一种具有镇咳作用的化合物及其制备和应用

摘要

本发明公开了如式(Ⅰ)所示的一种具有镇咳作用的化合物及其制备和应用。本发明还提供了该化合物的制备方法和用途。本发明化合物来源于云南大百合(Cardiocrinum giganteum var.yunnanense)中提取分离纯化后的化合物，云南大百合主要分布于我国云贵高原地区，易于得到，且提取方便，操作简单，成本低，药效试验证明，本发明化合物具有良好的镇咳活性，为临床提供一种新的用药选择

说明书

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，特别涉及一种镇咳作用的化合物及其制备方法，以及其在制备预防咳嗽或/和镇咳的药物中的应用。

背景技术

咳嗽是人体一种保护性反射动作，可清除呼吸道内病理性分泌物和外界进入呼吸道内的异物，其敏感性增高或功能受损都会对人体造成伤害。咳嗽根据时长不同，可以分为急性咳嗽(病程小于3周)、亚急性咳嗽(病程3～8周)和慢性咳嗽(病程大于8周)。急性咳嗽的常见病因为普通感冒和急性气管-支气管炎；亚急性咳嗽的常见病因为感染后咳嗽、上气道咳嗽综合症和咳嗽变异性哮喘；慢性咳嗽的常见病因为咳嗽变异性哮喘、上气道咳嗽综合症、嗜酸粒细胞性支气管炎和胃食管反流性咳嗽等。钟南山教授(陈如冲、赖克方、刘春丽、罗炜、钟南山.广州地区1087名大学生咳嗽的流行病学调查[J].2006,22(2):123-126.)对广州市1087名大学生咳嗽的流行病学调查研究表明：急性咳嗽的患病率为7.6％，慢性咳嗽的患病率为3.3％。这结果提示，比较大学生，普通社区人群更易接触到环境中的粉尘和有害颗粒，咳嗽患病率更高。然而咳嗽患病率随着年龄的增长逐步提高，咳嗽的危害不容忽视。

而市面上所售的一些镇咳药，一般为可待因、右美沙芬、美敏伪麻溶液和一些含有马兜铃的中成药。最常见的可待因，具有很好的镇咳疗效，用于治疗干扰休息的干咳。但它不良反应如低钾性麻痹、中毒、依赖综合症和尿潴留等众所周知。2013年2月20日，FDA在其官方网站正式发出黑框警告，以警示扁桃体或腺体切除术后的儿童使用可待因的致命风险FDA.Drug Safety Podcast:Safety review update of codeine use in children；newBoxed Warning and Contraindication on use after tonsillectomy and/oradenoidectomy。具有止咳作用的感冒药右美沙芬也存在这样的安全性问题，1997年，美国儿科学会发表申明，认为儿童应该禁用含可待因或右美沙芬的镇咳药No authorslisted.Use of codeine-and dextromethorphan-containing cough remedies inchildren.American Academy of Pediatrics.Committee on Drugs[J].Pediatrics,1997,99(6):918.。美国疾病控制和预防中心(CDC)的一份评估报告称：每年有约7000名儿童因感冒药和咳嗽药而被送入医院急救。而一些含有马兜铃的镇咳中成药，也因为“马兜铃肾病”受到影响。1999-2001年，英国药物安全委员会(CSM)、英国药物监控中心、美国药品与食品管理局(FDA)、澳大利亚药物管理局(TGA)等相继宣布对含马兜铃酸的中草药及其产品实行无限期禁用。

传统草药的植物化学研究表明，其它类型的化合物也具有有益的镇咳活性，并且具有比上述合成化合物少的副作用。云南大百合(Cardiocrinum giganteumvar.yunnanense)为百合科(Liliaceae)大百合属(Cardiocrinum)的多年生草本植物，是大百合在中国的变种，主要分布在我国云南、贵州等地区。具有止咳、平喘和清肺等功效，用于治疗咳嗽、气喘、咯血和肺结核等病症。云南大百合的果实俗称“兜铃子”，可药用，在台湾地区作为马兜铃果实的替代品使用。Ming Li,Ka-Ho Ling,Hilary Lam,Pang-Chui Shaw,etal.2010,Cardiocrinum seeds as a replacement for Aristolochia fruits intreating cough,Journal of Ethnopharmacology,130:429–432.研究表明，在豚鼠的镇咳实验中，发现马兜铃和云南大百合种子均有镇咳作用，云南大百合种子的乙醇溶液对豚鼠有温和的镇咳作用。但是，云南大百合种子的镇咳活性成分尚不明确。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种具有镇咳活性的化合物及其制备方法，及其在制备预防咳嗽或/和镇咳的药物中的应用。

