单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法

摘要

本发明涉及一种针对存在单核苷酸多态性的靶核酸使用的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针，其包含报告区域、锚固区域和接头区域。报告区域具有由在单核苷酸多态性的核苷酸为第一核苷酸时完全匹配、在为除第一核苷酸以外时不匹配的碱基序列构成的寡核苷酸、和报告区域与靶核酸杂交时发生消光的荧光色素。

说明书

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法。

背景技术

在哺乳类等多细胞生物或者细菌、病毒等生物的基因水平中，以一定频率可见的核酸在碱基序列上的一些差异被称为基因变异。核酸在碱基序列上的差异是因替换、插入、缺失或者重组而发生的。其在碱基序列上的差异中，特别地将某些群体内以1％以上的频率存在的变异称为基因多态性。

基因多态性中，特别地将因碱基序列上的单碱基替换引起的多态性称为单核苷酸多态性(以下有时也省略地记为“SNP：Single Nucleotide Polymorphism”)。SNP因在人基因组中可见的变异中出现频率最高而受到关注。即，这是因为期待有可能通过收集与基因多态性的位置和变动有关的信息，将个体基因与具有通常表现型的野生型基因进行比较，对多态性的有无与表现型之间的关联性进行分析，从而获得大量信息。

另外，由于基因多态性以一定的频率在群体中广泛存在，因此并不是完全不伴随性状变化的基因多态性、或者特别是对生存(生殖)不利的性状、换言之控制可称为遗传特征的性状的基因多态性受到关注。例如，已知罹患糖尿病、高血压、肥胖等生活习惯病、风湿病、过敏症等免疫疾病、或者癌症等疾病的难易性由多态性控制。此外认为，药剂代谢(药物发挥药效的方式)及人白细胞组织适合型抗原等也由多态性支配。另外，认为不限于人、细菌的几种耐药性也由特定的基因中的SNP决定。因此期待SNP分析对于根据个体基因的类型给予最适药剂的定制医疗、及近年成为问题的多药耐性病原菌的鉴定是有用的。

到目前为止开发了各种SNP的检测方法及检测探针。作为检测方法，可列举出例如荧光标记探针法。该方法为根据荧光标记探针与作为靶的核酸在完全匹配或不匹配时的杂交效率之差，判断作为靶的核酸的碱基序列中是否存在SNP的方法。因此，探针越短、SNP的检测灵敏度越上升，但过短时，与作为靶的碱基序列的结合力降低、存在变得无法杂交的问题。为了解决这样的问题，到目前为止开发了包含用于检测SNP的区域、用于识别SNP附近的碱基序列的区域、和用于将这两个区域连接的区域的荧光标记探针(专利文献1及2)。

专利文献1公开了一种寡核苷酸，其包含：(a)与靶核酸的核酸残基的第一序列互补的核酸区域及(b)包含至少1个交联区及至少1个结合区的可变区，其中，在该区域(a)与该靶核酸的核酸残基的该第一序列形成稳定的双链的条件下，该可变区可区分出：(i)与该结合区互补的该靶核酸的核酸残基的第二序列和(ii)包含与该结合区不互补的至少1个核酸残基的该靶核酸的核酸残基的第二序列。另外，专利文献1中记载了，交联区包含通用碱基或者非氢键的天然碱基或它们的类似物、或者通用碱基及非氢键的天然碱基或它们的类似物的混合物。

专利文献2中公开了一种探针，其是进行了可检测标记的探针，当该探针包含锚固核酸区及报告基因核酸区，并且锚固与报告区通过非核苷接头连接，在靶核酸不存在时锚固及报告区均不形成茎环，并且(i)所述探针不会在聚合酶作用下延伸、(ii)所述接头在锚固区的3’末端的2个核苷酸内与锚固区结合、且在报告区的5’末端的2个核苷酸内与报告区结合、锚固区不与可检测的标记结合。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2006-525027号公报

专利文献2：日本特表2013-501508号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，专利文献1中记载的寡核苷酸为了形成规定的结构，交联区必须具有通用碱基等。因此，存在该寡核苷酸的探针设计的自由度低、并且寡核苷酸合成时与仅使用通常的碱基相比更为昂贵的问题。另外，专利文献2中记载的探针由于接头为非核苷酸，因此锚固核酸区及报告基因核酸区必须准备不同的接头，然后对它们进行合成，因此存在探针的合成费工夫的问题。

因此，本发明的目的在于提供合成简便且廉价、并且能够准确且高灵敏度地检测SNP的存在的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针。本发明的目的还在于提供使用了上述寡核苷酸探针的检测单核苷酸多态性的方法。

