

步骤(3)中切成丛生不定芽接种增殖效果比切单株培养的增殖效果提高了1.5倍以上，其原因是小的丛生芽基部能完好的保留未完全分化或已分化的小的芽原基，而切成单株破坏了基部还未完全分化的芽原基；步骤(3)中适度的温差促进有机物质的积累，促进植物的生长；

步骤(5)中适当的拧松瓶盖2-3天后打开瓶盖3-4天，使得植物与外界环境逐渐适应，起到过渡期的作用，有效的提高了黄芩小苗移栽的成活率，最高能达到98.5％。

本发明发方法简单，步骤易于操作，能够克服黄芩出芽率低、繁殖速度慢的缺点，通过组织培养的方法，建立黄芩组织培养体系，有效提高繁殖系数，促进生长，提高黄芩的繁殖力度。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例一：

一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获得：将野外采集的健壮新鲜的黄芩的茎，完全浸入水中，用自来水冲洗2h；取出后置于超净工作台上，取灭菌过的烧杯将幼苗放入，用75％的乙醇漂洗15s、无菌水漂洗4次、0.1％氯化汞消毒4min、再用无菌水漂洗4次后，用无菌滤纸吸干多余水分后，获得无菌外植体进行接种；

(2)诱导培养：将处理好的无菌外植体，取茎段，切除叶片，将茎节段切成1cm节段，保留一个节，每个茎段上带有腋芽；将切好的茎节段接种到不定芽的诱导培养基上；诱导培养基为：MS+1mg/L BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8，诱导条件为20℃光培养，光照为2000lx，光照时间为12h，培养30天；

(3)增殖培养：将长出的丛生不定芽切下，切成小的丛生芽，接种到增殖培养基中，6天后丛生芽基部会长出很多丛生芽，30天转接一次，将新的丛生芽接种到增殖培养基中继续增殖培养；增殖培养基为：MS+1mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8；培养条件为20℃光培养，光照为2000lx，光照时间为12h；

(4)生根培养：选取生长健壮，高度在3cm的丛生苗切成单株接种到生根培养基中，生根培养基为1/2MS+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，PH5.8，25d后，无菌苗下部长出根，主根长度4cm。

(5)炼苗与移栽：将健壮的，叶片较多，根系壮且根系长度大于2cm的无菌苗进行炼苗；在组培室拧松瓶盖3天后打开瓶盖3天，使其逐渐适应环境，期间适当用注射器浇灌少量水；6天后清洗干净根部的培养基，移栽入营养钵，置于光照培养箱培养5天，光强为3000lx，照射10h，温度为15℃；之后将其移至大棚内，适当遮阴。

实施例二：

一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获得：将野外采集的健壮新鲜的黄芩的茎，完全浸入水中，用自来水冲洗3h；取出放入盘子置于超净工作台上，取灭菌过的烧杯将幼苗放入，用70％的乙醇漂洗30s、无菌水漂洗5次、0.1％氯化汞消毒6min、再用无菌水漂洗5次后，用无菌滤纸吸干多余水分后，获得无菌外植体进行接种。

(2)诱导培养：将处理好的无菌外植体，取茎段，切除叶片，将茎节段切成2cm节段，保留一个节，每个茎段上带有腋芽；将切好的茎节段接种到不定芽的诱导培养基上；诱导培养基为：MS+2mg/L BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8，诱导条件为25℃光培养，光照为2500lx，光照时间为12h，培养25天。

(3)增殖培养：将长出的丛生不定芽切下，切成小的丛生芽，接种到增殖培养基中，一周以后，丛生芽基部会长出很多丛生芽，25天转接一次，将新的丛生芽接种到增殖培养基中继续增殖培养；增殖培养基为：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8；培养条件为25℃光培养，光照为2500lx，光照时间为12h。

(4)生根培养：选生长健壮，高度在4cm左右的丛生苗切成单株接种到生根培养基中，生根培养基为1/2MS+0.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8，25天后，无菌苗下部长出根，主根长度5cm。

(5)炼苗与移栽：取健壮的，叶片较多，根系壮且根系长度大于4cm的无菌苗进行炼苗；在组培室拧松瓶盖2天后打开瓶盖4天，使其逐渐适应环境，期间可以适当用注射器浇灌少量水；7天后清洗干净根部的培养基，移栽入营养钵，置于光照培养箱培养6天，光强为3000lx，照射12h，温度为20℃；之后将其移至大棚内，适当遮阴。