本发明提供了如式(Ⅰ)所示的化合物，

其中，R为烷基或氢。

进一步地，所述烷基为C₁～C₅烷基。

进一步地，所述化合物的结构为CGY-1或CGY-2所示：

一种化合物的制备方法，其特征在于：它包含以下步骤：

(1)将原药材粉碎，用50～95％乙醇溶液超声提取3～4次，过滤除渣，得到原药材提取液；

(2)将提取液减压浓缩为浆状物，得到总提物；

(3)将总提物用水混悬，石油醚萃取，随后用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏除乙酸乙酯后得到提取物；

(4)将提取物用色谱纯溶剂溶解，HPLC分离纯化，最后得到化合物CGY-1、化合物CGY-2。

进一步地，上述制备方法中所述原药材为云南大百合种子。

进一步地，上述制备方法中所述最终产物含有式CGY-1和CGY-2两种结构。

进一步地，上述制备方法中步骤(1)所述的乙醇溶液为乙醇体积分数为50～95％的乙醇溶液。

进一步地，上述制备方法中步骤(1)所述的每次超声时间为1～2h。

进一步地，上述制备方法中：步骤(4)所述的色谱纯溶剂为甲醇或乙腈。

进一步地，上述制备方法中步骤(4)所述制备HPLC分离纯化的流动相条件为乙腈-水溶液，流速为8ml/min，紫外检测波长为254nm。

本发明还提供了所述的化合物在制备预防咳嗽或/和镇咳的药物中的用途。

本发明还提供了一种预防咳嗽或/和镇咳的药物，它是上述化合物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

本发明化合物来源于云南大百合(Cardiocrinum giganteum var.yunnanense)中提取分离纯化后的化合物，云南大百合主要分布于我国云贵高原地区，易于得到，且提取方便，操作简单，成本低，药效试验证明，本发明化合物具有良好的镇咳活性，为临床提供一种新的用药选择。

根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是云南大百合种子乙酸乙酯部位总的LC-MS色谱图；其中，上图是质谱信号，下图是高效液相信号，化合物CGY-1和CGY-2为指标成分。

图2是化合物CGY-1的单晶X-射线衍射结构图。

图3是化合物CGY-1的ESI-MS质谱图。

图4是化合物CGY-2的ESI-MS质谱图。

图5CGY-1和CGY-2对豚鼠咳嗽潜伏期的影响(n＝8，M：溶媒组；P：阳性药盐酸可待因组，12mg/kg；A：CGY-1低剂量组，100mg/kg；B CGY-1高剂量组，200mg/kg；C：CGY-2低剂量组，100mg/kg；D：CGY-2高剂量组，200mg/kg。

图6CGY-1和CGY-2对豚鼠咳嗽次数的影响(n＝8，M：溶媒组；P：阳性药盐酸可待因组，12mg/kg；A：CGY-1低剂量组，100mg/kg；B：CGY-1高剂量组，200mg/kg；C：CGY-2低剂量组，100mg/kg；D：CGY-2高剂量组，200mg/kg。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1 CGY-1和CGY-2的制备方法

(1)提取物的制备

A、将云南大百合种子100g粉碎，用体积百分比为50％的乙醇溶液于室温通过KQ-250DE型超声波机提取3次，每次使用乙醇1000ml，每次时间为2小时，合并三次提取液，过滤除渣，得到云南大百合种子提取液；

B、将提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪进行减压浓缩至恒重，得到黄色浆状物，为云南大百合种子总提物12g；

C、将云南大百合种子总提物用超纯水混悬，100ml石油醚萃取，随后用100ml乙酸乙酯萃取，减压蒸馏除乙酸乙酯后得到提取物1g；

(2)对步骤(1)得到的提取物进行分析

将步骤(1)得到的提取物溶于甲醇，配成1mg/ml的溶液，用HPLC进行反相制备，具体制备条件是：LP-C18Welch Ultimate反相制备柱(21.2mm×250mm,5μm)，紫外检测波长为254nm，流速为8ml/min，梯度系统为：A:水，B:乙腈；0～35min，25％(v/v％)→60％(v/v％)的乙腈溶液；36～50min，60％(v/v％)→100％(v/v％)的乙腈；分别于13.986min，21.211min分钟处收集色谱峰(见图1)。用旋转蒸发仪对收集液进行减压浓缩(N-1100V-W型)，分别得到化合物CGY-1(95mg)和化合物CGY-2(86mg)。化合物1～2可根据波谱数据进行鉴定。

(3)CGY-1和CGY-2的鉴定

CGY-1：黄色柱状结晶(甲醇-水)；香草醛-浓硫酸反应呈黄色；单晶X-射线衍射结构图和ESI-MS质谱图分别见图2和图3，分子式为C₃₁H₂₂O₁₁，HR-ESI-MS>-(calcd>-:569.1084)；UV(MeOH)λ_max:209,267,340nm；IR(KBr):ν_max>-1。¹H>6)和¹³C>6)(δ)：见表1。