用于解决课题的方法

本发明提供一种探针，其为针对存在单核苷酸多态性的靶核酸使用的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针，其中，上述靶核酸包含存在单核苷酸多态性的区域即第一靶碱基序列、和位于上述第一靶碱基序列的3’或5’侧且不存在单核苷酸多态性的区域即第二靶碱基序列，上述探针包含用于检测单核苷酸多态性的报告区域、锚固区域和接头区域，上述报告区域具有由与上述第一靶碱基序列在单核苷酸多态性的核苷酸为第一核苷酸时完全匹配、在为除上述第一核苷酸以外时不匹配的碱基序列构成的寡核苷酸、和与上述第一靶碱基序列及所述报告区域杂交时发生消光的荧光色素，上述锚固区域具有由与上述第二靶碱基序列互补的碱基序列构成的寡核苷酸，上述接头区域将上述报告区域及上述锚固区域连接，具有由与上述靶核酸中的上述第一靶碱基序列及上述第二靶碱基序列之间的碱基序列不互补的碱基序列构成的寡核苷酸。

关于本发明的探针，与用于检测SNP的报告区域不同，无论有无SNP，通过具有与靶碱基序列结合的锚固区域而能够确保探针的结合性。因此，本发明的探针为了准确的SNP检测，能够将报告区域设计得较短。即，本发明的探针能够比通常的探针更准确且高灵敏度地检测SNP。另外，本发明的探针由于由寡核苷酸构成，因此能够简便且廉价地合成。

上述报告区域的寡核苷酸的长度优选比上述锚固区域的寡核苷酸的长度短。通过如此设计报告区域及锚固区域，有能够兼顾探针与靶核酸良好的结合性、以及检测SNP时的良好准确性及检测灵敏度的倾向。

上述接头区域优选为由不含有通用碱基的碱基序列构成的寡核苷酸。通过接头区域不使用通用碱基，能够更为廉价地合成探针。

上述接头区域优选为仅由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、或胸腺嘧啶中的任1种碱基构成的寡核苷酸。由此，探针的接头区域与靶核酸结合的可能性降低，因此报告区域的自由度增加、能够进一步提高SNP的检测能力。另外，通过使接头区域仅由上述碱基构成，能够更为廉价地合成探针。

上述接头区域优选为由3～11个核苷酸构成的寡核苷酸。由此，由于与靶核酸结合的锚固区域与报告区域分开一定的距离，报告区域的自由度增加，能够进一步提高SNP的检测能力。

本发明还提供一种用于检测单核苷酸多态性的方法，其具备：将上述本发明的探针及存在单核苷酸多态性的靶核酸混合、制备混合液的工序、测定上述混合液的荧光强度的工序、和基于上述荧光强度检测有无上述靶核酸的单核苷酸多态性的工序。

根据本发明的方法，由于使用本发明的探针，因此基于其荧光强度能够比通常的探针更为准确且高灵敏度地检测SNP。

发明效果

根据本发明，能够提供不仅合成简便且廉价、而且能够准确且高灵敏度地检测SNP的存在的单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针。本发明还能够提供使用了上述寡核苷酸探针的检测单核苷酸多态性的方法。

附图说明

图1为使用本发明的探针检测SNP的机理的示意图。

图2表示使用SNP-寡DNA时的Tm分析的结果。

图3表示使用接头型SNP-寡DNA时的Tm分析的结果。

图4表示使用改变了间隔长度及接头长度的接头型SNP-寡DNA时的25℃下的Tm分析的结果。

图5表示对各种合成DNA使用接头型QProbe结合探针时的Tm分析的结果。

图6表示LAMP法中的模板DNA的扩增效率。

图7表示使用各种GST-QP探针时的Tm分析的结果。

图8表示PCR法中的模板DNA的扩增效率。

图9表示使用各种GST-QP探针时的Tm分析的结果。

具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式(以下称为“本实施方式”)详细地进行说明。需要说明的是，本发明并不限定于以下实施方式。

本说明书中，“单核苷酸多态性(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)”是指因碱基序列上的单碱基的替换而产生的多态性。

本说明书中，“靶核酸”是指用于使用本实施方式的探针确认有无SNP的作为对象的核酸。靶核酸包含存在SNP的区域即第一靶碱基序列、和与第一靶碱基序列不重复、位于第一靶碱基序列的3’或5’侧且不存在SNP的区域即第二靶碱基序列。

本说明书中，“完全匹配”是指报告区域的碱基序列具有与靶核酸中的第一靶碱基序列完全互补的序列，因此第一靶碱基序列与报告区域发生杂交。与此相对，“不匹配”是指报告区域的碱基序列与靶核酸中的第一靶碱基序列具有1个碱基上的不同的序列，因此第一靶碱基序列与报告区域无法杂交。

靶核酸包含第一靶碱基序列和第二靶碱基序列。第一靶碱基序列及第二靶碱基序列可以由已知存在SNP的核酸的碱基序列事先确定。

第一靶碱基序列优选为由已知存在SNP的核酸的碱基序列中包含可加入欲检测的SNP的碱基的3～6个核苷酸构成的区域。第一靶碱基序列更优选为由3～5个核苷酸构成的区域、进一步优选为由4个核苷酸构成的区域。第一靶碱基序列中，可加入SNP的碱基的位置没有特殊限定，优选在第一靶碱基序列的中心附近。

