一种选择性TNFR1拮抗肽SN10及其在炎症性肠病中的应用

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体是提供一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin‑SN10，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还提供一种基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG‑SN10，通过mPEG2000的羧基与Hydrostatin‑SN10肽链N‑端天冬氨酸的游离氨基共价连接实现选择性修饰。同时，本发明提供选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin‑SN10和PEG‑SN10在治疗炎症性肠病中的应用，提供了有效的炎症性肠病治疗药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10及其在炎症性肠病中的应用。

背景技术

炎症性肠病(IBD)是一组特发性、慢性、炎症性肠道疾病，具有终生复发倾向，包括两种主要类型：克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，临床表现为反复慢性腹泻、粘液血便、腹痛、腹部包块、肠梗阻、穿孔、体质量减轻等，并有恶变的危险。IBD过去常见于发达国家，是北美和欧洲的常见病，欧洲和北美UC的发病率为10/10⁵～20/10⁵、患病率达100/10⁵～200/10⁵，CD的发病率为5/10⁵～10/10⁵、患病率达50/10⁵～100/10⁵(参见文献：Boirivant>5和1.4/10⁵，且有被低估之虞。目前该病已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因，患者多为青壮年，给社会生产力和个人生活质量带来极大影响，引起了各界的高度重视，但迄今为止尚无有效的方法和药物治疗该病。

TNF-α(肿瘤坏死因子)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，涉及免疫调节、炎症、感染性休克、细胞凋亡和自身免疫等生理和病理过程。TNF-α与类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、哮喘、糖尿病等多种炎症性和自身免疫性疾病有关。研究表明，在活动期溃疡性结肠炎患者中，TNF-α的阳性表达升高，其可作为炎性介质介导结肠粘膜的病理损伤，且TNF-α的升高与病变范围和病变严重程度有关(参见文献：Murch SH,Braegger CP,Walker-SmithJA,MacDonaldTT.Location of tumor necrosis factor alpha byimmunohistochemistry in chronic inflammatory bowel disease[J].Gut,1993,34:1705-1709.)。

当前治疗TNF-α相关疾病的几种单抗类药物能很好的缓解其症状，然而，这类抗TNF-α单抗药物因完全封闭了TNF-α的生物学功能，导致影响机体的免疫自稳、免疫监视功能，给很多患者带来了易发生结核病感染、产生新的自身免疫疾病甚至诱发肿瘤的毒副作用。TNF-α作用于两种受体，TNFR1和TNFR2。随着对疾病发病机制的深入研究，当前更多的研究是把治疗的靶点转向TNFRs。总体上从抗炎角度来说，TNFR1主要传递促炎、凋亡信号，通过选择性地阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能，已成为该类药物研发的热点。目前，尚无专一选择性拮抗TNFR1的IBD治疗药物报道。

中国专利文献CN103030687A中公开了SN1能够治疗与TNF-α相关的疾病，还公开了其能够治疗结肠炎并给出了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型(同本案实施例5)，但是：原公开SN1(22AA)靶点不专一，可以与TNF-α、TNFR1以及TNFR2结合，与TNFR1的结合能力最大，约为32μM；而SN10(10AA)靶点特异，具有选择性，只与TNFR1结合，而不与TNF-α、TNFR2结合；与TNFR1结合能力约为2.8μM，并能竞争性抑制TNFR1与TNF-α的结合。本发明分别通过葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型和噁唑酮诱导的小鼠结肠炎模型，证明SN10具有治疗炎症性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青环海蛇蛇毒来源的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10及其在炎症性肠病中的应用，本发明的另一目的在于提供一种基于mPEG2000(单甲氧基聚乙二醇2000)修饰的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，即PEG-SN10在炎症性肠病中的应用。

本发明人所在课题组(江海龙，中国人民解放军第二军医大学2015年硕士学位论文，海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrostatin-SN1的结构优化和抗炎机制研究)通过将Hydrostatin-SN1(22AA)截短，得到Hydrostatin-SN10(10AA)，利用表面等离子共振技术(SPR)发现其能与TNFR1结合，结合能力约为K_D＝2.8μM，高于Hydrostatin-SN1与TNFR1的结合能力(K_D＝32μM)，然而，是否具有选择性拮抗TNFR1不清楚、是否能竞争性抑制TNFR1与TNF-α的结合不清楚；动物模型结果表明其具有一定的抗炎活性。

本发明的主要技术方案是：对Hydrostatin-SN10进一步研究发现，表面等离子共振技术(SPR)、微量热泳动技术(MST)结果表明：Hydrostatin-SN10靶点特异，能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；且只与TNFR1结合，具有选择性，而不与TNF-α、TNFR2结合，能竞争性抑制TNFR1和TNF-α的相互作用，是一种选择性TNFR1拮抗肽；Hydrostatin-SN10对炎症性肠病动物模型(葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型和噁唑酮(OXZ)诱导的小鼠结肠炎模型)都具有明显的抗炎活性。证明了选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10具有治疗炎症性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)的用途。

