羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料及其制备方法

摘要

本发明提供一种羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，该复合材料是以银纳米颗粒为核，以包覆银纳米颗粒的多巴胺涂层为内壳，以包覆内壳的羟基磷灰石涂层为外壳的核壳结构纳米复合材料。本发明还提供了上述材料的制备方法：先分别配制C

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种用于骨修复的羟基磷灰石和银的复合材料及其制备方法。

背景技术

骨修复替代手术通常是创伤比较大的手术，康复过程比较长，在手术过程和康复过程难免细菌感染，为了避免预防细菌感染，通常需较长时间地使用一些抗生素来预防细菌感染，降低炎症发生的几率。近几十年来，青霉素、链霉素、甲氧苄啶和四环素等抗生素大大降低了病原性细菌感染疾病的发病率和死亡率，在临床上具有广泛应用。然而，随着抗生素的过度使用和滥用，病原体对抗生素的抗药性不断提高，轻则导致病原体感染疾病久治不愈，降低治疗效果，重则导致患者病情的恶化甚至死亡。随着纳米技术的发展，无机纳米材料由于其优异的物理、化学和生物学性质而被广泛应用于生物医学领域。特别是银纳米颗粒由于具有优良的抗菌性能和广谱的抗菌范围(可抑制革兰氏阳性、阴性细菌、真菌甚至病毒)，可用于替代抗生素，以解决病原体耐药性问题，因此具有广阔的应用前景。裸露于材料表面的银纳米颗粒由于其尺寸小，比表面积大，极易被氧化，从而产生大量的银离子。银纳米颗粒抗菌性能和细胞毒性主要取决于从其符合材料中释放出的银离子的浓度。释放出的银离子不仅对细胞膜造成物理损伤，并且能干扰细胞的ATP产生和DNA复制，从而抑制或杀死细胞。因此银纳米颗粒虽然具有很强的杀菌能力，但由于与人细胞直接接触反应而表现出极强的细胞毒性。另一方面，由于缺乏良好的生物学特性，如生物相容性和血液相容性，限制了银纳米颗粒在生物材料领域的应用。因此对银纳米颗粒进行改性以拓宽其在生物材料领域的应用具有重要意义。

羟基磷灰石(Ca₅(PO₄)₃(OH))是构成人体骨骼的重要成分之一，具有良好的骨传导性，生物活性和生物相容性。羟基磷灰石作为骨修复材料，植入人体后能诱导人体本身的骨骼生长，是目前公认的理想的骨修复替代材料。但羟基磷灰石本身不具有抗菌性能，病人需通过服用抗生素预防病原性细菌感染。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足与现状，提供一种羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，以获得一种具有优良的生物相容性、较低的细胞毒性和持久的抗菌性能的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的生物材料。本发明的第二个目的是提供上述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料的制备方法，以一种简单廉价的方式得到该材料。

针对本发明的上述发明目的，本发明提供的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，该复合材料是以银纳米颗粒为核，以包覆银纳米颗粒的多巴胺层为内壳，以包覆内壳的羟基磷灰石层为外壳的核壳结构纳米复合材料。

本发明提供的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，可通过包括以下工艺步骤的方法来制备：

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9～10mmol/L，pH为7～10的C₄H₁₁NO₃-HCl缓冲溶液；

(2)用去离子水和可溶性钙盐配制浓度为0.1～1mol/L的钙盐溶液；

(3)用去离子水和可溶性磷酸盐配制浓度为0.1～1mol/L的磷酸盐溶液；

(4)将银纳米颗粒均匀分散于C₄H₁₁NO₃-HCl缓冲溶液中，C₄H₁₁NO₃-HCl缓冲溶液的量满足能使银纳米颗粒均匀分散其中，按照至少2mg/mL的浓度加入多巴胺，搅拌至少2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置至少半小时，分离除去液相后用去离子水洗涤，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ分散于钙盐溶液中，钙盐溶液的量满足能使银纳米颗粒Ⅰ均匀分散其中，室温下搅拌12～24小时，使聚多巴胺与钙离子与钙离子充分鳌合，然后静置至少半小时，分离除去液相后用去离子水洗涤至在洗涤后的去离子水中加入磷酸盐溶液后不产生沉淀，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于磷酸盐溶液中，磷酸盐溶液的量满足能使银纳米颗粒Ⅱ均匀分散其中，且满足磷酸盐溶液与步骤(2)钙盐溶液中磷钙(元素)摩尔比为(0.50～0.65):1，用氨水调节pH至9～10，在温度60℃～95℃下至少搅拌反应6～12小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石层，然后至少静置半小时，分离除去液相后用去离子水洗涤，经干燥后得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

在本发明的上述技术方案中，所述可溶性钙盐优先选择硝酸钙或氯化钙。

在本发明的上述技术方案中，所述可溶性磷酸盐为磷酸钾、磷酸钠、磷酸铵、磷酸一氢钾、磷酸一氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢氨和磷酸氢二氨中的一种。