第二靶碱基序列优选为由与第一靶碱基序列不重复、位于第一靶碱基序列的3’侧或5’侧且不存在SNP的区域的10～20个核苷酸构成的区域。第二靶碱基序列更优选为由12～18个核苷酸构成的区域、进一步为由15个核苷酸构成的区域。

第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的3’侧时，从第一靶碱基序列的3’末端至第二靶碱基序列的5’末端的核苷酸的数量(间隔)优选为0～15个、更优选为3～12个、进一步优选为4～10个。通过将第一靶碱基序列及第二靶碱基序列的间隔设定在上述范围，能够在本实施方式的探针中的报告区域及锚固区域之间保持适当的距离，因此有SNP的检测能力提高的倾向。另外，由于还可以根据第一靶碱基序列及第二靶碱基序列的间隔设定接头区域的长度，因此不需要合成多余的核苷酸，有经济上也优异的倾向。第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的5’侧时，能够将从第一靶碱基序列的5’末端至第二靶碱基序列的3’末端的核苷酸的数量设定在上述范围内。

作为本实施方式中的靶核酸，可列举出DNA或RNA。作为靶核酸的来源，只要包含DNA或RNA则没有特殊限定，可列举出例如动物、植物、菌类、微生物、病毒等。另外，靶核酸的制备方法也没有特殊限定，可由生物体或病毒直接制备，也可以由特定的组织制备，可以从作为模板的核酸人工克隆进行制备，也可以使用通过PCR法或LAMP法得到的扩增产物。

<探针>

本实施方式的探针包含用于检测单核苷酸多态性的报告区域、锚固区域和接头区域。本实施方式的探针中，报告区域及锚固区域的位置关系可以根据靶核酸中所设定的第一靶碱基序列及第二靶碱基序列的位置关系来适当设定。例如，第二靶碱基序列位于第一靶碱基序列的3’侧时，锚固区域可配置在报告区域的5’侧。

本实施方式的探针与用于检测SNP的报告区域不同，通过具备无论有无SNP均可与靶碱基序列结合的锚固区域、能够确保探针的结合性。由此，能够将用于准确的SNP检测的报告区域设计得较短。因此，本实施方式的探针能够与通常的探针相比更为准确且高灵敏度地检测SNP。

作为本实施方式的探针的制造方法，没有特殊限定，可列举出例如使用了化学合成法的通常的寡核苷酸的合成方法等。本实施方式的探针由于由通常的寡核苷酸构成、不需要复杂的合成方法，因此能够简便且廉价地进行制造。

(报告区域)

报告区域为用于检测SNP的区域。报告区域为由与第一靶碱基序列在单核苷酸多态性的核苷酸为第一核苷酸时完全匹配、在为除第一核苷酸以外时不匹配的碱基序列构成的寡核苷酸。本说明书中，“第一核苷酸”是指靶核酸中可加入欲检测的SNP的碱基。例如，第一核苷酸在为不存在SNP时的靶核酸的核苷酸时，报告区域与第一靶碱基序列在不存在SNP时完全匹配而杂交、在存在SNP时不匹配而无法杂交。

另外，报告区域具有在第一靶碱基序列及报告区域杂交时发生消光的荧光色素。报告区域由于具有这样的荧光色素，通过测定其荧光强度，能够简便地进行SNP的检测。作为具有这样特征的荧光色素，可列举出例如QProbe系列(日铁住金环境公司制)。QProbe在进行了杂交时、在与修饰有荧光色素的碱基互补的碱基附件存在鸟嘌呤时，发生荧光共振能量转移，荧光发生消光。作为QProbe所具有的荧光色素，具体而言，可列举出FITC、TMR、6-joe、Bodipy-FL/C6、Bodipy-FL/C3等。通过使用这样的荧光色素，根据报告区域及第一靶碱基序列是否杂交，荧光特性发生变化。因此，本实施方式的探针不需要如使用了具有荧光色素的探针的通常的SNP检测方法那样添加消光剤，在经济上优异。荧光色素优选在报告区域中结合在与接头区域相反一侧的末端。

报告区域的寡核苷酸为由除与第一核苷酸对应的核苷酸以外的与第一靶碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸。与第一核苷酸对应的核苷酸在使用了本实施方式的探针时，优选在存在SNP时发生消光的探针、或者优选在不存在SNP时发生消光的探针，由此能够设定适当使用者。优选在存在SNP时发生消光的探针时，与第一核苷酸对应的核苷酸可以选择与存在SNP时的第一核苷酸互补的核苷酸。另外，优选在不存在SNP时发生消光的探针时，与第一核苷酸对应的核苷酸可以选择与不存在SNP时的第一核苷酸互补的核苷酸。