制备PEG修饰的PEG-SN10，其中所用的修饰剂mPEG2000(单甲氧基聚乙二醇)的平均分子量为2000，其结构简式为CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-COOH，其中n为聚合度。所述mPEG2000的羧基共价连接至Hydrostatin-SN10肽链N-端天冬氨酸的游离氨基上，形成酰胺键，得到PEG-SN10修饰肽。通过对葡聚糖硫酸钠和噁唑酮诱导的小鼠急性结肠炎模型的抗炎效应研究，证明PEG-SN10能够抑制小鼠结肠组织中炎症因子的表达，有效缓解局部炎症症状和体征，对IBD具有治疗作用。

本发明的第一方面，提供一种选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，其合成方法为：利用固相合成技术合成Hydrostatin-SN10，并以HPLC及MS分析其纯度和分子量，分子量为1250.29道尔顿，等电点为4.39。

本发明的第二方面，提供一种选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第三方面，提供上述的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

优选的，所述的治疗炎症性肠病的药物为：以选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10为唯一的活性成分，或包含选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的药物组合物。

本发明的第四方面，提供一种基于mPEG2000(单甲氧基聚乙二醇2000)修饰的选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10，即PEG-SN10，所述的mPEG2000的羧基共价连接至Hydrostatin-SN10肽链N-端天冬氨酸的游离氨基上。用平均分子量约2000道尔顿的mPEG(单甲氧基聚乙二醇)修饰Hydrostatin-SN10能增加Hydrostatin-SN10的半衰期和稳定性。所述的mPEG2000的结构简式可表示为：CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-COOH，其中所述n为聚合度，n＝35～45，其平均分子量为2000道尔顿。

本发明的第五方面，提供上述的基于mPEG2000修饰的选择性TNFR1拮抗肽PEG-SN10在制备治疗炎症性肠病的药物中的应用。

优选的，所述的治疗炎症性肠病的药物为：以PEG-SN10为唯一的活性成分，或包含PEG-SN10的药物组合物。

优选的，所述的药物组合物和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。所述的药物制剂是片剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂或气雾剂等。

优选的，所述的炎症性肠病包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。

优选的，上述的治疗炎症性肠病的药物选择性拮抗TNFR1。

本发明提供了选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10和PEG-SN10在治疗炎症性肠病中的应用，提供了有效的炎症性肠病治疗药物。

附图说明

图1是Hydrostatin-SN10的HPLC分析结果。

图2是Hydrostatin-SN10的MS分析结果。

图3是采用BIAcore(SPR技术)分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力；其中，A、SN10与TNFR1的相互作用，结合解离常数K_D值约为2.8μM；B、SN10与TNF-α的相互作用，不结合；C、SN10对TNF-α-TNFR1结合的竞争性抑制作用(TNFR1在芯片上)；D、SN10对TNF-α-TNFR1结合的竞争性抑制作用(TNF-α在芯片上)；E、SN10对TNF-α-TNFR2结合的竞争性抑制作用。

图4是采用MST技术分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力；其中，A、SN10与TNFR1的相互作用，结合解离常数KD值约为2.8μM；B、SN10与TNF-α的相互作用，不结合；C、SN10与TNFR2的相互作用，不结合；D、SN10对TNFR1-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNFR1荧光标记)；E、SN10对TNFR1-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNF-α荧光标记)；F、SN10对TNFR2-TNF-α结合的竞争性抑制作用，(TNFR2荧光标记)。

图5是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠体重的影响。

图6是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠疾病活动指数的影响。

图7是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠长度的影响。

图8是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠脾脏指数的影响。

图9是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织中髓过氧化物酶活性的影响。

图10是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠血清中炎症因子表达水平的影响；其中，A、小鼠血清中TNF-α表达情况；B、小鼠血清中IL-6表达情况；C、小鼠血清中IL-1β表达情况；D、小鼠血清中IFN-γ表达情况；E、小鼠血清中IL-10表达情况。

图11是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织病理学损伤的影响，组织切片HE染色光镜图(200倍)。

图12是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织TNF-α表达水平的影响，组织切片光镜图(100倍)。

图13是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对噁唑酮(OXZ)诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠体重的影响。

图14是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠疾病活动指数的影响。

图15是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠长度的影响。

图16是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠脾脏指数的影响。

图17是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织中髓过氧化物酶活性的影响。

图18是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠血清中炎症因子表达水平的影响；其中，A、小鼠血清中TNF-α表达情况；B、小鼠血清中IL-6表达情况；C、小鼠血清中IL-1β表达情况；D、小鼠血清中IFN-γ表达情况；E、小鼠血清中IL-10表达情况。