在本发明的上述技术方案中，步骤(2)加入多巴胺时最好按照2～5mg/mL的浓度加入多巴胺。

在本发明的上述技术方案中，步骤(6)中磷酸盐溶液的量满足能使银纳米颗粒Ⅱ均匀分散其中，且满足磷酸盐溶液与步骤(2)钙盐溶液中磷钙(元素)摩尔比为0.6:1。

在本发明的上述技术方案中，步骤(6)中搅拌反应的温度最好控制为75～85℃。

与现有技术相比，本发明具有以下由于效果：

1.本发明提供了中新的用于骨修复替换的生物材料——羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，可以用于医用种植体表面的涂层，可作为骨修复植入材料和抗菌辅料的体外使用等。

2.本发明所述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料中，聚多巴胺涂层可大大提高材料的亲水性、生物相容性以及对革兰氏阳性、阴性细菌的抗菌性，银纳米颗粒经多巴胺和羟基磷灰石改性后可有效地控制银离子释放速度，从而显著地降低材料的细胞毒性，细胞毒性实验中，包裹了羟基磷灰石的银纳米颗粒对应的细胞存活率达92％，而银对应的细胞存活率为61％，并赋予材料持久的抗菌性能和优良的生物相容性，该材料在骨修复替代领域中有重要的应用价值。

3.本发明所述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料制备方法简单，成本低廉。

附图说明

图1为实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料的IR谱图。

图2为实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料的银离子释放曲线。

图3为抑菌实验中实验1和实验2的均匀曲线，其中，(a)为各材料对金黄色葡萄球菌的抑菌曲线，(b)为各材料对大肠杆菌的抑菌曲线。

图4抑菌实验中实验3的抑菌效果照片，其中(a)、(d)的对应的材料为羟基磷灰石，(b)、(e)对应的材料为银纳米颗粒，(c)、(f)的材料为羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料；(a)～(c)对应的细菌为大肠杆菌，(d)～(f)对应的细菌为金黄色葡萄球菌。

图5为实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生的抑菌环；其中，(a)为金黄色葡萄球菌，(b)为大肠杆菌。

图6为本发明所述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料的制备过程示意图。

图7本发明所述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料的TEM图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明所述羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料及其制备方法作进一步说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9mmol/L，pH为8的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和硝酸钙配制浓度为0.5mol/L的硝酸钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸氢二胺配制浓度为0.3mol/L的磷酸氢二胺溶液；

(4)将12mg银纳米颗粒超声分散于240mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入480mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于60mL硝酸钙溶液中，室温下搅拌24小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸氢二胺溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于60mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在80℃下搅拌6小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，其IR谱图见图1。

实施例2

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为10mmol/L，pH为10的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和硝酸钙配制浓度为0.1mol/L的硝酸钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸氢二胺配制浓度为0.1mol/L的磷酸氢二胺溶液；

(4)将120mg银纳米颗粒超声分散于400mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入800mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于500mL硝酸钙溶液中，室温下搅拌12小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸氢二胺溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于300mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在70℃下搅拌11小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

实施例3

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9.5mmol/L，pH为9.5的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和硝酸钙配制浓度为1mol/L的硝酸钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸氢二胺配制浓度为0.6mol/L的磷酸氢二胺溶液；

(4)将12mg银纳米颗粒超声分散于240mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入720mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于60mL硝酸钙溶液中，室温下搅拌24小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸氢二胺溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于60mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在60℃下搅拌8小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

实施例4

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9mmol/L，pH为8的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和硝酸钙配制浓度为1mol/L的硝酸钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸氢二胺配制浓度为1mol/L的磷酸氢二胺溶液；

(4)将120mg银纳米颗粒超声分散于400mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入1216mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于100mL硝酸钙溶液中，室温下搅拌16小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸氢二胺溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于60mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在60℃下搅拌8小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

实施例5

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9.5mmol/L，pH为7.5的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和氯化钙配制浓度为0.5mol/L的氯化钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸钾配制浓度为0.5mol/L的磷酸钾溶液；

(4)将12mg银纳米颗粒超声分散于240mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入480mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于100mL硝酸钙溶液中，室温下搅拌16小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸钾溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于60mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在60℃下搅拌9小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

实施例6

(1)用去离子水配制三羟甲基氨基甲烷浓度为9mmol/L，pH为8的C₄H₁₁NO₃-HCl(Tris-HCl缓冲溶液)缓冲溶液；

(2)用去离子水和氯化钙配制浓度为0.5mol/L的氯化钙溶液；

(3)用去离子水和磷酸氢二胺配制浓度为0.3mol/L的磷酸氢二胺溶液；

(4)将120mg银纳米颗粒超声分散于400mL上述制备的Tris-HCl缓冲溶液中，加入1216mg多巴胺，室温下搅拌2小时，使银纳米颗粒表面包覆一层均匀的聚多巴胺膜，然后静置30分钟，倒掉上层液体，用去离子水洗涤至少3次，得到经多巴胺修饰的银纳米颗粒，记为银纳米颗粒Ⅰ；

(5)将银纳米颗粒Ⅰ均匀分散于200mL氯化钙溶液中，室温下搅拌15小时，静置30分钟，使聚多巴胺与钙离子充分鳌合，待反应结束倒掉上层清液，用去离子水反复洗涤，直到在最后一次洗涤取出的上清液中加入磷酸氢二胺溶液后不产生沉淀为止，倒掉上清液，得到银纳米颗粒Ⅱ；