从进一步提高SNP的检测能力的观点出发，报告区域的寡核苷酸的长度优选为3～6个核苷酸、更优选为3～5个核苷酸、进一步优选为4个核苷酸。另外，从在本实施方式的探针中兼顾良好的与靶核酸的结合性及SNP的检测能力的观点出发，报告区域的寡核苷酸的长度优选比锚固区域的寡核苷酸的长度短。从报告区域与靶核酸杂交、使荧光色素的荧光发生消光的观点出发，优选报告区域的寡核苷酸设计为在距离荧光色素的结合部位为1～3个以内、在第一靶碱基序列中存在鸟嘌呤。

(锚固区域)

锚固区域为无论靶核酸中有无SNP、探针均能够与靶核酸结合的区域。锚固区域具有由与第二靶碱基序列互补的碱基序列构成的寡核苷酸。从获得与第二靶碱基序列良好的结合性的观点出发，锚固区域的寡核苷酸的长度优选为10～20个核苷酸、更优选为12～18个核苷酸、进一步优选为15个核苷酸。

(接头区域)

接头区域为用于使探针的自由度增加的区域。接头区域将报告区域及锚固区域连接。接头区域具有由与靶核酸中的第一靶碱基序列及第二靶碱基序列之间的碱基序列非互补的碱基序列构成的寡核苷酸。

从更为廉价地合成探针的观点出发，接头区域优选不包含通用碱基。作为通用碱基，可列举出除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及鸟嘧啶以外的碱基即通用碱基或其类似物等。作为通用碱基或其类似物，可列举出例如5-硝基吲哚、脱氧核苷、3-硝基吡咯脱氧核苷、4-硝基苯并咪唑脱氧核苷、脱氧水粉蕈素、脱氧肌苷、2’-OMe肌苷、2’-OMe5-硝基吲哚核苷、2’-OMe3-硝基吡咯核苷、2’-F肌苷核苷、2’-F水粉蕈素、2’-F5-硝基吲哚核苷、2’-F4-硝基苯并咪唑核苷、2’-F3-硝基吡咯核苷、PNA-5-硝基吲哚(introindole)、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、亚磷酰胺-5-硝基吲哚、亚磷酰胺-水粉蕈素、亚磷酰胺-肌苷、亚磷酰胺-4-硝基苯并咪唑、亚磷酰胺-3-硝基吡咯、2’-O-甲氧基乙基肌苷、2’-O-甲氧基乙基水粉蕈素、2’-O-甲氧基乙基5-硝基吲哚核苷、2’-O-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑核苷、2’-O-甲氧基乙基3-硝基吡咯核苷、脱氧R_PMP-5-硝基吲哚二聚体2’-OMeR_PMP-5-硝基吲哚二聚体等。

接头区域优选为仅由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、或胸腺嘧啶中的任1种碱基构成的寡核苷酸。由此，接头区域与靶核酸结合的可能性降低，因此报告区域的自由度增加、易于使SNP的检测能力提高。另外，通过使接头区域仅由上述碱基构成，还有能够更为廉价地合成探针的倾向。

另外，接头区域的寡核苷酸的长度优选为3～11个核苷酸、更优选为3～9个核苷酸。通过使接头区域的寡核苷酸的长度在上述范围，与靶核酸结合的锚固区域与报告区域分开一定距离，因此有报告区域的自由度增加、SNP的检测能力提高的倾向。另外，从靶核酸与本实施方式的探针杂交时获得立体结构上的自由度的观点出发，接头区域的寡核苷酸的长度相对于上述的第一靶碱基序列及第二靶碱基序列的间隔(interval)优选为-5～+5个、更优选为-3～+3个。

<使用了探针的单核苷酸多态性的检测方法>

本实施方式的探针由于在检测SNP的报告区域具有荧光色素，因此能够根据其荧光强度检测靶核酸有无SNP。

作为用于检测SNP的方法的一个实施方式，可列举出具备下述工序的方法：将本实施方式的探针及存在SNP的靶核酸混合、制备混合液的工序、对该混合液的荧光强度进行测定的工序、和基于所测定的荧光强度检测靶核酸有无SNP(单核苷酸多态性)的工序。

图1为示意性地表示将本实施方式的探针和靶核酸混合时的两者的状态的图。锚固区域中，探针与靶核酸杂交。并且，报告区域具有与第一靶碱基序列互补的序列即完全匹配时，由于报告区域与第一靶碱基序列杂交，因此荧光色素的荧光发生消光(图1(a))。另一方面，报告区域不具有与第一靶碱基序列互补的序列即不匹配时，由于报告区域与第一靶碱基序列无法杂交，因此荧光色素的荧光持续发光(图1(b))。本实施方式的探针在报告区域不与靶核酸杂交时发出荧光。因此，例如在将第一核苷酸作为不存在SNP时的靶核酸的核苷酸的情况下，将探针及靶核酸混合时，与混合前相比，其混合液的荧光强度减少时，可以判断靶核酸上不存在SNP。另外，同样地，在使第一核苷酸为存在SNP时的靶核酸的核苷酸的情况下，当将探针与靶核酸混合时，与混合前相比其混合液的荧光强度减少时，可以判断靶核酸中存在SNP。根据本实施方式的方法，由于能够在室温(25℃附近)下测定有无SNP，因此能够进行高效的SNP分析。