图19是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织病理学损伤的影响，组织切片HE染色光镜图(200倍)。

图20是Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对OXZ诱导的小鼠急性结肠炎模型中小鼠结肠组织TNF-α表达水平的影响，组织切片光镜图(100倍)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

用实施例1制得的Hydrostatin-SN10进行实施例2-10的实验。以下实施例中所用PEG-SN10，由强耀生物科技有限公司合成，经HPLC检测纯度≥98％。

实施例1：选择性TNFR1拮抗肽Hydrostatin-SN10的合成和检测。

以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SN10，并以HPLC(图1)和MS(图2)分析其纯度及分子量，结果可知其纯度>97％，分子量为1250.29g/mol。

实施例2：BIAcore分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力。

1、running buffer以10μl/min的流速流过CM-5传感芯片中设定的通道，直至达到基线水平。

2、用仪器推荐的buffer活化芯片各通道的表面反应基团。

3、用EP buffer溶解TNFR1和TNFR2冻干粉，按一定的浓度进样，使之包被于芯片表面，再用1mol/L乙醇胺封闭芯片。测定动力学曲线前要对再生条件进行测试，以选择合适的再生条件。

4、当running buffer跑至基线稳定后，将系列浓度的多肽进样，中间浓度的多肽重复进样一次，记录每个浓度的响应值。

如图3所示，Hydrostatin-SN10能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；Hydrostatin-SN10与TNF-α不结合，并能够竞争性抑制TNFR1与TNF-α的相互作用。

实施例3：MST分析Hydrostatin-SN10与TNFR1的结合能力。

1、Hydrostatin-SN10与TNF-α、TNFR1、TNFR2的相互作用：

以1:1稀释比例配制系列梯度浓度的Hydrostatin-SN10，将等体积的荧光标记TNF-α/TNFR1/TNFR2 200nM与Hydrostatin-SN10均匀混合后避光孵育30min，用毛细吸管吸取适量的样品上机检测，观察相对荧光值的时间轨迹和热泳动Thermophoresis的剂量-响应曲线，并通过软件NTAffinityAnalysis v2.0.2拟合计算亲和力K_D值，判断是否有特异性结合趋势。

2、Hydrostatin-SN10对TNF-α与TNFR1/TNFR2结合的竞争性抑制作用：

以1:1稀释比例配制系列梯度浓度的TNF-α，将等体积的荧光标记TNFR1/TNFR2200nM与TNF-α均匀混合后避光孵育30min，用毛细吸管吸取适量的样品上机检测，软件拟合求出阳性对照TNFR1/TNFR2与TNF-α的K_D值；将400nM>D值。比较加入Hydrostatin-SN10前后TNF-α饱和浓度、响应值amplitude及亲和力常数K_D值的变化。

3、Hydrostatin-SN10对TNF-α与TNFR1/TNFR2结合的竞争性抑制作用(方法同2)。

如图4所示，MST实验结果表明，Hydrostatin-SN10靶点特异，能与TNFR1直接相互作用，与TNFR1的结合能力约为2.8μM；且只与TNFR1结合，具有选择性，而不与TNF-α、TNFR2结合，能竞争性抑制TNFR1和TNF-α的相互作用。

实施例4：Hydrostatin-SN10和PEG-SN10在SD大鼠体内的血浆半衰期检测。

采用购自Genzyme公司的ELISA试剂盒，根据产品说明书进行测定。血清样品用肝素化的50μL毛细管从后眶内采集，在处理后的1min、2min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8h收集血液样品。静置2h后，将样品离心，把得到的上清液贮存在-20℃以备检测。

