针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法

摘要

本发明公开了一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，该方法包括以下步骤：蚕卵无需冷藏处理的：家蚕产卵后将蚕卵于20‑30℃静置15‑30h，然后在47～48℃的水中浸渍处理6～10min，将蚕卵取出后用清水逐级洗脱至无味，干燥后催青孵化；蚕卵经过冷藏处理的：蚕卵从冷库中取出，在10‑20℃下保护几个小时，放入47～52℃的水中浸渍处理6～10min，将蚕卵取出后用清水逐级洗脱至无味，干燥后催青孵化。本发明的方法能够灭活97～99％的四元杂交种家蚕微孢子虫病原，对家蚕微粒子病胚种垂直传播的相对防治效果达90～97％，蚕卵孵化率可达93％以上，对家蚕生长发育无不良影响。

说明书

技术领域

本发明属于蚕业生产领域，具体涉及一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法。

背景技术

家蚕微粒子病是蚕业生产中最为严重的一种毁灭性传染性疫病，该病病原为家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)，是微孢子虫Nosema属的典型种。家蚕微孢子虫能够在家蚕中肠、丝腺、肌肉、马氏管等组织中寄生，感染后的家蚕不活泼、发育迟缓，体表出现黑褐色斑点，最终导致家蚕死亡。

家蚕微孢子虫不仅能够通过桑叶食下感染家蚕，也能够通过蚕卵继代传播，因此该病一直备受业界重视，被世界上所有蚕桑生产国列为唯一法定检疫对象。巴斯德创立的母蛾镜检法至今仍是家蚕微粒子病检验的关键技术措施。通过对产卵母蛾抽样，在显微镜下检查微孢子虫，然后根据镜检结果淘汰有毒蚕种。近年来，我国微粒子病发生形势严峻，因超毒被淘汰的蚕种数量居高不下，每年造成的经济损失达数千万元。

目前，我国养蚕生产中推广应用的家蚕品种都是具有杂种优势的四元杂交种，又称普通种，它是由四个家蚕品种通过采取(A×B)×(C×D)的交配方式，即两个家蚕品种先进行二元杂交产生双交原种，然后两个双交种再杂交产生的四元杂交种。在普通种生产过程中，蚕种场主要是通过消毒药物对养蚕场所、用具进行消毒，杀灭环境中的微孢子虫从而避免家蚕感染。此外，广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所研发的“蚕用多菌灵粉”(原名“防微灵”)是目前唯一获得农业部生产批文的微粒子病治疗药物，该药物的应用使家蚕微粒子疫病得到有效控制，稳定了蚕种生产，有效解决了蚕种生产的重大难题。但是，研究发现药物长期使用会对家蚕产生毒副作用，影响蚕种产量和品质。寻找有效、环保、安全的家蚕微粒子病新型防治方法一直是蚕病科学研究的重点和难点。

发明内容

针对当前家蚕微粒子病防治药物使用的缺陷以及四元杂交种在我国占绝对优势的现状，本发明的目的在于提供一种针对家蚕四元杂交种微粒子病胚种垂直传播的防治方法，该方法通过对蚕种进行物理和化学结合处理，实现灭活蚕种中家蚕微孢子虫的目的。本发明的操作简单，成本较低，切实可行，处理后的蚕种能够正常孵化，后代基本实现无微粒子病发生，且对后代无毒副作用，不影响其经济性状。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

蚕卵无需冷藏处理的：家蚕产卵后将蚕卵于20-30℃静置15-30h，然后在47～48℃的水中浸渍处理6～10min，浸渍时应保证蚕卵与水均匀、充分接触；将蚕卵取出后用清水逐级洗脱至无味，干燥后催青孵化；

蚕卵经过冷藏处理的：蚕卵从冷库中取出，在10-20℃下静置几个小时，放入47～52℃的水中浸渍处理6～10min，浸渍时应保证蚕卵与水均匀、充分接触，将蚕卵取出后用清水逐级洗脱至无味，干燥后催青孵化。

所述蚕卵为四元杂交种。

所述的几个小时优选1-3小时。

所述的水，优选含有酸或过氧化氢；

所述的酸是盐酸、硫酸、硝酸或醋酸等；

所述含有盐酸的水，其密度为1.075-1.092g/cm³。

本发明方法靠的是水温杀灭微孢子虫，但对于家蚕四元杂交种，水温和浸渍时间需要摸索和选择。水温低了不足以杀灭微孢子虫，水温过高则对蚕卵的孵化率有影响；浸渍时间亦是如此，时间短不足以杀灭微孢子虫，浸渍久了又对蚕卵的孵化率有影响。本发明对这两个特征的确定付出了创造性的劳动，得到了合适的范围，取得了很好的效果。同时，本发明用稀酸溶液浸渍，有利于解除蚕卵滞育，提高孵化率。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的方法能够灭活97～99％的四元杂交种家蚕微孢子虫病原，对家蚕微粒子病胚种垂直传播的相对防治效果达90～97％。