作为用于检测SNP的方法的另一实施方式，可列举出进行Tm(熔解温度：MeltingTemperature)分析的方法。关于Tm分析，本领域技术人员可以采用通常使用的方法进行。作为Tm分析，可列举出例如下述方法：将探针及靶核酸混合，在使该混合液的温度下降的同时，测定此时混合液的荧光强度。报告区域与第一靶碱基序列不匹配时，与完全匹配时相比，探针及靶核酸的复合物的热稳定性低，因此在更低的温度下测定到报告区域与靶核酸结合、荧光消光。将此时的温度称为消光开始温度。另一方面，报告区域与第一靶碱基序列完全匹配时，与不匹配时相比，探针及靶核酸的复合物热稳定性更强，因此测定到在更高的温度下报告区域与靶核酸结合、荧光消光。因此，例如，在不存在SNP时为了完全匹配而设计报告区域时，测定存在SNP时的靶核酸的消光开始温度，在与该值相比，消光开始温度为高温时，可以判断测定中使用的靶核酸中不存在SNP。

本实施方式的探针由于通过锚固区域与靶核酸杂交，因此可以使用于检测SNP的报告区域的核苷酸的长度非常短。因此，报告区域的特异性增高，即使在室温这样的温度低的条件下，报告区域也不易与不匹配的序列杂交。其结果，不匹配时的室温附近中的混合液的荧光强度与消光开始温度时的荧光强度相比，不会显著地降低。另一方面，报告区域完全匹配时，报告区域在室温附近与靶核酸杂交。因此，完全匹配时的室温附近的混合液的荧光强度与消光开始温度时的荧光强度相比，显著地减少，至约60％以下。因此，例如，在使用了Tm分析的SNP的检测方法中，按照在不存在SNP时完全匹配的方式设计报告区域时，当室温附近的混合液的荧光强度达到消光开始温度时的荧光强度的60％以下时，也可以判断靶核酸中不存在SNP。

本实施方式的SNP的检测方法中，也可以将通过PCR法、LAMP法等方法扩增得到的扩增产物作为靶核酸。

实施例

以下，举出实施例对本发明更具体地进行说明，本发明并不限于这些实施例。以下的实施例中，PM是指完全匹配、MM是指不匹配。

[实施例1：添加接头区域的效果]

对通过使报告区域及锚固区域介由接头区域获得的效果进行验证。检测体系使用Mycobacterium Tuberculosis的检测rpoB基因中的第516号的Asp(GAC)替换为Val(GTC)的错义变异的体系。对长度阶段性改变的SNP-寡DNA或接头型SNP-寡DNA与QProbe结合DNA的杂交导致的荧光值的变化进行分析。由于QProbe结合DNA具有SNP，SNP-寡DNA或接头型SNP-寡DNA使用能够在完全匹配时检测SNP、在不匹配时无法检测SNP的体系。

(材料)

QProbe结合DNA：在具有序列号1的碱基序列的DNA上结合有QProbe-3G(日铁住金环境公司制)的DNA。

SNP-寡DNA：具有序列号2～11中的任一个碱基序列的DNA。

接头型SNP-寡DNA：具有序列号12～21中的任一个碱基序列的DNA。接头使用腺嘌呤。

杂交用缓冲液：50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl₂、0.1％Tween-20。

将SNP-寡DNA及接头型SNP-寡DNA的特征示于表1及2。

表1

表2

(方法)

将10μM QProbe结合DNA 0.1μL、10μM SNP-寡DNA或10μM接头型SNP-寡DNA 3.2μL、及杂交用缓冲液16.7μL混合，每个20μL地分注到8联排试管中，制备样品。将样品用Mx3005PReal-Time PCR System(Agilent Technologies公司制)进行Tm分析，测定从99℃降温至25℃时的荧光强度。降温速度以-2℃/30秒进行。

(结果)

将使用了SNP-寡DNA的结果示于图2。具有6个碱基长度的序列号2及3的SNP-寡DNA在完全匹配/不匹配的任意序列中均未见QProbe的消光(图2(a))。考虑这是由于SNP-寡DNA的Tm值过低，在该测定条件下无法检测SNP-寡DNA与QProbe结合DNA的杂交。另一方面，在为具有9～10个碱基长度的序列号8～11的SNP-寡DNA时，在完全匹配/不匹配的任一序列中均可见QProbe的消光(图2(d)、(e))。考虑这是由于相反地SNP-寡DNA的Tm值高、单碱基替换的差异对QProbe结合DNA与SNP-寡DNA发生杂交的难易性没有影响。使用具有7或8个碱基长度的序列号4～7的SNP-寡DNA时，对于具有完全匹配的序列的SNP-寡DNA，仅QProbe可见消光(图2(b)、(c))。若为这样的探针，则可识别单碱基的差异。但是，该探针在完全匹配时开始消光的温度低至40℃，考虑因实验环境的不同，有可能观察不到消光。