(6)将银纳米颗粒Ⅱ均匀分散于200mL磷酸氢二胺溶液中，用氨水调节pH至9～10，在80℃下搅拌7小时，使银纳米颗粒Ⅱ表面包覆一层羟基磷灰石涂层，然后静置30分钟，倒掉上层清液，用去离子水洗涤数次后真空干燥，得到羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

银离子释放实验

分别取银纳米颗粒和实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料3mg于25mL的试管中，分别加入15mL pH为7.4的PBS缓冲液，在37℃下培养，每隔24小时从试管中取出3mL上清液，用于用电感耦合等离子体发射光谱仪测量银离子浓度，每次取出上清液后，再补充3mL新鲜的PBS缓冲液。共培养7天，测银离子浓度7次，将测得的测银离子浓度数据绘制成浓度-时间曲线，见图2。图2中符号与材料的对应为：Ag—银纳米颗粒，Ag@pDA@HA—羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料。

从图2可知，羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料可有效的控制银离子释放，银纳米颗粒释放的银离子的浓度大于羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料释放的银离子的浓度，因此本发明提供的材料可实现持久抗菌，同时也能减小细胞毒性。

抑菌实验

实验1：分别取1mg银纳米颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒、实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料于3支无菌试管中，另取一支试管不加任何样品作为空白组，向每支试管中加入10mL液体培养基和100μL金黄色葡萄球菌，设立3组平行实验组。将各组在37℃恒温摇床里培养，每3小时测一次光密度(OD)值。将测得的数据绘制成各材料对金黄色葡萄球菌的抑菌曲线，见图3(a)。

实验2：将金黄色葡萄球替换为大肠杆菌，按照上述相同方法，得到各材料对大肠杆菌的抑菌曲线，见图3(b)。

图3中符号与材料的对应为：Ag—银纳米颗粒，Ag@HA—羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，HA—羟基磷灰石纳米颗粒，Control—空白组。

从图3可知，Ag和Ag@HA均能有效的抑制细菌的生长，而HA对细菌的生长无抑制作用。因此Ag和Ag@HA均具有良好的抑菌效果。

实验3：从实验1和实验2已培养24小时的实验试管中取100μL的菌液于固体培养基中，涂布均匀，在37℃恒温摇床里培养24小时，观察各材料对两种细菌的杀菌效果，见图4。图4中，(a)、(d)的对应的材料为羟基磷灰石，(b)、(e)对应的材料为银纳米颗粒，(c)、(f)的材料为羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料；(a)～(c)对应的细菌为大肠杆菌，(d)～(f)对应的细菌为金黄色葡萄球菌。

从图4可知，培养24小时后，Ag和Ag@HA的杀菌率可达到99.99％，而HA无杀菌作用。说明Ag和Ag@HA均具有良好的抑菌效果。

抑菌环测试

分别取1mg银纳米颗粒、羟基磷灰石纳米颗粒和实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料于滤纸片上，加20μL无菌水使材料在圆形滤纸片上分散均匀，放置24小时，待滤纸片干燥后放在含固体培养基(细菌均匀的涂布在固体培养基上)的平板上。在37℃下培养24小时后观察抑菌环的大小。实验结果如图5所示。

图5中符号与材料的对应为：Ag-NPs—银纳米颗粒，Ag@pDA@HA—羟基磷灰石包覆银纳米颗粒的核壳结构纳米复合材料，HA-NPs—羟基磷灰石纳米颗粒，Control—空白组。

从图5可知，含Ag-NPs和Ag@pDA@HA的滤纸片周围均有明显的抑菌圈，且含Ag-NPs的滤纸片周围的抑菌圈明显大于含Ag@pDA@HA的滤纸片周围的抑菌圈，而含HA-NPs的滤纸片周围却没有明显的抑菌圈。这说明Ag-NPs的杀菌效果好于Ag@pDA@HA，进一步说Ag@pDA@HA能很好的控制银离子释放，有利于材料的持久抗菌。

生物安全性(细胞毒性)评价实验

用含10％胎牛血清培养液的DMEM培养MG63人骨肉瘤细胞。细胞贴壁生长后，更换新鲜的培养基，当细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以10⁴/孔的密度接种在96孔板上并培养24h。然后将培养基更换成含有实施例1制备的羟基磷灰石包覆银纳米颗粒和银纳米颗粒(200μg/ml)的同类培养基，分别作为一个实验组，并设立对照组和空白组，各组均设立六个平行组，再次培养24h。其中，对照组为不加纳米颗粒的同类培养基，空白组为不加纳米颗粒和细胞的同类培养基。

细胞毒性使用CCK-8试剂盒来检测。在450nm波长下通过酶标仪测出各组吸光度。

相对细胞存活率(％)＝(实验组的吸光度值-空白组的吸光度值)/(对照组的吸光度值-空白组的吸光度值)*100％。

实验结果：包裹了羟基磷灰石的银纳米颗粒对应的细胞存活率达92％，而银对应的细胞存活率为61％。