2、本发明的方法蚕卵孵化率可达93％以上，对家蚕生长发育无不良影响。

附图说明

图1是浸渍温度对非冷藏蚕种孵化率的影响。

图2是浸渍时间对非冷藏蚕种孵化率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，产卵后20h将蚕卵放入47℃、比重为1.075的盐酸溶液中浸渍处理10min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达98％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为7.44％，而对照组发病率高达83.12％，与未处理对照相比，相对防治效果达91％。

相对防治效果的计算公式如下：

相对防治效果(％)＝(100-处理组发病率/对照组发病率)×100

通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达97％。

Real-time PCR实验的要点如下：

把对照组家蚕微孢子虫基因的表达量定义为100，检测各实施例家蚕处理后微孢子虫的相对表达量。

蚕卵浸渍处理后催青。孵化后收集蚁蚕，每100头蚁蚕为一区，按试剂盒说明书操作提取DNA，以家蚕微孢子虫单拷贝基因序列(NBO_934g0002)设计特异性引物(F:5′-ACGAAATCCGATGTCCAAA-3′，

R:5′-GATGCGTACTCTTCCCAAA-3′)，以家蚕actinA1

(F:CTCCCTCGAG-AAGTCCTACGAACT，

R:GGATGCCGCACGATTCCATAC)为内参基因，进行每个样品的PCR扩增，采用2^-△△Ct法进行相对定量分析。

实施例2

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，产卵后20h将蚕卵放入48℃、比重为1.075的盐酸溶液中浸渍处理6min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达96％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为2.65％，而对照组发病率高达82.84％，与未处理对照相比，相对防治效果达97％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达99％。

实施例3

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，产卵后20h将蚕卵放入47.5℃、比重为1.075的盐酸溶液中浸渍处理7min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达99％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为3.70％，而对照组发病率高达83.15％，相对防治效果达96％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达97％。

实施例4

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，产卵后20h将蚕卵放入48℃、比重为1.075的盐酸溶液中浸渍处理7min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达94％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为4.50％，而对照组发病率高达92.86％，与对照组相比，相对防治效果达95％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达98％。

实施例5

在其他操作相同的情况下，对四元杂交种9芙×7湘、7湘×9芙的蚕卵做不同浸渍温度溶液的实验，考察浸渍温度对未冷藏四元杂交种蚕卵孵化率的影响，结果见图1。可以看出，液温超过48℃，蚕卵孵化率显著下降，因此浸渍溶液的温度上限选择48℃。

同时，另外的实验发现，浸酸温度≥47℃对微孢子虫才有灭活效果。因此，浸渍溶液的温度选择47～48℃。

实施例6

在其他操作相同的情况下(浸渍溶液温度47.5℃)，对四元杂交种9芙×7湘、7湘×9芙的蚕卵做不同浸渍时间的实验，考察浸渍时间对未冷藏四元杂交种蚕卵孵化率的影响，结果见图2。可以看出，浸渍时间超过10min，蚕卵孵化率显著下降，因此浸渍时间选择6～10min。

实施例7

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，冷藏保存，将蚕卵从冷库取出在中间温度(15℃)下保护2h，放入47℃、比重为1.092的盐酸溶液中浸渍处理10min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达95％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为4.31％，而对照组发病率高达92.67％，与未处理对照相比，相对防治效果达95％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达97％。

实施例8

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，冷藏保存，将蚕卵从冷库取出在中间温度(15℃)下保护2h，放入52℃、比重为1.092的盐酸溶液中浸渍处理6min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达95％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为3.31％，而对照组发病率高达82.47％，与未处理对照相比，相对防治效果达96％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达98％。

实施例9

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，冷藏保存，将蚕卵从冷库取出在中间温度(15℃)下保护2h，放入50℃、比重为1.092的盐酸溶液中浸渍处理8min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达97％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为3.81％，而对照组发病率高达85.14％，与未处理对照相比，相对防治效果达96％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达99％。

实施例10

一种针对四元杂交种家蚕微粒子病胚种垂直传播的防治方法，包括以下步骤：

“两广二号”四元杂交种，冷藏保存，将蚕卵从冷库取出在中间温度(15℃)下保护2h，放入51℃、比重为1.092的盐酸溶液中浸渍处理7.5min，然后取出洗脱、干燥，催青、孵化。实用孵化率达98％，3龄蚕显微镜检验，发病率仅为4.51％，而对照组发病率高达87.25％，与未处理对照相比，相对防治效果达95％。

另外，通过Real-time PCR对蚁蚕中的家蚕微孢子虫病原进行定量检测，发现病原灭活率达97％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。