将使用了接头型SNP-寡DNA时的结果示于图3。SNP识别部位为6个碱基以下的通常的寡DNA时，由于Tm值过低，寡DNA不与QProbe结合DNA杂交(图2(a))。另一方面，接头型SNP-寡DNA即使仅具有4个碱基的报告区域，通过具有15个碱基的锚固区域和长度为1个碱基以上的接头区域，也能够不降低SNP识别能力地观察到荧光消光(图3(a)～(e))。

为了更详细地对接头添加的效果进行研究，对因各SNP-寡DNA与QProbe结合DNA的杂交导致的QProbe消光的温度进行分析。将逐渐降低温度时QProbe的荧光强度开始减少的温度、即图2及图3的曲线斜率变为负数的温度作为消光开始温度(图2、3中的箭头)。将该温度整理示于表3。表中，ND是指未检测到、Δ℃是指PM时的消光开始温度和MM时的消光开始温度之差。

表3

SNP-寡DNA中，长度为7或8个碱基时，完全匹配与不匹配时的消光温度差(Δ℃)达到最大，其值为40.05℃。另一方面，接头型SNP-寡DNA中，使接头区域的长度为7个碱基时，消光温度差达到最大，其值为55.72℃。接头型SNP-寡DNA比SNP-寡DNA在完全匹配时在更高的温度下可见开始消光。也就是说，获得了接头型SNP-寡DNA与不具有接头区域的寡DNA相比，低温区域中的SNP的鉴别能力更为优异的结果。考虑这是由锚固区域带来的高的杂交能力的结果。

从实施例1的结果可知，接头型SNP-寡DNA具有高的杂交效率及SNP鉴别能力。

[实施例2：接头区域的研究]

研究当设计QProbe结合探针时，用于将探针与靶核酸杂交的锚固区域的序列及接头区域的长度。

(材料)

QProbe结合DNA：在具有序列号22的碱基序列的DNA上结合有QProbe的DNA。

接头型SNP-寡DNA：其为包含由4个碱基构成的报告区域、和由20个碱基构成的锚固区域的寡DNA，以具有序列号23或24的碱基序列的DNA为基础，具有各种长度的间隔及接头。报告区域为序列号23或24中的第37～40个的碱基序列，锚固区域为从报告区域仅以间隔的碱基数的量位于5’侧的20个碱基。这里所述的间隔是指在具有序列号23或24的碱基序列的DNA中，设定报告区域及锚固区域时从报告区域的5’末端至锚固区域的3’末端的碱基数。接头使用腺嘌呤。

杂交用缓冲液：50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1.5mM MgCl₂、0.1％Tween-20。

(方法)

除了使用各种合成DNA及接头型QProbe结合探针以外，与实施例1中记载的方法同样地进行。

(结果)

使用了QProbe结合DNA及各种接头型SNP-寡DNA时的Tm分析的结果中，筛选25℃下完全匹配及不匹配之间的荧光强度的差异大的寡DNA，将其测定结果整理示于图4。从该结果可知，间隔长度及接头的长度长于0的SNP的鉴别能力优异，但当过长时，鉴别能力也降低。即显示，不是仅设定间隔长度及接头的长度中的单个，而是获得两者的长度的平衡是重要的。其中，对于接头的长度，通过设定-3～+3这样长度的间隔，可知完全匹配/不匹配间的荧光强度的差异变大，SNP的鉴别能力优异。

[实施例3：与使用了接头型QProbe结合探针的合成DNA的杂交]

使用基于实施例2的结果设计的接头型QProbe结合探针，与各种合成DNA进行杂交，研究SNP的鉴别能力。

(材料)

合成DNA：具有序列号23、25、27或29的碱基序列且与接头型QProbe结合探针完全匹配的DNA、或者具有序列号24、26、28或30的碱基序列且与接头型QProbe结合探针不匹配的DNA。

接头型QProbe结合探针：在具有序列号31～34中的任一个碱基序列的核苷酸中结合有QProbe的探针。

杂交用缓冲液：50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.1％Tween-20。

将接头型QProbe结合探针的特征示于表4。表中的序列中，带有下划线的位置对应于在成为对象的合成DNA可加入SNP的碱基。

表4

(方法)

除了使用各种合成DNA及接头型QProbe结合探针以外，与实施例1中记载的方法同样地进行。

(结果)