CGY-2：淡黄色粉末；香草醛-浓硫酸反应呈黄色；ESI-MS质谱图见图4，分子式为C₃₀H₂₀O₁₁，HR-ESI-MS>-(calcd>-:555.0927)；UV(MeOH)λ_max:209,267,298,340nm；IR(KBr):ν_max>-1。¹H>6)和¹³CNMR(75MHz，DMSO-d₆)(δ)：见表1。

表1：CGY-1和2的¹H>13C>6,J>

实施例2 CGY-1和CGY-2的制备方法

(1)提取物的制备

A、将云南大百合种子100g粉碎，用体积百分比为95％的乙醇溶液于室温通过KQ-250DE型超声波机提取2次，每次使用乙醇1000ml，每次时间为1小时，合并三次提取液，过滤除渣，得到云南大百合种子提取液；

B、将提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪进行减压浓缩至恒重，得到黄色浆状物，为云南大百合种子总提物11g；

C、将云南大百合种子总提物用超纯水混悬，100ml石油醚萃取，随后用100ml乙酸乙酯萃取，减压蒸除乙酸乙酯后得到提取物0.9g；

(2)对步骤(1)得到的提取物进行HPLC分析和HPLC制备，分析和制备条件同实施例1，最后分别得到化合物CGY-1(98mg)和化合物CGY-2(90mg)。对两个化合物的鉴定同实施例1。

实施例3 CGY-1和CGY-2的制备方法

(1)提取物的制备

A、将云南大百合种子100g粉碎，用体积百分比为75％的乙醇溶液于室温通过KQ-250DE型超声波机提取3次，每次使用乙醇1000ml，每次时间为1.5小时，合并三次提取液，过滤除渣，得到云南大百合种子提取液；

B、将提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪进行减压浓缩至恒重，得到黄色浆状物，为云南大百合种子总提物10.5g；

C、将云南大百合种子总提物用超纯水混悬，100ml石油醚萃取，随后用100ml乙酸乙酯萃取，减压蒸除乙酸乙酯后得到提取物0.95g；

(2)对步骤(1)得到的提取物进行HPLC分析和HPLC制备，分析和制备条件同实例1，最后分别得到化合物CGY-1(94mg)和化合物CGY-2(89mg)。对两个化合物的鉴定同实例1。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

实验例1本发明化合物镇咳试验

取体重250–350g的豚鼠，雌雄各半，适应性饲养3～5天，随机分成6组，分别为溶媒组、磷酸可待因组、CGY-1低剂量组、CGY-1高剂量组、CGY-2低剂量组、CGY-2高剂量组。

将动物打标，置于24L的密闭盒子内，恒速通过喷头将0.5M枸橼酸喷入盒内，喷雾10min，观察记录10min内豚鼠的咳嗽次数，咳嗽数在18和30次之间的实验动物被选为后续镇咳实验对象。5天的恢复期后，被选中的48只动物按体重及性别随机分为6组，每组8只，雌雄各半。低剂量与高剂量化合物分别按100mg/kg、200mg/kg的剂量给药；阳性药磷酸可待因按12mg/kg；溶媒组给予蒸馏水。给药体积为1.0ml/100g体重，灌胃给药60分钟后的于0.5M枸橼酸喷雾剂进行诱导咳嗽，然后观察记录10min内豚鼠的咳嗽潜伏期及咳嗽次数。

雾化结束后，用20％乌拉坦按1.5g/kg腹腔给药将实验动物麻醉，并进行腹主动脉采血，血清样本置于冰盒保存；处死动物后，随即进行解剖，进行肺部灌洗液收集，BALF样本置于冰盒；采集支气管和肺组织样本，于福尔马林保存。

数据以均数±标准误(X±SEM)表示，利用SPSS18.0软件进行数据统计分析，两组比较，采用两个样本均数比较的t检验，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

镇咳活性评价结果：

如图5所示，在本试验中，在雾化激发过程中，与溶媒组相比，100和200mg/kg i.g.的CGY-1分别使咳嗽潜伏期延长46.1％和53.8％(P<0.01)。而100和200mg/kg i.g.的CGY-2分别使咳嗽潜伏期延长73.1％和80.8％(P<0.01)。

如图6所示在对咳嗽次数的影响上，与溶媒组相比，100和200mg/kg i.g.的CGY-1分别将咳嗽次数分别减少41.1％和44.6％(P<0.01)。而100和200mg/kg i.g.的CGY-2分别将咳嗽次数分别减少51.8％和66.1％(P<0.01)。

这些结果表明，两个化合物均具有镇咳性质，因此扩大了云南大百合种子的应用范围。本发明首次证明了它们的镇咳作用。由于CGY-1和CGY-2是云南大百合的主要成分，它们的含量高，制备容易。

本发明不受上述实施方案的限制，所述实施方案仅作为实例给出，并可以在由所附权利要求定义的保护范围内以各种方式修改。