表1

如表1所示，结果表明，PEG修饰后PEG-SN10比Hydrostatin-SN10的血浆半衰期延长。

实施例5：Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎的作用。

具体实施步骤为：选取6-8周龄的Balb/c小鼠随机分为8组，每组包含10只小鼠。

正常组(normal)不做任何处理；模型组(model)小鼠的饮水中加入2.5％(w/v)的DSS(市售，购自MP公司，MW为36,000-50,000)造模7天以诱发结肠炎；另外几组在造模的同时腹腔注射Hydrostatin-SN10肽和PEG-SN10肽(400μg/kg/d)；阴性对照组：随机肽组(400μg/kg/d))；阳性对照组：柳氮磺胺吡啶(SASP，400mg/kg/d)和英夫利昔单抗(IFX，5mg/kg/d)。每日记录各组小鼠体重变化(图5)，可知Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效抑制结肠炎导致的体重下降。按照表2进行疾病活动指数(DAI)评分，结果如图6所示，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10可有效缓解结肠炎小鼠腹泻、便血的症状。于造模七日后，颈椎脱臼处死小鼠，取出小鼠整段结肠及脾脏，发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能显著改善小鼠结肠长度(图7)；测定脾重并计算脾脏指数，发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效抑制结肠炎导致的脾脏变化(图8)；通过检测小鼠结肠组织的髓过氧化物酶(MPO)，发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10可明显降低小鼠病变结肠组织中的MPO活性(图9)；采集小鼠血液后，静置2小时，取上清进行炎症因子检测，发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10干预治疗组的小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量显著降低，而抑炎因子IL-10的显著升高(图10)；取结肠末端组织以10％福尔马林固定，组织切片，HE染色后观察结肠变化，观察发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效抑制DSS导致的结肠病变(图11)；观察小鼠结肠组织切片中的TNF-α表达量，同样验证了Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能减轻小鼠结肠组织的炎症程度(图12)。

表2.DAI评分标准

上述结果表明，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效治疗DSS诱导的结肠炎动物模型。

实施例6：Hydrostatin-SN10和PEG-SN10对噁唑酮诱导的小鼠急性结肠炎的作用。

具体实施步骤为：

噁唑酮诱导的小鼠结肠炎动物模型的建立：选取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠随机分为8组，每组包含10只小鼠。第1天，将小鼠背部皮肤剃毛(1.5cm×1.5cm)，正常组皮肤涂搽0.15mL丙酮/橄榄油溶液(丙酮/橄榄油体积比4:1)，模型组、SN10组阴性对照药和阳性对照药组皮肤涂搽0.15mL 3％(w/v)噁唑酮(溶解于丙酮/橄榄油溶液中)，行皮肤预致敏。第8天，以4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，将3.5F导管从肛门缓慢轻柔地插入小鼠结肠内约4cm，正常组注入0.1mL 50％乙醇，其它各组注入0.1mL 1％(w/v)噁唑酮(溶解于50％乙醇中)，缓慢拔出导管，保持小鼠垂直、头朝下体位60s，以使药液充分留置于肠腔内。灌肠后正常组和模型组小鼠给予0.1mL生理盐水腹腔注射，Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组和随机肽组分别给予0.1mLHydrostatin-SN10、PEG-SN10和随机肽(溶于生理盐水)腹腔注射，剂量均为400ug/kg/d，阳性药组分别给予0.1mL柳氮磺胺吡啶灌胃和英夫利昔单抗(溶于生理盐水)腹腔注射，剂量分别为400mg/kg/d和5mg/kg/d，均连续给药3天。

灌肠后每日观察并记录小鼠的体重变化、大便性状及便血情况。小鼠体重变化如图13所示，结果表明，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10可显著减轻结肠炎小鼠的体重下降。按照表2进行疾病活动指数(DAI)评分，结果如图14所示，Hydrostatin-SN10、PEG-SN10可有效缓解结肠炎小鼠腹泻、便血的症状。

于灌肠后第3天颈椎脱臼法处死小鼠，立即开腹取出结肠及脾脏，测量结肠长度如图15所示，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能显著改善小鼠结肠长度。称重脾脏，计算脾脏指数＝10×脾重(g)/体重(g)，如图16，结果显示Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能明显下调小鼠的脾脏指数。

切取部分病变结肠组织并称重，使用髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测小鼠结肠组织中MPO活性。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，参与调节炎症反应的许多过程，而过高的MPO活性会催化反应生成过量的氧化剂，造成局部氧化应激和氧化性组织损伤。如图17所示，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能有效抑制炎症结肠组织中MPO活性的升高。

如图18所示，取小鼠血清进行炎症因子检测，发现Hydrostatin-SN10和PEG-SN10干预治疗组的小鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ的含量显著降低，而抑炎因子IL-10的显著升高。

以生理盐水冲洗小鼠结肠，取末段结肠组织，于10％福尔马林中浸泡固定，制作组织切片，行HE染色。如图19，模型组结肠组织可见广泛炎性细胞浸润，杯状细胞减少，腺体密度减低，而Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能显著减轻小鼠结肠组织的病理学改变。

如图20所示，Hydrostatin-SN10组和PEG-SN10组小鼠结肠组织切片中TNF-α表达量明显减少，结果表明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能减轻小鼠结肠组织的炎症程度。

以上结果表明，Hydrostatin-SN10和PEG-SN10能够有效治疗恶唑酮诱导的小鼠结肠炎动物模型。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 陆一鸣

<120> 一种选择性TNFR1拮抗肽SN10及其在炎症性肠病中的应用

<130> /

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacgaacaac acctagagac cgaactacac 30

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Glu Gln His Leu Glu Thr Glu Leu His

1 5 10