将试验结果示于图5。全部的接头型QProbe结合探针在25℃附近与所对应的合成DNA完全匹配及不匹配的荧光强度产生显著的差异。特别是，使用了GST A1基因时完全匹配及不匹配的荧光强度的差异大、SNP的鉴别能力高。因此，在之后的实验体系中，使用GST A1基因(图5(b))。

[实施例4：使用了LAMP法的SNP的检测]

分别制作具有短的碱基序列的QProbe结合探针(GST-QP-短)、具有长的碱基序列的QProbe结合探针(GST-QP-长)、具有接头区域的QProbe(GST-QP-接头)，使用LAMP法测定对GST基因的SNP的鉴别能力。

(材料)

模板GST-DNA：具有序列号35的碱基序列的DNA(GST-PM)或具有序列号36的碱基序列的DNA(GST-MM)。

QProbe结合探针：GST-QP-短、GST-QP-长、GST-QP-接头。

LAMP用引物：具有序列号37～40中的任一个碱基序列的引物。

LAMP用Master Mixes：50mM KCl、20mM Tricine(三甲基甘氨酸，pH为8.8)、1.4mMdNTPs、8mM Mg₂SO₄、0.1％Tween-20、0.2μM>

将实施例4中使用的QProbe结合探针的特征示于表5。带有下划线的位置对应于在成为对象的合成DNA中可加入SNP的碱基。

表5

(方法)

将LAMP用Master Mixes 19.75μL和10μM的各种QProbe结合探针0.25μL混合，每个20μL分注到8联排试管中。在8联排试管中添加5.0μL对照用DNA。将序列号35或36的模板DNA在95℃下处理5分钟、使其变性。将经变性的序列号35或36的模板DNA按照达到10⁵cps/test或10³cps/test的方式添加到8联排试管中。使用实时浊度测量器LA-200(Teramecs公司制)，使8联排试管在65℃孵育1小时，进行LAMP法。反应中，对浊度进行实时测定，求出Tt值。Tt值表示各检体达到浊度为0.1的时间(分钟)。

对扩增反应后的LAMP产物使用Mx3005P Real-Time PCR System进行Tm分析，测定从99℃降温至25℃时的荧光强度。降温速度以-2℃/30秒进行。

(结果)

当以GST-PM或GST-MM为模板时，确认到实时浊度测定中的Tt值没有差异(图6)。因此可知，使用了GST-PM及GST-MM的LAMP法的扩增效率没有差异。

将进行Tm分析时的荧光强度的变化示于图7。当使用由4个核苷酸的报告区域构成的GST-QP-短时，与GST-PM及GST-MM双方均不杂交、未见QProbe的消光(图7(b))。另外，当使用不具有接头区域的GST-QP-长时，与GST-PM及GST-MM双方在基本相同的温度下杂交、可见QProbe的消光，因此难以进行SNP分析(图7(c))。另一方面，当使用具有接头区域的GST-QP-接头时，对于GST-PM，在10⁵cps/test、10³cps/test下也观察到明显的消光。另一方面，GST-QP-接头的荧光在以不匹配为模板的GST-MM中与对照用DNA同样地完全不消光(图7(a))。因此，通过使用具有接头区域的QProbe结合探针，对于使用没有接头区域的探针难以检测的LAMP产物，也能够在保持对特定序列的杂交效率的情况下特异性地检测SNP。

[实施例5：使用了PCR法的SNP的检测]

使用具有接头区域的QProbe结合探针，进行使用PCR法的SNP的检测。

(材料)

模板GST-DNA：具有序列号35的碱基序列的DNA(GST-PM)或具有序列号36的碱基序列的DNA(GST-MM)。

QProbe结合探针：GST-QP-短、GST-QP-长、GST-QP-接头。

PCR用引物：具有序列号43或44的碱基序列的引物。

PCR用缓冲液：1×Pwo Super yield Buffer、0.2mM dNTPs、1U Pwo Super yieldpol.、0.5×Gelgreen。

(方法)

将各种PCR用引物0.2μL及PCR用缓冲液14.8μL混合，每个15μL地分注到8联排试管中。向8联排试管中添加5.0μL对照用DNA。按照使序列号35或36的模板DNA达到10³cps/test的方式添加到8联排试管。使用Mx3005P>

(结果)

使用作为荧光插入物的0.5×Gelgreen测定模板DNA的扩增(图8)。其结果可知，利用以GST-PM或GST-MM为模板的PCR法的扩增效率没有差异。

将进行Tm分析时的荧光强度的变化示于图9。在与实施例4同样地使用GST-QP-短时，与GST-PM及GST-MM双方均不杂交、未见QProbe的消光(图9(b))。当使用了不具有接头区域的GST-QP-长时，荧光强度虽然在消光开始温度附近不同，但在室温附近基本没有变化。另外，GST-QP-长与GST-PM及GST-MM双方在基本相同的温度下杂交、可见QProbe的消光(图9(c))。当使用了具有接头区域的GST-QP-接头时，对于GST-PM，观测到明显的消光。与此相对，当使用了GST-QP-接头时，对于以不匹配为模板的GST-MM，与对照用DNA同样地发生消光(图9(a))。因此，通过使用具有接头区域的QProbe结合探针，不仅仅是LAMP法、即使使用PCR法也能够对SNP特异性地进行检测。