实施例三：

一种黄芩的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(1)无菌外植体的获得：将野外采集的健壮新鲜的黄芩的茎，完全浸入水中，用自来水冲洗2h；取出放入盘子置于超净工作台上，取灭菌过的烧杯将幼苗放入，用75％的乙醇漂洗45s、无菌水漂洗6次、0.1％氯化汞消毒8min、再用无菌水漂洗6次后，用无菌滤纸吸干多余水分后，获得无菌外植体进行接种。

(2)诱导培养：将处理好的无菌外植体，取茎段，切除叶片，将茎节段切成2cm节段，保留一个节，每个茎段上带有腋芽；将切好的茎节段接种到不定芽的诱导培养基上；诱导培养基为：MS+3mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，PH5.8，诱导条件为25℃光培养，光照为3000lx，光照时间为12h，培养30天。

(3)增殖培养：将长出的丛生不定芽切下，切成小的丛生芽，接种到增殖培养基中，一周以后，丛生芽基部会长出很多丛生芽，30天转接一次，将新的丛生芽接种到增殖培养基中继续增殖培养；增殖培养基为：MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8；培养条件为5℃光培养，光照为3000lx，光照时间为12h。

(4)生根培养：选生长健壮，高度在5cm左右的丛生苗切成单株接种到生根培养基中，生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，pH5.8，25天后，无菌苗下部长出根，主根长度4.2cm。

(5)炼苗与移栽：选生长健壮的，叶片较多，根系壮且根系长度大于3cm的无菌苗进行炼苗；在组培室拧松瓶盖3天后打开瓶盖4天，使其逐渐适应环境，期间可以适当用注射器浇灌少量水；7天后清洗干净根部的培养基，移栽入营养钵，置于光照培养箱培养7天，光强为3000lx，照射12h，温度为25℃；之后将其移至大棚内，适当遮阴。

不同浓度的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基对黄芩的组织培养过程中具有不同的影响，具体见表1-表3。

表1为诱导培养基对黄芩不定芽的诱导作用

由表1可知，当诱导培养基中BA含量为1-3mg/L且NAA含量为0.1-0.5mg/L时对黄芩不定芽的诱导作用最佳。

表2为不同浓度增殖培养基对黄芩无菌苗增殖的影响

处理基本培养基NAA(mg/L)生长情况1MS0不定芽生长健壮，基部新鲜2MS0.25不定芽生长健壮，基部有少许老化3MS0.5不定芽生长较为健壮，基部组织较多老化4MS0.75不定芽较为细弱，基部组织较多老化5MS1不定芽生长细弱，基部老化严重

由表2可知，当NAA浓度为0.1-0.5mg/L时，黄芩无菌苗的不定芽生长健壮，当不添加NAA或是NAA浓度达到0.75mg/L以上时，不定芽生长细弱，基部组织老化现象逐渐严重。

表3为生根培养基对黄芩无菌苗生根诱导的影响

由表3可知，生根培养基为1/2MS+0.5-1mg/L IAA时对黄芩无菌苗生根的诱导效果最佳，此时黄芩无菌苗根长，粗壮、岔根少，生长旺盛，地上部分新鲜。

表4所示为，增殖培养时采用不同接种类型且培养温差不同对增殖系数的影响。

表4

由表4可知，选用丛生芽为接种对象，且培养温差为5-10℃的条件下平均增殖系数最大为9.34，采用单株时同样温差情况下，平均增殖系数仅为5.95。

表5为生根培养过程中不同暗期培养和不同昼夜温差对黄芩生根率的影响，

表5

由表5可知，生根培养过程中经过1-2天的暗期培养后保持温差为5-10℃能使得黄芩的生根率达到85％以上，当暗期培养1天，温差为5℃时生根率最高能达到98.9％。

表6为炼苗与移栽过程中拧松瓶盖打开瓶盖使幼苗适应外界环境对移栽成活率的影响。

表6

由表6可知，适当的拧松瓶盖3-4d，使得植物与外界环境逐渐适应，起到过渡期的作用，有效的提高了黄芩小苗移栽的成活率，最高能达到98.5％。