序 列 表

<110> 容研化学株式会社

<120> 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法

<130> WP-071

<150> JP2014-257198

<151> 2014-12-19

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 1

acagcgggtt gttctggtc 19

<210> 2

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 2

gaccag 6

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 3

gtccag 6

<210> 4

<211> 7

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 4

gaccaga 7

<210> 5

<211> 7

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 5

gtccaga 7

<210> 6

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 6

gaccagaa 8

<210> 7

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 7

gtccagaa 8

<210> 8

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 8

gaccagaac 9

<210> 9

<211> 9

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 9

gtccagaac 9

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 10

gaccagaaca 10

<210> 11

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 11

gtccagaaca 10

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 12

gaccaagaac aacccgctgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 13

gtccaagaac aacccgctgt 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 14

gaccaaaaga acaacccgct gt 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 15

gtccaaaaga acaacccgct gt 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 16

gaccaaaaaa gaacaacccg ctgt 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

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gtccaaaaaa gaacaacccg ctgt 24

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<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 18

gaccaaaaaa aagaacaacc cgctgt 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 19

gtccaaaaaa aagaacaacc cgctgt 26

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 20

gaccaaaaaa aaaagaacaa cccgctgt 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 21

gtccaaaaaa aaaagaacaa cccgctgt 28

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 22

cattgacctt ctccccacca gcctgcccca tgcagtgacc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 23

ggtcactgca tggggcaggc tggtggggag aaggtcaatg 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 24

ggtcactgca tggggcaggc tggtggggag aaggtcaagg 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 25

tttgtttgta atatactgct ctctcctgat ttggtccagg 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 26

tttgtttgta atatactgct ctctcctgat ttggtccaag 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 27

gggtcaagtt agggaaaagc cactcccaca catttcatgg 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 28

gagtcaagtt agggaaaagc cactcccaca catttcatgg 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 29

gtgcgacaga ttcctacagc caccatctac agaataaaga 40

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 30

gtgtgacaga ttcctacagc caccatctac agaataaaga 40

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 31

cctgaaaaaa aaatcaggag agagcagtat 30

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 32

gtgtgggagt ggcttttccc tttttttttt accc 34

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 33

cattcccccc tccccaccag cctgcccca 29

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 34

tagatggtgg ctgtaggaat aaaaaaaaaa aagcac 36

<210> 35

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 35

ttgccctagt ctttgcatcc aactcatgaa aaaaagcatc tttaaaaagc cagtttctgc 60

tgacttgcaa aaagagcaaa atctaggtga aatgtattgt ttaaactttg attaccaacc 120

ttgaaaagga acatattaac cagtgtcttc tgataagcag atcacttgcc tcatgtctta 180

gaatccagta ggtggcccct tggccatgaa atgtgtggga gtggcttttc cctaacttga 240

cccttctttc agtgggaggg aactattgag aggaacaaag agcttataaa tacattagga 300

cctggaattc ggttgtccag ccacaaaggt gacagcattt aacaaagtaa gtactgatct 360

tataaatctc tctacattgc ctcacaccct cctctctagc ctcctagaaa aatacactaa 420

tatgtgtcct tagcacaaga aaaagtttgt 450

<210> 36

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 36

ttgccctagt ctttgcatcc aactcatgaa aaaaagcatc tttaaaaagc cagtttctgc 60

tgacttgcaa aaagagcaaa atctaggtga aatgtattgt ttaaactttg attaccaacc 120

ttgaaaagga acatattaac cagtgtcttc tgataagcag atcacttgcc tcatgtctta 180

gaatccagta ggtggcccct tggccatgaa atgtgtggga gtggcttttc cctaacttga 240

ctcttctttc agtgggaggg aactattgag aggaacaaag agcttataaa tacattagga 300

cctggaattc ggttgtccag ccacaaaggt gacagcattt aacaaagtaa gtactgatct 360

tataaatctc tctacattgc ctcacaccct cctctctagc ctcctagaaa aatacactaa 420

tatgtgtcct tagcacaaga aaaagtttgt 450

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 37

tcatgtctta gaatccagta gg 22

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 38

gtgaggcaat gtagagaga 19

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 39

agttccctcc cactgaaaga agccttggcc atgaaatgtg 40

<210> 40

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

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acattaggac ctggaattcg gttacttact ttgttaaatg ctgtcac 47

<210> 41

<211> 4

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 41

accc 4

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 42

agtggctttt ccctaacttg accc 24

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 43

ggaacatatt aaccagtgtc ttc 23

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic

<400> 44

accgaattcc aggtccta 18